PLoS ONE: Phosphatidylinositol 3-kinase medierer Bronchioalveolar Stem Cell Ekspansion i musemodeller af Onkogene K-ras-induceret Lung Cancer

Abstrakt

Baggrund

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald i de vestlige lande. Udvikling af mere effektive NSCLC terapeutika vil kræve belysning af de genetiske og biokemiske grundlag for denne sygdom. Bronchioalveolar stamceller (BASCs) er en formodet cancer stamcellepopulation i musemodeller for onkogene

K-ras

induceret lunge adenocarcinom, en histologisk undertype af NSCLC. Signalerne aktiveres af onkogene K-ras, der medierer BASC ekspansion er ikke blevet fuldt defineret.

Metode /vigtigste resultater

Vi brugte genetiske og farmakologiske metoder til at modulere aktiviteten af ​​phosphatidylinositol 3-kinase ( PI3K), en central formidler af onkogene

K-ras,

i to genetiske musemodeller af lunge adenocarcinom. Onkogen

K-ras

induceret BASC ophobning og tumorvækst blev blokeret ved behandling med et lille molekyle PI3K inhibitor og forbedret ved inaktivering af

phosphatase og tensin homolog slettet fra kromosom 10

, en negativ regulator af PI3K

konklusioner /betydning

Vi konkluderer, at PI3K er en kritisk regulator af BASC ekspansion, støtte behandlingsstrategier at målrette PI3K i NSCLC patienter

Henvisning:.. Yang Y , Iwanaga K, Raso MG, Wislez M, Hanna AE, Wieder ED, et al. (2008) Phosphatidylinositol 3-kinase medierer Bronchioalveolar Stem Cell Ekspansion i musemodeller af oncogen

K-ras

induceret lungekræft. PLoS ONE 3 (5): e2220. doi: 10,1371 /journal.pone.0002220

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, USA

Modtaget: December 27, 2007; Accepteret: 14. april 2008. I Udgivet: 21. maj 2008

Copyright: © 2008 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. R01 CA117965 , R01 CA105155, U01 CA105352

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den førende. årsag til kræft dødsfald i de vestlige lande, og dens forekomst er stigende i Asien. Når den har spredt sig, er der ingen helbredende behandlinger for NSCLC. En bedre forståelse af patogenesen og risikofaktorer for denne sygdom, vil ikke blot bidrage til forbedringer i tidlig opsporing og forebyggelse, men også for udviklingen af ​​mere effektive terapier for det.

Ca. 10% af NSCLC prøver bære aktiverende mutationer i

K-ras

[1]. Den histologiske undertype af NSCLC, der oftest har

K-ras

mutationer er adenocarcinom; 30% af adenocarcinomer har disse mutationer.

K-ras

mutationer er også blevet identificeret i atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH) læsioner, som menes at gå forud for udviklingen af ​​lunge adenocarcinom [2]. En voksende mængde beviser tyder på, at

K-ras

mutationer er vigtige i indledningen af ​​lunge adenocarcinom udvikling. Musemodeller er blevet udviklet, som udtrykker mutant

K-ras

konditionelt, somatisk eller inducerbart [3] – [7]. Disse mus udvikler AAH læsioner hurtigt og med høj penetrans, og en delmængde af disse læsioner videre til adenokarcinomer.

En kandidat lungekræft stamcelle (bronchioalveolar stamcelle eller BASC) er blevet identificeret i murine modeller af

K-ras

induceret lungekræft. BASCs har et specifikt mønster af stamcellemarkør ekspression (Sca-1

POS CD34

POS CD45

neg PECAM

neg), er placeret i terminalen bronkier, og har kapacitet til at forny sig selv og undergår multi-linage differentiering [8]. Disse celler kan være den samme som den variant Clara (eller Clara

V) celler, som er placeret ved siden af ​​klynger af neuroendokrine organer i bronkier og bronkioler. Svarende til BASCs, Clara

V celler er i stand til at genoprette Clara cellepopulation efter naphthalen skade [9]. Efter intranasal installation af adenoviral Cre i Kras

LSL mus, der udvikler lungeadenokarcinom skyldes aktivering af en betinget oncogene

