PLoS ONE: Curcumin hæmmer ikke-småcellet lungekræft Cells Metastase gennem Adiponectin /NF-KB /MMP signalvej

Abstrakt

Fedtvæv er nu betragtes som en endokrin organ involveret i metaboliske og inflammatoriske reaktioner. Adiponectin, et 244-aminosyre peptidhormon, er forbundet med insulinresistens og carcinogenese. Curcumin (diferuloylmethane) er den vigtigste curcuminoidet af den populære indiske krydderi, gurkemeje. Curcumin har antitumor virkninger, herunder hæmning af neovaskularisering og regulering af cellecyklus og apoptose. Men virkningerne af adiponectin og curcumin på ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) fortsat uklare. I denne undersøgelse evalueres vi ekspressionen af ​​adiponectin i parrede tumorer og normale lungevæv fra 77 patienter med NSCLC ved hjælp af real-time polymerasekædereaktion, western blotting og immunhistokemi. Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at patienter med lav adiponectin udtryk ratio ( 1) havde signifikant længere overlevelse end dem med høj ekspression ratio ( 1) (

s

= 0,015). Curcumin hæmmede vandrende og invasive evne A549 celler via hæmning af adiponectin udtryk ved at blokere adiponectin receptor 1. Curcumin behandling også hæmmede

in vivo

tumorvækst af A549 celler og adiponectin udtryk. Disse resultater antyder, adiponectin kan være en prognostisk indikator for NSCLC. Virkningen af ​​curcumin i faldende den vandrende og invasive evne A549-celler ved inhibering adiponectin ekspression sandsynligvis medieret gennem NF-KB /MMP pathways. Curcumin kunne være et vigtigt potentiale hjælpestof terapeutisk middel til lungekræft i fremtiden

Henvisning:. Tsai J-R, Liu P-L, Chen Y-H, Chou S-H, Cheng Y-J, Hwang J-J, et al. (2015) Curcumin Hæmmer ikke-småcellet lungekræft Cells Metastase gennem Adiponectin /NF-KB /MMP signalvejen. PLoS ONE 10 (12): e0144462. doi: 10,1371 /journal.pone.0144462

Redaktør: Jeremy J. W. Chen, Institut for Biomedicinsk Institut, TAIWAN

Modtaget: August 18, 2015; Accepteret: November 18, 2015; Udgivet: December 10, 2015

Copyright: © 2015 Tsai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af tilskud NSC 100 – 2320 – B – 037-012 – MY2 fra National Science Council of ROC, Taiwan til Jong-Rung Tsai.. The National Science Council of R.O.C, Taiwan er en regering organisation, der er uden for forfatternes universitet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft stadig den hyppigste årsag til kræft-relateret dødelighed på verdensplan og i Taiwan. Trods store fremskridt i forståelsen af ​​lunge carcinogenese og i nye behandlinger i de seneste årtier, er den samlede 5-års overlevelse er stadig dårlig. Innovativ forskningsindsats skal omdirigeres til at undersøge potentielle markører for prognose, mekanismer lunge carcinogenese og adjuverende behandling.

Fedtvæv er for tiden anses som en endokrin organ, der secernerer adskillige cytokiner (adipokiner) [1], herunder adiponectin og leptin. Adiponectin er et 244-aminosyre-polypeptid, som modulerer mange metaboliske processer, såsom glucose regulering og fedtsyrekatabolisme [2]. Det udøver væsentlig indvirkning på stofskiftet og lipogenese, samt om regulering af menneskelige inflammatoriske reaktioner [3]. Hos voksne er adiponectin koncentrationer omvendt korreleret med kropsfedt procent og insulinresistens [4]. Adiponectin har antidiabetiske, åreforkalkningshæmmende, antiinflammatoriske og antiangiogene egenskaber [5].

rolle adiponectin i carcinogenese er kontroversiel [5]. I fedme-associerede maligne sygdomme, såsom endometriecancer, postmenopausal brystcancer, coloncancer, nyrecancer, og hæmatologiske maligniteter, er adiponectin ekspression positivt korreleret med risiko for malignitet. Endvidere er der rapporteret lave koncentrationer adiponectin i mave- og prostatacancer [6]. Men i ikke-fedme-associerede kræftformer, såsom lungekræft, serum adiponectin er ikke en væsentlig indikator for risiko [7].

