PLoS ONE: RB1CC1 Aktiverer RB1 Pathway og hæmmer spredning og Cologenic overlevelse i Human Cancer

Abstrakt

RB1 ​​

-inducerbare coiled-coil 1 (RB1CC1, også kendt som FIP200) spiller en rolle i forbedring af RB1 vej gennem den direkte binding til en GC-rige region 201 bp opstrøms (fra indledningen ATG) i

RB1 ​​

promotor. Her identificerede vi hSNF5 og p53 som de bindende partnere RB1CC1 ved immunopræcipitation og immunofluorescens assays. Interaktion mellem disse molekyler og RB1 pathway blev analyseret ved assayene ifølge kromatin immunoprecipitation, luciferase-reporter, revers transkription-polymerasekædereaktion og immunoblot. Tumorvæksten undertrykkelse af RB1CC1 blev vurderet ved flowcytometri eller ved en cellevækst assay. Det nukleare RB1CC1 kompleks involverer hSNF5 og /eller p53 aktiveret transskription af

RB1 ​​

,

p16

p21

, og undertrykt tumorcellevækst. Desuden nuklear RB1CC1 udtryk signifikant korreleret med de RB1 og p16 i brystkræft væv

in vivo

, og Ki-67 spredning indekset var afhængig af p53 samt RB1CC1. Nærværende undersøgelse viser, at RB1CC1 sammen med hSNF5 og /eller p53 forbedrer RB1 vej gennem transkriptionel aktivering af

RB1 ​​

,

p16

p21

. forventes Evaluering af RB1CC1 udtryk kombineret med RB1 og p53 status give nyttige oplysninger i klinisk praksis og fremtidige terapeutiske strategier i brystkræft

Henvisning:. Chano T, Ikebuchi K, Ochi Y, Tameno H, Tomita Y, Jin Y, et al. (2010) RB1CC1 Aktiverer RB1 Pathway og hæmmer spredning og Cologenic overlevelse i Human Cancer. PLoS ONE 5 (6): e11404. doi: 10,1371 /journal.pone.0011404

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: November 9, 2009; Accepteret: 9. juni 2010; Udgivet: 30 juni 2010

Copyright: © 2010 Chano et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af KAKENHI (Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning på prioriterede områder; No. 20.012.025) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan; og den japanske Society of Laboratory Medicine Fonden til Fremme af videnskabelig forskning. Disse finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

retinoblastoma tumor suppressor protein (RB1) regulerer G1 /S-fase cellecyklusprogression og er en kritisk mediator af antiproliferativ signalering. Selvom phosphorylering spiller en vigtig rolle i den funktionelle regulering af RB1, den transkriptionelle regulering af RB1 er langt mindre kendt [1]. RB1-inducerbare coiled-coil 1 (RB1CC1: symbolet bruges her, som er godkendt af Human Genome Organization [HUGO] Gene Nomenklaturudvalget, det er også kendt som FIP200, fokal vedhæftning kinase familie-interagerende protein på 200 kDa) blev identificeret som en RB1 vej regulator, især forbedrer

RB1 ​​

transskription [2], [3]. Vi har for nylig demonstreret, at nuklear RB1CC1 binder til en GC-rig region 201 bp opstrøms (fra initiering ATG) af RB1-promotoren og aktiverer ekspressionen af ​​RB1 [4]. En genetisk omlægning af

RB1CC1

er også blevet foreslået at være involveret i tumorigenese af brystkræft [3], [5]. Interessant nok er det blevet rapporteret, at RB1CC1 binder og stabiliserer p53 [6], hvilket antyder, at RB1CC1 kan være en vigtig mediator forbinder RB1 og p53 pathways. Vores nuværende undersøgelse undersøger mekanismen af ​​RB1CC1 forøgelse af RB1-vejen. RB1CC1 danner et kompleks med p53 og /eller hSNF5, et kromatin-remodeling faktor, i cellekerner, og aktiverer transskription af

RB1 ​​

,

p16

p21

. Desuden nukleare RB1CC1 korrelerer RB1 og p16-ekspression betydeligt i brystkræft væv

in vivo

.