K-ras

allel [5], BASCs hurtigt proliferere forud for udvikling af histologiske abnormaliteter [8]. De BASCs i disse mus indeholder

K-ras

mutationer er identiske med dem, der findes i tumorer [8]. På grundlag af disse oplysninger er BASCs postuleret, at forfædre lungeadenocarcinom i mus. De biokemiske signaler, der initierer en udvidelse af denne cellulære population er ikke blevet fuldt belyst. Denne mangel er vigtigt, eftersom belysning af disse signaler kan føre til bedre behandling for NSCLC patienter.

præmaligne læsioner typisk gennemgå en forbigående udvidelse efterfulgt af programmeret ældning, og kun et mindretal af tidlige læsioner udvikler sig til en fuldt transformeret tilstand. I tilfælde af Ras-afhængige cancer musemodeller, er den programmerede ældning af præmaligne læsioner aktiveret af mitogenaktiveret proteinkinase kinase /ekstracellulært signal-kinase signalering, som inhiberer Ras gennem feedback-enzymsystemer, der involverer forøget ekspression af SPROUTY proteiner, Ras GTPase-aktiverende proteiner, og mitogenaktiveret proteinkinase phosphatase-3 [10]. Den senescens program i præmaligne læsioner kan blokeres af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) aktivering [10], hvilket indikerer, at PI3K er en afgørende faktor for den maligne progression af disse læsioner. Faktisk er PI3K signalering konstitutivt aktiveret i NSCLC celler gennem inaktivering somatiske mutationer i eller epigenetisk inaktivering af,

phosphatase og tensin homolog slettet fra kromosom 10

(

PTEN

), et lipid phosphatase som negativt regulerer PI3K signaleringskaskade [11] – [15]

i denne undersøgelse evalueres vi vigtigheden af ​​PI3K i regulering af ekspansionen af ​​BASCs i to genetiske musemodeller for onkogene

K-Ras-.

induceret lungekræft. De onkogene

K-ras

alleler i disse modeller aktiveres somatisk i én (Kras

LA1) og betinget i den anden (Kras

LSL) (5, 7). Vi fandt øget antal BASCs i disse mus i forhold til dem af vildtype-kuld. BASC ekspansion og ondartet progression i lungen blev svækket ved farmakologisk hæmning af PI3K og forstærket af genetisk inaktivering af

PTEN

. Vi spekulere på grundlag af disse resultater, at farmakologiske strategier til hæmmer PI3K vil være nyttige i forebyggelse og behandling af NSCLC.

Resultater

PX-866 hæmmer lunge tumorigenese i Kras

LA1 mus

Vi postulerede, at PI3K er påkrævet for malign progression i lungekræft og testet denne hypotese ved hjælp Kras

LA1 mus som en model af lunge tumorigenese. Flere uger efter fødslen, Kras

LA1 mus udviser multifokale AAH læsioner, ved 2-3 måneders alderen, smelte sammen til faste eller papillære adenomer, der forstørre og gennemgår histologiske omdannelse til adenokarcinomer af 6-8 måneder [7]. Vi først evalueret ekspressionen af ​​PI3K (p110α og p-isoformer) i lungevæv på forskellige stadier i tumorigenese (AAH, adenom, eller adenocarcinom). Disse PI3K isoformer blev opdaget, og deres overflod steget med ondartet progression (AAH læsioner

versus

adenokarcinomer:

P

= 0,006 for p110α

P

0,001 for p110β) ( Figur 1A).

(A) PI3K-ekspression stiger med malign progression. Repræsentative immunhistokemisk farvning af læsioner i vævet microarray og deres kvantificering i tilstødende søjlediagrammer. Kalibrering bar i nederste højre panel repræsenterer 100 um. Snesevis af blandede (fast /papillær) adenomer er inkluderet i søjlediagrammer, men ikke i PI3K farvning billeder. (B) PI3K er påkrævet for tumorvækst. Mean ændringer i tumor mangfoldigheden og volumen bestemmes af mikro-computertomografi udføres før og efter behandling. (*