adiponectin receptorer 1 og 2 handler direkte på tumorceller ved at binde og aktivere adiponectin receptorer og nedstrøms signalveje [5]. Adiponectin besidder anti-angiogenese og antitumor evne, hvilket udføres gennem caspase-medieret endotelcelle apoptose [8]. Det kan også hæmme liver tumorvækst og metastase ved at undertrykke tumor angiogenese og nedregulering af ROCK /IP10 /matrixmetalloproteinase (MMP) -9 pathway [9].

Men adiponectin er en potentiel markør for prostatacancer progression [ ,,,0],10]. I chondrosarcoma, den medierer migreringen af ​​humane chondrosarcoma celler ved transkriptionel opregulering af alpha2beta1 integrin og aktivering af AdipoR receptor, AMPK, p38, og NF-KB pathways [11]. Ikke desto mindre er dens rolle i lungekræft fortsat uklart [12,13]. Petridou et al. rapporterede, at cirkulerende adiponectin niveauer ikke er korreleret med lungekræft stadier [14]. Udtrykket af adiponectin receptor 1 er en gunstig prognostisk faktor for lungekræft [15].

Curcumin (diferuloylmethane), en naturlig forbindelse, udvundet fra

Curcuma longa

, har været brugt siden oldtiden i Orienten som en helbredende agent for forskellige sygdomme. Curcumin har flere farmakologiske aktiviteter, herunder anti-inflammatorisk [16], antioxidant [16], antimikrobielle [17] og anticancer effekter [18-21]. Dens anticancer effekter manifesterer under celleproliferation, invasion, metastase, apoptose, og angiogenese [22]. For eksempel kan curcumin inducere cellulær apoptose i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [23,24]. Den molekylære basis for dets anticarcinogenic virkning tilskrives dets virkning på flere mål, herunder transkriptionsfaktorer, vækstregulatorer, adhæsionsmolekyler, apoptotiske gener, angiogenese regulatorer, og cellulære signalmolekyler [25]. Selvom curcumin hæmmer lungekræft celle migration og invasion via Rac-1 eller Wnt /B-catenin veje, den reguleringsmekanisme af curcumin i lungekræft fortsat ukendt.

De fleste lungekræft er diagnosticeret på et fremskredent stadium, når behandlingen er relativt ineffektive. Hvordan at øge tiden tilgængelige kemoterapeutiske behandlinger med tillægsbehandling naturmedicin, som kan mindske bivirkninger og toksicitet uden at kompromittere terapeutiske virkning, er blevet en populær metode i de seneste årtier. Curcumin er en sådan potentiel kandidat. Denne undersøgelse udforskede de diagnostiske og prognostiske roller adiponectin i NSCLC. Brug

in vitro

A549 cellekultur og en dyremodel, demonstrerede vi potentielle rolle curcumin til behandling af lungekræft. Den nøjagtige molekylære mekanisme af curcumin ved mediering adiponectin virkning blev også undersøgt. Derfor vil potentiale curcumin som et adjuvans agent i lungekræft behandling også blive undersøgt.

Resultater

Demografiske data og adiponectin udtryk i NSCLC patienter

Af de 77 NSCLC patienter i dette studie, 58 (75%) havde histologisk bekræftet adenocarcinom og 19 (25%) havde pladecellekarcinom. Deres gennemsnitlige alder var 61,6 ± 10,3 år (interval, 36-78 år). Adiponectin ekspression blev ikke korreleret med tumor (T), lymfeknuder (N), og faser. NSCLC patienter med metastase havde signifikant højere adiponectin ekspression forholdet (tabel 1). Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at NSCLC patienter med et lavt adiponectin udtryk forholdet havde en signifikant længere overlevelse end dem med en høj adiponectin udtryk forhold (

s

= 0,015) (figur 1). Multivariate justeret risiko nøgletal er beregnet fra Cox regression med yderligere variabler af køn (mandlige vs kvindelige), metastase, tumor, lymfeknude involvering, og stadier (tabel 2). Den høje adiponectin udtryk gruppe havde en 2,40 gange højere dødelighed risiko (

s

= 0,04) end den lave udtryk gruppen. Vejviser

Expression niveauer af adiponectin, adiponectin receptorer, og MMP i NSCLC patienter