Resultater

RB1CC1 danner et kompleks med hSNF5 og /eller p53

Vi forsøgte oprindeligt at identificere RB1CC1-bindende proteiner i MCF-7 brystcancerceller ved en immunpræcipitationsassay efterfulgt af væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS /MS). En chromatin remodeling faktor, hSNF5 (også kendt som BAF47 eller INI1) blev co-immunpræcipiteret med RB1CC1 (fig. 1A). Pull-down assay under anvendelse RB1CC1 deletion-mutanter viste, at C-terminale område af RB1CC1 (aa 1364-1594) var påkrævet for interaktionen med hSNF5 (fig. 1B og C). N-terminalen af ​​RB1CC1 interagerer også med p53 [6], så vi fandt, at RB1CC1 kan danne et kompleks med hSNF5 og /eller p53 at inhibere tumorvækst. Kompleksdannelsen mellem RB1CC1, hSNF5 og p53 blev bedømt ved immunopræcipitation og immunofluorescensassays. RB1CC1, hSNF5 og p53 blev co-immunpræcipiteret med to slags antistoffer, som genkender forskellige steder i RB1CC1 (aa 25-271 og 549-817.); sammensætningen af ​​hver af præcipitaterne er forskellige, sandsynligvis på grund af de foretrukne fraktioner til hvert antistof (fig. 1D). RB1CC1-1 og -2 antistoffer har haft en tendens til at binde mere foretrukket til de nukleare og cytoplasmatiske fraktioner henholdsvis. hSNF5 og rigeligt nukleare p53 (der kan være mere phosphoryleret og langsomt mobiliseret i PAGE) kunne være helst co-udfældet med komplekset mellem nukleare RB1CC1 og RB1CC1-1 antistof. Omvendt kan RB1CC1-2 antistof overvejende binder til rigelige cytoplasmatisk RB1CC1 samt hSNF5 og et par af p53 i cytoplasma. RB1CC1, hSNF5 og p53 blev co-lokaliseret i cellekerner med undtagelse af nucleoli (fig 1 E og F;.. Figur S1). Dataene viste, at RB1CC1 danner et kompleks med hSNF5 og /eller p53 hovedsageligt i cellekerner.

(A) MCF-7-cellelysater blev immunpræcipiteret (IP) med anti-RB1CC1 antistof og analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt ved sølvfarvning. Molekylet, der co-immunpræcipiteret med RB1CC1 blev identificeret som hSNF5 ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS /MS). (B) Flag-RB1CC1 og HA-hSNF5 blev co-transfekteret ind i HEK293-celler. Lysater blev immunfældet med anti-Flag- eller anti-HA-antistof og analyseret ved immunoblots som angivet. Pilespidser angiver de co-immunpræcipiteret signaler. (C) HEK293-celler blev transficeret med både HA-hSNF5 vildtype (fuld) og Flag-RB1CC1 varianter; vildtype (wt), Erhvervs- og Selskabsstyrelsen, dccB, DLZ, LZC, DCC og FCC. Skematiske diagrammer af RB1CC1wt og mutanter er også angivet på venstre side. Rektanglet viser bindingsstedet for hSNF5, og den stiplede rektangel angiver, at for p53. Cellelysater blev immunpræcipiteret med anti-HA-antistof og immunblottet som angivet. (D) MCF-7-lysater blev immunfældet med to slags anti-RB1CC1 antistof og analyseret ved immunoblots. (E) RB1CC1 (grøn), hSNF5 (rød), p53 (blå) og det flettede billede i HeLa-celler. Hvert protein immunofluorescently mærket ved Alexa 488, 594 eller 350 hhv. Scale bar, 50 um. (F) RB1CC1 (grøn), DAPI og det flettede billede i HeLa-celler. RB1CC1 er immuno-mærket fra Alexa 488, og DAPI vises med blå fluorescens i cellekerner. Scale bar, 50 um.

RB1CC1 binder til og aktiverer initiativtagerne til RB1, p16 og p21, samarbejde med p53 og /eller hSNF5

RB1CC1 [2], [4] [6], og hSNF5 [7], [8], [9], [10] øge transskription af de involverede i RB1 vej molekyler, så vi undersøgt, om RB1CC1, hSNF5 og p53 binder til promotorområder af

RB1

,

p16

p21

. Kromatin immunopræcipitationsanalyser (chip) assays under anvendelse af antistoffer mod RB1CC1, hSNF5 og p53 angivet, at promotor-fragmenter af

RB1 ​​

,

p16

p21

, der blev amplificeret fra HeLa celle kromatin blev udfældet ved hvert antistof (fig. 2A), hvilket tyder på, at molekylerne rekrutteres til promotor- regioner af RB1-vejen. Inddragelsen af ​​disse tre molekyler i ekspressionen af ​​