P

0,05 i forhold til køretøjet). (C) PX-866 inhiberer PI3K i lungevæv. Western blotting af Ser473-phosphoryleret AKT (P-AKT) og Ser21 /9-phosphoryleret GSK3 (P-GSK3α /β) i hele lunge lysater fra mus (n = 7 i hver behandling kohorte). Positioner af molekylvægtsmarkører er indikeret til venstre. (D) PX-866 nedsætter tumorcelleproliferation. Repræsentative immunhistokemisk farvning af Ser28-phosphoryleret histon H3 (P-H3) i adenomer i vævet microarray (x 20 forstørrelse, områder med positive celler omgivet) og kvantificering af farvning i 16 læsioner fra vehikelbehandlede mus og 4 læsioner fra PX-866 -behandlede mus (søjlediagram, *

P

0,05 i forhold til køretøjet). Indsat illustrerer omkranset celler ved × 40 forstørrelse. Kalibrering søjler repræsenterer 200 um.

Baseret på dens øgede overflod i fuldt transformerede celler, vi næste forsøgt at afgøre, om PI3K var nødvendig for tumorvækst. Behandling af K-ras

LA1 mus med PX-866, en PI3K-inhibitor [16], nedsat Lungelæsionsvolumen og multiplicitet (figur 1B). Dette var ledsaget af reduktioner i PI3K aktivitet som vist ved western blotting af hel-lunge lysater for phosphoryleret AKT og glycogensynthasekinase-3 (figur 1C). Tumorceller undergik en reduktion i proliferation forårsaget af PX-866 baseret på intralæsional phosphoryleret histon H3 (figur 1D), men udviste ingen biokemisk tegn på apoptose som vist ved Western blotting for spaltet caspase-3 og poly (ADP-ribose) polymerase ( data ikke vist). Således behandling med en PI3K antagonist dybt hæmmede væksten af ​​disse tidlige læsioner.

BASCs er meget følsomme over PX-866

in vivo

in vitro

Vi næste afgøres, om den anti-tumor effekt af PX-866 i Kras

LA1 mus skyldtes dels hæmning af BASC ekspansion. Ved terminalen bronkier, en undergruppe af epitelceller udtrykkes både Claracelle specifikt protein (CCSP) og overfladeaktivt protein-C (SPC) (figur 2), som er kendetegnende for BASCs [8]. Kvantificering af dual-positive celler i vildtype mus (med 83 bronkier) og K-ras

LA1 mus (med 66 bronkier) viste, at der ikke vildtype mus havde mere end 3 BASCs pr terminal bronkier, mens en delmængde af terminal bronkier i K-ras

LA1 mus havde 4 til 7 (

P

= 0,042, vildtype

versus

Kras

LA1) (figur 2). Således er en delmængde af terminal bronkier i Kras

LA1 mus havde BASC ekspansion. Desuden afslørede tredobbelt immunofluorescens undersøgelser, at BASCs udtrykte p110α og havde påviselig phosphorylering af AKT (figur 3), en nedstrøms mediator af PI3K, som bevis for PI3K aktivering i disse celler. Brug vævssnit fra Kras

LA1 mus behandlet med PX-866 (med 88 terminal bronkier) eller køretøjet (med 81 terminal bronkier), vi bestemt antal BASCs pr terminal bronkie i behandlingsgrupperne. Køretøjet-behandlede mus havde en delmængde af terminal bronkier med 4 til 7 BASCs pr terminal bronkier, mens ingen af ​​PX-866-behandlede mus havde mere end tre BASCs pr terminal bronkie (

P

= 0,025, køretøj

versus

PX-866-behandlet) (Figur 4).

immunfluorescensfarvning at detektere celler ved terminal bronkier at samtidig udtrykkelig CCSP og produktresumé. Omgivet BASCs i toppaneler (x10 forstørrelse) illustreret i lavere paneler ved højere forstørrelse (x40). Bar graf angiver procentdele af terminal bronkier med de angivne antal BASCs. Kalibrering barer i billeder af H CCSP

Cre /+), udtrykker onkogene

K-ras

( Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+), har

PTEN

mangel og onkogene

K-ras

udtryk (PTEN

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+), eller har hverken (PTEN

flox /flox; CCSP

+ /+). Musene blev aflivet på 4 uger eller 12 uger, og deres lungevæv blev udsat for immunofluorescens undersøgelser for at kvantificere BASCs.