De ekspressionsniveauerne af adiponectin, adiponectin receptorer og MMP af NSCLC patienter blev analyseret (fig 2). Immunhistokemisk farvning og western blotting af lungekræft væv viste øget ekspression af adiponectin og adiponectin receptor 1 i lungekræft væv end i normalt lungevæv (Fig 2A-2C). Alle MMP’er blev også forøget i lungekræft væv end i den normale lungevæv (Fig 2D-2F).

(A) Prøver (lungecancer og de tilsvarende normale hosliggende lungevæv) blev analyseret med antistoffer mod adiponectin , adiponectin receptor 1, og adiponectin receptor 2 ved immunohistokemisk farvning (DAB-farvning og hematoxylin modfarvning). For negative kontroller blev antistoffet erstattet med kontrol-IgG. (B-C) Ekspressionsniveauer af adiponectin, adiponectin receptor 1, og adiponectin receptor 2 i tre par lungekræft og normale væv analyseret ved Western blotting. (D-F) gelatinezymografi blev anvendt til at analysere aktiviteterne i MMP-2 /MMP-9, MMP-1 /MMP-3 og MMP-13 /MMP-14. *

s

0.05 vs. normal lungevæv, med repræsentative data fra tre forskellige patienter med NSCLC. T, tumor; N, normal; ADN, Adiponectin; AdipoR1, adiponectin receptor 1; AdipoR2, adiponectin receptor 2.

Cytotoksisk effekt af curcumin på ekspressionen af ​​adiponectin og adiponectin-receptorer i A549 celler

De A549 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af curcumin. MTT-assayet viste, at curcumin havde en cytotoksisk virkning på A549-cellelinier i koncentrationer 75 pM (Fig 3A). Western blotting viste også, at ekspressionen af ​​adiponectin i A549-celler faldt betydeligt ved en curcumin koncentration på 50 pM (Fig 3B). Proteinet ekspression af adiponectin receptor 1 og adiponectin receptor 2 ændredes ikke med curcumin behandling selv ved høje koncentrationer. Transfektion af A549-celler med adiponectin vektor eller lille interfererende RNA (siRNA) plasmid held øget eller tavshed ekspressionen af ​​adiponectin, som demonstreret ved polymerasekædereaktion (PCR) og western blotting (fig 3C og 3D).

(A) Cellelevedygtighed blev analyseret ved MTT-assayet. Den cytotoksiske virkning af curcumin var indlysende ved koncentrationer 75 uM. (B) Ekspressionsniveauer af adiponectin, adiponectin receptor 1, og adiponectin receptor 2 i A549-celler blev analyseret ved western blotting ved forskellige curcumin koncentrationer. (C-D) Exogenous induktion og lyddæmpning af adiponectin udtryk i A549 celler. Adiponectin mRNA /protein-ekspression i A549 celler steg betydeligt efter eksogen adiponectin udtryk som analyseret ved real-time PCR. Adiponectin udtryk faldt signifikant efter siRNA-medieret adiponectin lyddæmpning. NC-siRNA tjente som en negativ kontrol. Repræsentative billeder af tre uafhængige forsøg. *

s

0,05 versus kontrol. Analyserne blev udført i tre eksemplarer.