RB1 ​​

,

p16

p21

blev valideret ved at indføre sh-RNA for

RB1CC1

(sh –

RB1CC1

),

hSNF5 Hotel (SH-

hSNF5

) og

p53

(SH-

p53

) ind i HeLa-celler . Knockdown effekt på

RB1CC1

,

hSNF5

,

p53

,

p21

,

p16

RB1 ​​

mRNA-ekspression blev analyseret ved semikvantitativ RT-PCR. SH-

RB1CC1

og SH-

hSNF5

faldt mRNA niveauer af

RB1 ​​

,

p16

p21

, mens SH-

p53

faldt kun

p21

mRNA (fig. 2B). Med andre ord, er RB1CC1 og hSNF5 nødvendige for at opretholde transskriptioner af

RB1 ​​

,

p16

p21

, mens p53 specielt kræves for transskription af

p21

. RB1CC1 betydeligt aktiveret initiativtagerne til

RB1 ​​

,

p16

p21

(Fig. 2C), og knockdown af RB1CC1 undertrykt dem (fig. 2D). Disse promoter forbedringer af RB1CC1 blev sammenlignet blandt HeLa, TTC642 (hSNF5-null) og H1299 (p53-null) celler, for at validere kravet om hSNF5 eller p53 når RB1CC1 aktiverer

RB1 ​​

,

p16

p21

. RB1CC1 ikke var i stand til at yde betydelig forøgelse af

RB1 ​​

og

p16

initiativtagere i TTC642 celler, og spillede kun en lille rolle i

p16

p21

transkription i H1299-celler (fig. 2E). I betragtning af RB1 vej indledt af RB1CC1, RB1CC1 kræver hSNF5 til forbedring af

RB1 ​​

og p53 til forbedring af

p21

transskriptioner, men både hSNF5 og p53 er nødvendige for RB1CC1 forbedring af

p16

transkription. Sammenfattende RB1CC1 kræver interaktion med både hSNF5 og p53 at levere en stærk aktivering af

RB1 ​​

,

p16

p21

initiativtagere.

(A ) kromatin immunpræcipitering (chip) assay blev udført i HeLa-celler. Kromatin blev immunpræcipiteret af anti-RB1CC1, anti-p53 eller anti-hSNF5 antistof. Hver udfældet DNA blev analyseret ved kvantitativ og semi-kvantitativ PCR ved hjælp af promoter-specifikke primere til

RB1 ​​

,

p16

p21

. De signalintensiteter blev defineret på grundlag af dem stammer fra input-DNA (2 ng /ul) af HeLa-celler, der blev sat som 1000. (B) Semi-kvantitativ RT-PCR blev udført på den enkelte cyklus tal for hver udskrift i HeLa-celler behandlet med shRNA for

RB1CC1

,

hSNF5

eller

p53

. SH-

GL3

, SH-

p21

SH-

P16

blev brugt som kontrol. Parentes angiver PCR cyklus numre. (C-D) I HeLa-celler, luciferaseaktiviteten af ​​promotoren for

RB1 ​​

,

p16

p21

steget markant ved transfektion af plasmid udtrykker RB1CC1 (RB1CC1wt) (

C

) og faldt markant ved knockdown af RB1CC1 hjælp SH-

RB1CC1

-1 og -2 (

D

), sammenlignet med celler transficeret med pcDNA eller sh-RNA scramble henholdsvis som kontroller. Værdierne angiver midlerne ± standardafvigelser fra firdobbelte eksperimenter. (t-test, stjerne (*) angiver statistisk signifikante forskelle mellem pcDNA og RB1CC1wt eller mellem scramble og SH-

RB1CC1

*, p. 0,05 og **, p 0,01). Effektiviteten af ​​overekspression eller knockdown af RB1CC1 blev valideret af Western blot, som angivet i de øvre paneler. (E) Efter indførelsen af ​​RB1CC1wt, luciferase aktiviteter af initiativtagerne til

RB1 ​​

,

p16

p21

blev sammenlignet blandt HeLa, TTC642 (hSNF5-null) og H1299 (p53-nul) celler. Stjerner (**) angiver statistisk signifikante forskelle (Students t-test, p 0,01). Mellem HeLa og TTC642 eller mellem HeLa og H1299