Som forventet triple immunfluorescensfarvning (CCSP /SPC /PTEN) viste tab af PTEN udtryk i BASCs fra mus, der var både

PTEN

deficiente og

K-ras

transformerede (PTEN

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) men ikke i mus, der kun var

K-ras

transformerede (Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) (figur 6). Kvantificering af BASCs pr terminal bronkie på 4 uger viste, at

PTEN

-deficiency alene (PTEN

Δ5 /Δ5; CCSP

Cre /+) ikke var tilstrækkeligt til at ændre BASC numre i forhold til det af kontrol mus (PTEN

flox /flox; CCSP

+ /+) (figur 7). Men sammenligning af BASC numre i PTEN

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+ mus til det i Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+ mus viste, at

PTEN

mangel påfaldende forbedret BASC ekspansion onkogene

K-ras Hotel (

P

= 0,006, PTEN

Δ5 /Δ5, Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+

versus

Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+) (figur 7). Ud over disse resultater på terminalen bronkier, klynger af CCSP

pos SPC

POS celler blev observeret i de bronkioler og små bronkier af PTEN

Δ5 /Δ5; Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+ mus; disse celleklynger var tydelige så tidligt som 4 uger gamle og ikke var til stede i bronkier eller bronkioler af Kras

Lox /+; CCSP

Cre /+ mus (Figur 8). Vi konkluderer, at

PTEN

inaktivering samarbejdet med onkogen

K-ras

at forbedre BASC akkumulation.

Immunfluorescerende farvning af vævssnit at opdage tredobbelt farves (CCSP /SPC /PTEN) celler ved terminal bronkier. BASCs (omkranset) illustreret ved × 10 forstørrelse. Kalibrering bar i nederste højre panel repræsenterer 100 um.

immunfluorescensfarvning at detektere celler ved terminal bronkier, der co-express CCSP og produktresumé. BASCs (omkranset) illustreret ved × 40 forstørrelse. Bar graf angiver procentdele af terminal bronkier med de angivne antal BASCS. Kalibrering bar i nederste højre panel repræsenterer 100 um.

immunfluorescensfarvning at detektere celler, der co-express CCSP og produktresumé. BASCs (omkranset) illustreret ved × 10 forstørrelse. Bar graf illustrerer procentdele af bronkierne med de angivne antal BASCS. Kalibrering bar i nederste højre panel repræsenterer 100 um.

Diskussion

Her er vi rapportere, at PI3K var nødvendig for BASC ekspansion initieret af onkogene

K-ras

og, når konstitutivt aktiveret af

PTEN

inaktivering, PI3K samarbejdet med onkogene

K-ras

i denne proces. Denne konklusion var baseret på resultater fra eksperimenter, der er indarbejdet farmakologiske og genetiske metoder til at målrette PI3K i to forskellige genetiske musemodeller og en

in vitro

model. Vi har tidligere rapporteret, at

PTEN

inaktivering samarbejder med onkogen

K-ras

at accelerere lunge tumorigenese, der forårsager lunge tumorer, der er mere histologisk avancerede og hurtigere hindrer bronkial lumina og erstatte alveolære rum end dem, af mus med onkogen

K-ras

alene [18]. Tilsammen udgør disse resultater hæve den mulighed, at PI3K fremmet lunge tumorigenese gennem dens virkninger på BASCs. Dog vil kræve, afgørende bevis i denne henseende bevis på, at adenocarcinomer opstår fra BASCs. Transplantationsstudier at afgøre, om Basc injektioner er tilstrækkelige til at rekapitulere lungeadenocarcinom udvikling hos mus har hidtil ikke været rapporteret. En stamcelle population er blevet identificeret i lungerne af mus og i tumorer fra NSCLC patienter, der udtrykker CD133, udstillinger stamceller celle egenskaber

in vitro

(former kugler og kan induceres til at undergå terminal differentiering), og er tumorigen i nøgne mus [19]. Selvom visse funktioner i denne stamceller befolkning svarer til dem af BASCs (dvs. respons på naphthalen-induceret lungeskade), forbliver deres forhold til at blive belyst.