Virkninger af curcumin og adiponectin på vandrende og invasive evne A549 celler

Cellulær migration blev analyseret ved sår scratch assay, mens invasiv blev bestemt ved Matrigelcoatede Boyden kammer assay. Sammenlignet med kontrolgruppen, den vandrende og invasive evne A549-celler var signifikant inhiberet med curcumin behandling på en dosis-afhængig måde (

s Restaurant 0,05) (fig 4A og 4B). På den anden side, rekombinant adiponectin forøgede invasive og migreringsevnen af ​​A549-celler på en dosisafhængig måde (

s Restaurant 0,05). (Fig 4C og 4D)

(A) cellulær migration blev bestemt under anvendelse scratch sår assay og analyseret ved anvendelse af Wimasis WimScratch software. Den migreringsevnen af ​​A549-celler blev signifikant inhiberet ved forøgelse curcumin dosering sammenlignet med kontrolgruppen (

s Restaurant 0,05). (B) invasivitet blev bestemt ved Matrigelcoatede Boyden kammer assay. Curcumin faldt betydeligt den invasive evne A549 celler (

s

0,05), når curcumin koncentrationen var 25 uM. (C-D) Anvendelsen af ​​rekombinant adiponectin (rADN) signifikant øget vandrende og invasive evne A549 celler (

s

0,05). Resultaterne af tre uafhængige forsøg er vist; analyserne blev udført i tre eksemplarer.

Regulatory roller adiponectin receptor-1 og adiponectin receptor 2 i migration og invasionsevne af A549 celler

De A549 celler blev transficeret med adiponectin siRNA, adiponectin receptor 1 siRNA, og adiponectin receptor 2 siRNA plasmid. Plasmidtransfektion reduceret signifikant ekspressionsniveauerne af adiponectin, adiponectin receptor 1, og adiponectin receptor 2 i A549-celler, som bekræftet ved Western blotting (Fig 5A-5C). Deaktivering af adiponectin udtryk påvirkede ikke udtryk for både adiponectin receptor 1 og receptor 2, men tavshed udtryk for adiponectin receptor en blokeret effekten af ​​adiponectin, som udvidede vandrende og invasive evne A549 celler. Men silencing ekspressionen af ​​adiponectin receptor 2 ikke modvirke effekten af ​​adiponectin på migration og invasivitet af A549-celler (Fig 5D og 5E).

(A-C) Ekspressionsniveauerne af adiponectin, adiponectin receptor 1, og adiponectin receptor 2 blev analyseret ved western blotting efter transfektion med adiponectin vektor eller nedregulering af siADN, siAdipoR1, og siAdipoR2. (D-E) Den vandrende og invasive evne A549 celler blev hæmmet efter tavshed af adiponectin receptor 1-ekspression ved transfektion med siAdipoR1.

Regulatory veje for curcumin i adiponectin udtryk

de A549 celler blev behandlet med forskellige typer af hæmmere, herunder hæmmere af PI3K /AKT og MAP-kinase veje {PI3K (LY294002, 10 uM), AKT (API-59, 3 uM), og MAPK inhibitorer [PD98059 (10 uM) , SB203580 (10 uM), og SP600125 (10 uM) for ERK, p38-MAPK, og JNK, henholdsvis]}, i 1 time og senere med curcumin (50 uM) i 24 timer. ERK og p38 pathway hæmmere blokeret den inhibitoriske virkning af curcumin på adiponectin ekspression (Fig 6A). Endvidere rekombinant adiponectin øgede ekspression af AKT (Fig 6B). Elektroforetisk mobilitet (EMSA) viste, at adiponectin reguleret NF-KB-ekspression gennem AKT pathway (Fig 6C).

(A) A549-celler blev behandlet med forskellige PI3K /AKT og MAP kinase pathway hæmmere {(PI3K (LY294002; 10 pM), AKT (API-59, 3 uM), MAPK-inhibitorer [PD98059 (10 uM), SB203580 (10 uM), og SP600125 (10 uM) for ERK, p38-MAPK, og JNK, henholdsvis] } i 1 time og senere med curcumin (50 uM) i 24 timer. adiponectin ekspression blev analyseret ved western blotting. (B) AKT-ekspression blev analyseret ved western blotting med forskellige koncentrationer af rekombination adiponectin. (C) aktiviteten af ​​p65 /p50 af A549 celler blev analyseret ved EMSA efter behandling med rekombinant adiponectin eller AKT-inhibitor (API-59, 3 uM). henholdsvis

Co-immuno-fældning (Co-IP) assay

Dette assay viste, at adiponectin bestod af monomer, dimer og multimer (fig 7A). Curcumin og silencing adiponectin transfektion med held faldt ekspressionen af ​​adiponectin monomer og dimer. Curcumin nedsatte også p65-ekspression, som det fremgår af Co-IP og EMSA assays (fig 7B og 7C). Forbedret adiponectin ekspression ved transfektion med adiponectin steg også NF-KB-ekspression. Adiponectin kan translokere til kernen for at binde med nukleare p65.