RB1CC1 aktiverer RB1 vej og undertrykker tumorvækst

for at vurdere, om RB1CC1 øger RB1 veje til at undertrykke kræft cellevækst blev HeLa-celler lentivirally transduceret med

RB1CC1

cDNA eller shRNA. Ektopisk ekspression af RB1CC1 øgede proteinniveauer af p53, p21, p16 og RB1, og inhiberede cellevækst (fig. 3A og B, venstre panel). I modsætning hertil knockdown af endogen RB1CC1 ved SH-

RB1CC1

faldt niveauerne af p53, hSNF5, p21 og p16, og øget cellevækst (fig. 3A og B, højre panel). De samme forsøg i to brystcancercellelinier (MCF-7 og SK-BR3) gav lignende resultater (fig. S2a-D). I

RB1CC1

-transduced celler, blev antallet af G0 /G1-fase-celler steget samtidig med faldet i antallet af celler i S og G2 /M faser. Indførelse af SH-

RB1CC1

faldt G0 /G1 befolkning og øget befolkningerne i cellerne i S og G2 /M. (Figur 3C.. Figur S2E)

(A) HeLa-celler blev lentivirally transduceret med

RB1CC1

eller SH-

RB1CC1

. Lysater blev immunblottet som angivet. (B) Vækst analyser i HeLa-celler transduceret som i

en

. Dataene blev kvantificeret fra tredobbelte eksperimenter (lavere kolonne). Repræsentative immunblots, plader og betyder koloni numre ± standardfejl er vist. (C) Efter lentiviral ændring af RB1CC1 udtryk blev NIH3T3 celler analyseret ved flow-cytometri.

RB1CC1

og SH-

RB1CC1

er angivet med rød (til venstre) og blå (til højre), hhv. De data (betyder procenter ± standardafvigelser) blev bekræftet i tredobbeltforsøg, og en repræsentant flowcytometrisk graf demonstreres. pLenti6 og sh-GL3 blev anvendt som kontroller. Pile angiver, at stigninger (op-pil) og falder (ned-pil) var statistisk signifikant i henhold til t-test; p. 0,05 (D) RB1CC1, hSNF5 og p53 form transkriptionelle kompleks i cellekerner, og aktivere

RB1 ​​

,

p16

p21

tilsammen de ovennævnte data viste, at RB1CC1 dannet et kompleks med hSNF5 og /eller p53, og globalt aktiveret transskription af

RB1 ​​

,

p16

p21

(fig. 3D).

udtryksmæssige analyse af de involverede i RB1CC1-RB1 vej hos brystkræft molekyler

in vivo

for at vurdere sammenhængen mellem den proliferative aktivitet og den ovennævnte RB1CC1 pathway RB1 aktivering involverer p53 og hSNF5 i tumorvæv

in vivo

, vi evaluerede ekspressionel status RB1CC1, RB1, p16, p21, Ki-67, p53 og hSNF5 i 59 tilfælde af brystkræft. Fire tilfælde af RB1 nullizygotes viste en høj Ki-67 proliferation indeks (middel ± standardfejl = 69,7 ± 6,6%). Immunoreaktiviteten af ​​p53-henvisning til p21-ekspression-var opdelt i to kategorier, “normal” (p53nor) for svag farvning og “unormale” (p53ab) for en stærk farvning, hvilket stærkt tilkendegivet, at mutant p53 protein blev akkumuleret. Der var 41 og 14 tilfælde af p53nor og p53ab henholdsvis i denne serie. hSNF5 blev meget vedligeholdt i brystcancere, uanset RB1CC1 eller p53 status (data ikke vist). De immunohistokemiske resultater for RB1CC1 blev kvantitativt gradueres som I-III. Grade III, der udtrykker RB1CC1 rigeligt i cellekerner, blev registreret som RB1CC1 (+), mens kvaliteter I-II uden nukleare RB1CC1 blev registreret som (-) (. Figur 4A). Som tidligere rapporteret [4], blev ekspressionen af ​​RB1 ganske godt korreleret med RB1CC1 udtryk i de tilfælde registreret som RB1CC1 (+) og var højere end i RB1CC1 (-) tilfælde (. Figur 4B, til venstre). p16-ekspression blev også korreleret positivt med RB1CC1 ekspression nukleare (fig. 4B, 2

nd venstre). Mærkning indekser af p21 og Ki-67 i p53nor tilfælde – men ikke i p53ab sager – var godt korreleret med udtrykket status RB1CC1 (. Figur 4B, 3

rd venstre og højre). Sammen blev udtrykket status RB1CC1 og p53 er forbundet med en øget udtryk for RB1, p16 og p21, som igen påvirkede Ki-67 indeks spredning aktivitet i kliniske brystkræft. Derfor er den immunhistokemiske status RB1 og p53 samt den for RB1CC1 skal være gode indikatorer for den proliferative aktivitet; Således kunne RB1CC1-RB1 vej demonstreret i vores eksperimenter spille en væsentlig rolle i udviklingen af ​​den kliniske brystkræft