Når initieres under embryogenese, betingede

PTEN

inaktivering i lungen fører til hypoxi og perinatal død, hvilket indikerer, at

PTEN

ekspression er nødvendig for normal lunge udvikling [20]. I denne undersøgelse, ska-ekspression i CCSP

Cre mus begyndte på postnatal dag 4, giver os mulighed for at evaluere

PTEN

‘s rolle i at opretholde lungefunktionen efter fødslen. Selvom vi ikke kan udelukke, at subtile ændringer i lungefunktionen indtraf,

PTEN

deficiente mus i denne undersøgelse havde ingen tydelige ændringer i deres lunge struktur og udviste ingen morbiditet på op til 12 måneders alderen, hvilket tyder at efter fødslen, kan lungevæv fungere normalt uden

PTEN

. Denne tilsyneladende modstandskraft lungevæv til

PTEN

mangel står i kontrast til voksne bloddannende stamceller, der er forarmet inden 40 dage efter inaktivering af

PTEN

[21], hvilket indikerer, at selv-fornyelse kapaciteter af hæmatopoietiske stamceller kan ikke opretholdes i fravær af PTEN negative vækst regulatoriske signaler. Skønt årsagerne til denne forskel er ikke klare, kan det være relateret til dels de forholdsvis få tilfælde med hvilken lunge stamceller normalt opdele [9].

PI3K er blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i tumorigenese initieret af onkogene

K-ras

. Kras

LA2 mus, der har en afsmittende i

PIK3CA

mutation, der blokerer interaktionen af ​​PI3K med K-ras udvikler langt færre lungetumorer end at gøre Kras

LA2 mus med vildtype

PIK3CA

[22], hvilket indikerer en vigtig rolle for PI3K som en nedstrøms mediator af K-ras. Der bekræfter dette punkt, fandt vi, at PX-866 behandling hæmmede lunge tumorvækst i Kras

LA1 mus. baseret på andre resultater rapporteret her, betydningen af ​​PI3K i

K-ras

Men induceret lunge tumorigenese kan ikke begrænses til sin rolle som en downstream formidler af K-ras. Først PI3K udtryk steg som Kras

LA1 lungevæv undergik ondartet progression fra AAH til adenocarcinom, tyder på, at PI3K blev aktiveret i disse histologisk avancerede læsioner dels gennem K-ras-uafhængige mekanismer. For det andet, rapporterede resultater her og andre steder [18] viser, at

PTEN

inaktivering forbedret onkogene

K-ras

induceret lunge tumorigenese i mus. Ekstrapolere fra disse resultater, somatiske mutationer i NSCLC celler involverer gener, der regulerer PI3K-afhængige signalering (dvs.

PTEN, EGFr

, og

PIK3CA

, blandt andre [ref. 23]) kan omsætte disse celler i en del ved at samarbejde med onkogen

K-ras

. Den potentielle betydning af sekundære somatiske mutationer i fremme oncogene

K-ras

induceret lunge tumorigenese er illustreret ved de lange latenstider af adenocarcinomer, der opstår i mus gensplejset til at udtrykke mutant

K-ras

, som udvikle lungelæsioner hurtigt og med høj penetrans, men kun en brøkdel af læsionerne fremskridt i adenocarcinomer og kræver flere måneder at gøre det [3] – [7]

Resultater rapporteret her var forskellige fra tidligere er rapporteret i en. anden stamme af mus, der undergår betinget

PTEN

deletion induceret af SPC-drevet Cre-ekspression [20]. I denne rapport,

PTEN

inaktivering var tilstrækkelig til at øge Basc numre og fremkalde lungetumorer, hvilket står i kontrast til resultater, der præsenteres her og andre steder [18], at

PTEN

mangel er ikke tilstrækkelig til at øge Basc numre eller inducere lunge tumorer. Det tidligere rapport også afveg med hensyn til de genetiske begivenheder, der samarbejdede med

PTEN

mangel. I denne undersøgelse,

PTEN

inaktivering accelereret lunge tumorigenese fremkaldt af urethan, et kræftfremkaldende stof, der ofte fremkalder

K-ras

mutationer, men kun 2 af 6 tumorer evaluerede havde

K-ras

mutationer, som åbner mulighed at urethan samarbejder med

PTEN

tab ved at inducere somatiske mutationer af andre end gener

K-ras

. Dette står i kontrast til vores model, hvor de betingede

K-ras

og

PTEN

alleler rekombineres i de samme (CCSP-udtrykkende) celler. Derfor kan de forskellige resultater af disse undersøgelser relateres til sekundære genetiske begivenheder i urethan-behandlede mus eller forskelle i forsøgsdesign, såsom genetiske baggrunde for de mus eller de specifikke promotorelementer kørsel Cre udtryk.