(A) A549 celler behandlet med curcumin, tavshed, eller transficeret med adiponectin blev lyseret og adiponectin blev co-immunpræcipiteret hjælp adiponectin antistof. Immunoblotting med de angivne antistoffer bekræftet co-udfældning af adiponectin monomer, dimer, og multimer. (B) Co-immunfældning blev udført ved anvendelse af anti-adiponectin og anti-p65-antistoffer. Den p65 eluerer blev separeret på SDS-PAGE og immunblottet med de tilsvarende antistoffer, som viste betydelig associering adiponectin med p65 komponenten. (C) Aktivering af NF-KB ved overekspression eller dæmpning af adiponectin blev bestemt ved EMSA. Adiponectin øgede nukleare translokation af p65 /p50 og NF-KB-aktivering, men tavshed adiponectin udtryk havde den modsatte effekt.

In vivo

in vitro

effekt af adiponectin på MMP-ekspression

Transfektion med adiponectin held øgede ekspressionsniveauer af MMP-2, -9, -1, og -14 i A549-celler. Men ekspressionen af ​​MMP-3 og -13 ikke ændre sig med forstærkede eller tavshed adiponectin ekspression (Fig 8).

gelatinezymografi blev anvendt til analyserede aktiviteter MMP-2 /MMP-9, MMP- 1 /MMP-3 og MMP-13 /MMP-14. (A-F) aktiviteter MMP-9, -1, og -14 blev forøget efter overekspression af adiponectin og faldt med undertrykkelse af adiponectin. Ekspression af MMP-3 og -13 ændredes ikke, uanset adiponectin augmentation eller dæmpning.

In vivo

effekt af curcumin på tumorvækst og udtryk af adiponectin og MMP’er

Curcumin behandling faldt betydeligt

in vivo

tumorvækst og adiponectin udtryk sammenlignet med kontrolgruppen (DMSO) (

s

0,05) (fig 9A og 9B), men den ekspression af både adiponectin receptor 1 og receptor 2 ændrede ikke (fig 9C). Curcumin behandling også signifikant reducerede niveauer af alle MMP’er med undtagelse MMP-1, som forblev upåvirket, sammenlignet med kontrolgruppen (fig 9D-9F).

(A) tumoren størrelser af curcumin-behandlede mus var faldt betydeligt sammenlignet med de for kontrolgruppen efter 14 dage. (B) Tumor adiponectin ekspression af curcumin-behandlede mus faldt betydeligt sammenlignet med den for kontrolgruppen. (C) Ekspression af både adiponectin receptor 1 og receptor 2 i curcumin-behandlede mus ikke ændre

in vivo

. (D-F) Expression niveauer af MMP-2, -9, -3, -13, og -14 blev reduceret med curcumin behandling

in vivo

. MMP-1-ekspression blev ikke ændret.

Diskussion

Kemoterapi er stadig den primære behandling for fremskreden lungecancer [26], selv om målrettet terapi er mere populær. Alvorlige bivirkninger af kemoterapi normalt begrænse deres kliniske anvendelse. Derfor er klinikere i stigende grad interesseret i urtemedicin, da de seneste årtier på grund af dets sikkerhed og effektivitet som en adjuverende behandling. Curcumin, en phenolisk forbindelse afledt fra planten

Curcuma longa

, er blevet brugt i århundreder for dens anti-inflammatoriske, kemoforebyggende og potentielle kemoterapeutiske egenskaber. Indtil dato, viser aktuel dokumentation for, at curcumin kan blokere kræft celleproliferation, transformation, og invasion [27]. Denne undersøgelse viste, at curcumin kan inhibere vandrende og invasive kapacitet A549-celler

in vitro

på en dosis-afhængig måde. Desuden curcumin også faldet betydeligt

in vivo

tumorvækst.