Metoder

Reagenser

Antistoffer købt til disse undersøgelser omfatter kanin anti-p110α (sc-7174), p110β (sc-7175), SPC (sc-13979), gede anti-CC10 (sc -9772) og PTEN (sc-6818) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kanin-anti-total AKT (9272), Ser473-phosphoryleret AKT (9271), Ser21 /9-phosphoryleret GSK3α /β (9331), samlede GSK3 (9332), spaltet caspase-3 (9661), poly (ADP-ribose) polymerase (9542), phosphorylerede-histon H3 (9701), Ser28-phosphoryleret histon H3 (9713P) (cellesignalering Technologies, Danvers, MA) , kanin anti-SPC (WRAB-SPC, Seven Hills Bioreagents, Cincinnati, OH), kanin anti-CCSP (07-623, Upstate Biotechnologies, Lake Placid, NY), FITC-konjugeret anti-Sca-1 (557.405), biotin -konjugeret anti-CD45 (553.771) biotin-konjugeret-CD31 (558.737), PE-konjugeret anti-CD34 (12-0341-33, eBioscience), anti-kanin IgG Alexa Flour 488 (A11008), og anti-gede-IgG Alexa mel 594 (A11058) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Andre købte reagenser omfatter streptavidin-APC (554.067, BD Pharmingen), TSA kits 22 (T20932), 25 (T20935), og 27 (T20937), Avidin /Biotin blokerende kit (00-4303) (Invitrogen), Dispase (354.235, BD Biosciences), collagenase /dispase (10269638001, Roche Biosciences), og 7-aminoactinomycin D (A1310, Invitrogen).

studier Mouse

For at teste, om PI3K fremmer tumor udvikling, 9 K- ras

LA1 mus blev behandlet i 4 uger med 2 mg /kg /d intra-gastrisk PX-866, et lille molekyle hæmmer af PI3K [12], og 12 blev givet køretøj begynder ved 4 måneder, en alder, hvor lunge læsioner (AAH og adenomer) er målbare ved mikro-computertomografi scanninger. Mus blev udsat for disse scanninger i begyndelsen og afslutningen af ​​behandling for at tælle læsioner numre og vurdere ændringer i læsion mængder over tid som tidligere rapporteret [24].

Før indledningen heraf, alle mus undersøgelser blev forelagt for og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Texas-M. D. Anderson Cancer Center. Mus modtog standarder for pleje og blev aflivet i henhold til standarderne fastsat af IACUC. Mus og celler og blev opnået gennem samarbejde med Dr. Tyler Jacks, MIT (Kras

LA1 mus og Kras

LSL mus), Dr. Hong Wu, UCLA (PTEN

FLOX mus), og Dr. Francesco Demayo, Baylor College of Medicine (CCSP

Cre mus).

væv microarrays og immunhistokemiske analyser

Vi udførte immunhistokemisk analyse af PI3K på et væv microarray indeholder AAH (n = 17) faste adenomer (n = 31), blandede faststof /papillære adenomer (n = 36), papillære adenomer (n = 45), og adenocarcinomer (n = 14) for at afgøre, om niveauerne af PI3K ændres under malign progression. Vi analyserede ekspressionen af ​​PI3K isoformer (p110α og p).