Tumor invasion og metastase er en kompliceret flertrins proces, der involverer vedhæftning, nedbrydning af den omgivende matrix, migration, spredning, og angiogenese [ ,,,0],28]. Curcumin besidder højt naturligt antimetastatisk evne. Det kan formindske invasion af B16F-10 melanomceller ved at inhibere ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 og forbedre ekspressionen af ​​antimetastatiske proteiner (E-cadherin og væv inhibitorer af MMP-2) [29,30]. I en xenograft tumor model af prostata- eller brystcancer, curcumin viste også høj antimetastatisk virkning ved undertrykkelse af ekspressionen af ​​MMP-9, NF-KB, og cyclooxygenase-2 [31,32]. I denne undersøgelse kan curcumin inhibere migration og invasion af A549 på en dosis-afhængig måde

in vitro

. I vores xenograft model med A549, kan curcumin falde markant tumorvækst og har en lignende undertrykkende effekt af ekspressionen af ​​MMP’er med undtagelse af MMP-1 og -13.

Fedtvæv betragtes som en endokrin system, der kan udskiller en masse hormoner og cytokiner, der er kendt som adipocytokines [33]. Adiponectin repræsenterer den mest rigelige fedtvæv protein med insulin-sensibiliserende, anti-inflammatorisk og anti-atherogene egenskaber [34,35]. Desuden kan adiponectin spille en rolle i udviklingen og progressionen af ​​forskellige typer af maligniteter [35]. Serum adiponectin niveau er omvendt forbundet med risiko for fedme-relaterede maligniteter, herunder bryst-, endometrie- og prostatakræft, men det er positivt korreleret med gastrisk cancer og leukæmi [35].

Men den prognostiske rolle af kredsløbssygdomme adiponectin i lungekræft er stadig kontroversiel [12,14]. I denne rapport, er adiponectin udtryk ikke korrelerer til lungekræft TN og stadier. Lungekræftpatienter med lav adiponectin udtryk forholdet viste længere overlevelsestid end dem med høj ekspression. Således kan adiponectin ekspression være en prognostisk faktor NSCLC.

I denne undersøgelse har vi også vist, at NSCLC patienter med metastase har signifikant højere adiponectin ekspression forhold end dem uden metastaser. Overekspressionen af ​​adiponectin ved transfektion kan øge den invasive og metastatiske evne A549-celler, måske gennem aktiveringen af ​​MMP’er (1, 9, 14). Adiponectin kan hæmme kolon [36,37] og lever [37] kræft cellemigration men fremmer prostatisk og endometrisk carcinoma vækst. Derfor rolle adiponectin i carcinogenese er variabel i forskellige cancer celletyper

Indtil videre er blevet identificeret tre typer af adiponectin receptorer:. De to vigtigste receptorer AdipoR1 og AdipoR2 og en receptor ligner cadherin familien. AdipoR1 og AdipoR2 er syv trans-membran proteiner, der kan mediere fedtsyre oxidation og glukose optagelse via adiponectin binding. Funktionelle adiponectin receptorer udtrykkes normalt i lungeepitelceller. Brug af immunhistokemisk farvning, Jamshid et al. viste, at ekspressionen af ​​AdipoR1 og AdipoR2 er lavere i NSCLC væv end i normalt lungevæv. Her demonstrerede vi en øget AdipoR1 proteinekspression og immunhistokemisk farvning i NSCLC væv. Tavshed AdipoR1 udtryk kan blokere effekten af ​​adiponectin på migration og invasionsevne af A549 celler. Blokering af AdipoR2 udtryk påvirkede ikke den vandrende evne A549 celler.

Curcumin er blevet en effektiv adjuverende middel i behandlingen af ​​kræft, da det kan modulere aktiviteten af ​​flere transkriptionsfaktorer og deres signalveje [38]. Det kan inducere cellulær apoptose gennem aktivering af p38 pathway i lungekræft og ovarietumor [39]. Men fortsat uklart, den regulerende rolle af curcumin i adiponectin udtryk. Vi viste, at curcumin hæmmer adiponectin udtryk gennem p38 og ERK veje. Desuden kan adiponectin inducere aktiveringen af ​​AKT pathway, som også er involveret i aktiveringen af ​​NF-KB-vejen i lungekræft.

Som konklusion kan adiponectin være en hidtil ukendt potentiel prognostisk markør for NSCLC. Undtagen for klassisk kemoterapi,

in vivo

in vitro

resultater bekræfter, at curcumin kan anvendes som en adjuvans middel i lungekræft behandling i fremtiden. den dårlige absorption, metabolisme og biotilgængeligheden af ​​curcumin, kan dog begrænse den kliniske anvendelse. Flere formuleringer er der udarbejdet omfatter nanopartikler, liposomer, miceller og phospholipid komplekser, som kan øge biotilgængeligheden og fremme længere omsætning, bedre permeabilitet, og modstand mod metaboliske processer curcumin [40].

Materialer og metoder

Tumor prøvetagning

NSCLC og tilsvarende normale væv blev indsamlet fra 77 patienter, som gennemgik kirurgisk resektion mellem 2004 og 2011 på afdelingen for Thoracic Surgery, Institut for Kirurgi, Kaohsiung Medical University Hospital. Vævsprøverne blev straks anbragt i flydende nitrogen til forsendelse til laboratoriet og derefter opbevaret i -80 ° C frysere indtil RNA-isolering og protein ekstraktion. Komplette mellemstationer procedurer, herunder bryst radiografi, bronkoskopi, computertomografi af hjernen og brysthulen, sonografi, og knogle-scintigrafi, blev udført præcist at afgøre tumor egenskaber ifølge TNM International Staging System for lungekræft [41]. Alle patienter blev fulgt op indtil marts 2012. Nærmere oplysninger om deres demografiske og overlevelsesdata blev opdateret.

Etik erklæring

koahsiung medicinske universitet hospitalets Institutional Review Board for forskning godkendte forsøgsprotokollen (KMUH -IRB-990.357). Alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke.

RNA ekstraktion og real-time PCR

Total RNA blev isoleret fra frosne lunge tumorvæv af NSCLC patienter og tilsvarende normale tilstødende lungevæv. RNA isoleret fra normalt lungevæv, lunge tumorvæv, og lungecancerceller blev analyseret under anvendelse realtids-PCR, som blev udført som tidligere [42] beskrevne. Følgende primere til real-time PCR blev designet ved hjælp af Primer Express-softwaren (RealQuant, Roche, Mannheim, Tyskland) ved hjælp af publicerede sekvenser: menneskelig adiponectin fornuft primer: 5′-GGT GAT GGC AGA GAT GGC AC-3 ‘og adiponectin antisense-primer : 5’GCC TTG TCC TTC TTG AAG AG-3 ‘og menneskelig GAPDH sense primer: 5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′ og GAPDH antisense primer: 5’-GCC CAA TAC GAC CAA ATC C-3 ‘ .

Fluorescens data blev erhvervet i slutningen af ​​forlængelsen. Smelt analyse blev udført for alle produkter for at bestemme specificitet forstærkning. Desuden blev PCR produkterne elektroforeret på 1% agarosegeler at bekræfte tilstedeværelsen af ​​korrekte båndstørrelser. Den relative ekspression blev beregnet som et forhold mellem ekspression i lungen cancervæv sammenlignet med ekspressionen i normale tilstødende væv (tumor læsion /normalt væv 1, høj ekspression, og 1, lav ekspression) [42-44 ].

immunhistokemisk farvede

tumorprøver blev dissekeret fra humant lungevæv, fikseret i 4% bufret formalinopløsning natten over, indlejret i paraffin og skæres i 5-um tykkelse sektioner. De paraffinsnit blev de-paraffinized med xylen og farvet med anti-humant adiponectin (GeneTex, Irvine, CA, USA), adiponectin receptor 1 (AdipoR1), og adiponectin receptor 2 (AdipoR2) (Santa Cruz, CA, USA). Efter vask med phosphatbufret saltvand (PBS), blev sektionerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. For farvereaktioner, blev diaminobenzidin (DAB), der anvendes, og modfarvet med hæmatoxylin. For negative kontroller blev antistoffet erstattet med kontrol-IgG.