I immunhistokemisk farvning blev 4 um paraffinindlejrede sektioner bagt ved 60 ° C i 30 minutter og derefter afkølet til omgivelsestemperatur. Snit blev sekventielt inkuberet i xylen (5 min to gange), 100% ethylalkohol (5 min to gange), 95% ethylalkohol (5 min to gange), og 80% ethylalkohol (5 min). Efter vask med vand, blev sektionerne antigen-hentes ved hjælp citratbuffer (pH 6,0, DAKO) i en damper i 20 minutter og afkølet til omgivelsestemperatur. Snit blev derefter vasket med TBS-T og standset med 3% hydrogenperoxid i TBS i 10 min, blokeret i Avidin /biotin-aktivitet og inkuberet med primært antistof som følger: For p110α og p110β farvning blev snit blokeret med 5% gedeserum i 1 time, inkuberet med primære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur og derefter vasket med TBS-T; for Ser28-phosphoryleret histon H3-farvning blev snit blokeret med 10% gedeserum ved 4 ° C natten over, inkuberet med primært antistof i 30 minutter ved omgivelsestemperatur og vasket med TBS-T. Farvningen blev udviklet under anvendelse af DAB-substrat-system. Negative kontroller omfattede udeladelse af det primære antistof og forinkubering af primært antistof med blokerende peptid. Farvning blev kvantificeret ved en investigator (M.G.R.) blindet som til behandlingsgruppe. Intralæsional ekspression blev scoret baseret på farvningsintensitet og forlængelse som tidligere beskrevet [24].

Påvisning af BASCs i lungevæv Salg

Antigener blev hentet fra muse lungevæv med 0,01 mol /l citrat puffer (pH 6; DakoCytomation, Glostrup, Danmark) i 25 minutter i en dampkoger. Objektglassene blev standset i 1,5% hydrogenperoxid i Tris-bufret saltvand i 10 minutter og blokeret i DAKO serum-frit protein blok (Dako) i 1 time ved omgivelsernes temperatur. Objektglassene blev derefter inkuberet med anti-SPC (sc-7705, Santa Cruz Biotechnology; WRAB-SPC, Seven Hills Bioreagents) og anti-CCSP (07-623, Upstate Biochemicals) antistoffer ved 4 ° C natten over. Immunofluorescens blev udviklet under anvendelse af TSA kits 25 og 22 (Invitrogen) på grundlag af producentens anvisninger. Vi brugte blokerende peptider og udeladt de primære antistoffer som negative kontroller til at bestemme specificitet Immunofarvningen resultater. Immunofluorescens blev visualiseret under anvendelse af et mikroskop med en reflekteret fluorescens-system (Olympus Model IX71SIF-2). Color erhvervelse og baggrundsfluorescens blev optimeret ved hjælp af DPController og DPManager software (Olympus).

BASC isolation og kultur

Musene blev dræbt efter 12 uger, og lungerne blev perfunderet med 10 ml af Hanks balancerede saltopløsning gennem den højre ventrikel, indtil de blev renset for blod. De luftrørene blev injiceret med Dispase (ufortyndet væske, BD Biosciences) efterfulgt af 0,5-1 ml 1% LMP agarose i vand. Lungerne blev anbragt på is, hakket i stykker, inkuberet med 0,001% DNAse (Sigma D-4527) og 2 mg /ml collagenase /dispase (100 mg /ml, Roche) i phosphatpufret saltopløsning ved 37 ° C i 45 min, filtreret (100 um fulgt af 40 um pore-size filter) og centrifugeret. De resulterende pellets blev resuspenderet i 2 ml PF10 (10% føtalt bovint serum i phosphatbufret saltvand), som typisk giver 1-2 millioner totale celler per mus. De røde celler blev lyseret. BASCs blev isoleret ved at sortere i Sca-1

pos CD45

neg PECAM

neg CD34

pos cellepopulation på en tre-laser 13-farve FACS Aria fluorescens-cellesorterer (BD Biosciences) der er i stand til at sortere fire delpopulationer ved et lavt tryk med en maksimal hastighed på 20 millioner celler /time. BASCs udgjorde ca. 0,1% af den samlede sorteret cellepopulation.

ensartethed eller renheden af ​​de sorterede celler blev ikke kontrolleret rutinemæssigt fordi cellerne af interesse ville være blevet forbrugt i processen. Det er sagt, cellerne blev sort-renset til den højest mulige renhed ved gating på størrelse (ved frem og side scatter), med undtagelse af dubletter (ved forward scatter bredde

versus

område og side scatter bredde

versus

område), og isolere celler med markørerne af interesse. Desuden blev ensartetheden af ​​de sorterede cellepopulationer, der anvendes i disse assays reflekteret af reproducerbarheden af ​​vores resultater;