Western blotting

Western blotting blev udført som beskrevet tidligere [42], hvorefter membranerne blev behandlet med PBS indeholdende 0,05% Tween 20 og 2% skummetmælk i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet separat med muse-anti-humant adiponectin (GeneTex, Irvine, CA, USA), AdipoR1, AdipoR2, p65, p50, MMP’er (2, 9, 1, 3, 13, 14) (Santa Cruz, CA, USA), histon H1, AKT /Pakt, P38 /pP38 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), og β-actin (Abcam, Cambridge, MA, USA) i 1 time. Efter vask blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret kanin anti-ged eller mus IgG ved stuetemperatur. Immunodetektion blev udført under anvendelse af kemiluminescens-reagens plus NEN og eksponering for Biomax MR film (Kodak, Rochester, NY, USA).

Dyrkning af NSCLC-celler

lungeadenocarcinom A549-celler (ATCC CCL-185) blev dyrket i kolber indeholdende F12K vækstmedium suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2.

Silencing ekspressionen af ​​adiponectin, adiponectin receptor 1, og adiponectin receptor 2 i A549-celler Salg

siRNA, en specifik dobbeltstrenget 21-nukleotid RNA-sekvens homolog med målgenet, var bruges til at lukke munden udtryk for AdipoR1, og AdipoR2. Humant adiponectin siRNA sense primer: 5′-GUG UGG GAU UGG AGA CUU ATT-3 ‘og antisense-primer: 5′- UAA GUC UCC AAU CCC ACA CTT’-3 (Santa Cruz, CA); human AdipoR1 siRNA sense primer: 5′-GGA CAA CGA CUA UCU GCU ACA-3 ‘og antisense-primer: 5′-UCU AGC AGA UAG UCG UUG UCC-3′; og AdipoR2 siRNA sense primer: 5’-GGA GUU UCG UUU CAU GAU CGG-3 ‘og antisense primer: 5′-CCG AUC august AAA CGA AAC UCC-3’. blev anvendt (Sigma-Aldrich, Singapore)

lyddæmpning effekt af siRNA transfektion blev vurderet ved real-time PCR og immunoblotting. Kort fortalt blev cellerne dyrket i en plade med seks og transient transficeret med 20 nM siRNA hjælp 8 pi siPORT Amine (Ambion, Austin, TX, USA) til et samlet transfektion volumen på 0,5 ml. Efter inkubation ved 37 ° C under 5% CO2 i 5 timer, 1,5 ml af den normale vækstmedium blev tilsat

, og cellerne blev inkuberet i 48 timer.

MTT assay for cellelevedygtighed

blev udført MTT-assays som tidligere beskrevet [42].

In vitro

migration /invasion analyser

migreringsevnen af ​​cellerne blev analyseret i en monolag blotlægning assay som tidligere beskrevet [42]. De sammenflydende celler blev såret ved skrabning med en 100-pi pipettespids, der blottede en strimmel af monolaget, der var 300 um i diameter. Vi vaskede kulturen to gange med PBS og tilsat 5% FBS som et medium. Efter 24 timer, vil celler migreret ind i det blottede område og blev fotograferet. De områder blev analyseret ved anvendelse af Wimasis WimScratch software, en ny generation webbaseret billede værktøj til cellemigrering analyse. Edge detection teknikker kan nemt genkende den forreste kant og kløften området. Brugere kan uploade billeder og analyse starter automatisk.

Cellular invasion blev kvantificeret ved hjælp af en modificeret Matrigel Boyden kammer assay. Den BioCoat Matrigel invasion kammer (BD Biosciences, Bedford, MA) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Celler (4 × 10

4) i serumfrie medier blev podet på Matrigelcoatede filtre. I de nedre kamre blev 5% FBS tilføjet som en kemoattraktant. Efter inkubation i 24 timer blev membranen vasket kortvarigt med PBS og fikseret med 4% paraformaldehyd. Den øvre side af membranen blev udslettet forsigtigt med et stykke vat. Membranen blev derefter farvet under anvendelse af hæmatoxylin og fjernes. Statistisk signifikans blev sat til

s