(A) De immunhistokemiske kvaliteter af RB1CC1 blev klassificeret som I-III:. Jeg, negativ plet i både cytoplasma og kerner; II, positiv plet kun i cytoplasmaet og negativ i cellekerner; III, positiv plet i kerner og /eller cytoplasma. Kvaliteter III, der udtrykker RB1CC1 rigeligt i cellekerner, blev registreret som RB1CC1 (+), hvorimod kvaliteter I-II uden nuklear RB1CC1 blev registreret som RB1CC1 (-). Scale bar viser 50 um. (B) Sammenhæng mellem RB1CC1 og RB1, p16, p21 eller Ki-67 i p53normal (øverste diagrammer) og abnorme (lavere grafer) sager. RB1CC1 (-) eller (+) status er angivet på den vandrette linie, og hver mærkning indeks er angivet på en vertikal linje i graferne. En unormal p53 status blev defineret som et tilfælde af brystkræft, når mere end 50% af tumorcellerne var stærkt positive for p53, mens mindre end 10% af cellerne var positive for p21. Sådanne tilfælde stærkt oplyst, at mutant p53 protein blev akkumuleret, og at de intakte funktioner af p53 (som transkriptionel aktivering til

p21

) var tab. Studerendes

t

-test blev anvendt til at vurdere sammenhængene (*, p 0,05 og **, p 0,01)

Diskussion

RB1CC1 er. en roman regulator af RB1 der dephosphorylerer RB1 [2], [6] og øger dens udtryk [2], [4]; desuden en genetisk omlejring af

RB1CC1

kan være involveret i brystkræft tumorigenese [3], [5]. For nylig, vi rapporterede, at nuklear RB1CC1 direkte aktiverer

RB1 ​​

promotor gennem et 201 bp opstrøms GC-rige region (-201 /U-GCbox) [4]. At klarlægge mere præcist den molekylære mekanisme af RB1CC1 virkning, en immunpræcipitationsassay efterfulgt af LC-MS /MS blev forsøgt, og en chromatin remodeling faktor, blev hSNF5 identificeret. RB1CC1 interagerer også med p53, så RB1CC1 menes at danne et kompleks med hSNF5 og /eller p53. Det menes, at RB1CC1 inducerer

RB1 ​​

[2], [4], og at hSNF5 forbedrer

p16

(også kendt som INK4a eller CDKN2A) og /eller

p21

(også kendt som CIP1, WAF1 eller CDKN1A) [7], [8], [9], [10]. Faktisk har immunpræcipitation og immunfluorescens-assays viste, at et kompleks mellem RB1CC1, hSNF5 og p53 former i cellekerner, og chip, kvantitativ RT-PCR og luciferase assays for

RB1 ​​

,

p16

og

p21

har foreslået, at de koordinerede transkriptionelle forbedringer af disse molekyler er påvirket af den komplekse, herunder RB1CC1, hSNF5 og p53. Men RB1CC1, hSNF5 og p53 ikke er lige vigtige for stimulering af hver af initiativtagerne til

RB1 ​​

,

P16

eller

p21

, mens tre molekyler rekrutteres til hver promotor. For eksempel tavshed

p53

i HeLa-celler havde ingen effekt på transskription af

RB1 ​​

, og RB1CC1 overekspression kan aktivere

RB1 ​​

promotor i H1299 (p53 null) celler. Disse betyder, at p53 ikke væsentlige forpligtet til

RB1 ​​

transskription, og at RB1CC1 og hSNF5 kan samarbejde for at aktivere

RB1 ​​

transskription. Således er alle tre molekyler ikke altid påkrævet for aktivering af hver af initiativtagerne, mens alle tre er nødvendige for de koordinerede transskriptioner af

RB1 ​​

,

p16

p21

. Vi har også etableret tidligere, at nuklear RB1CC1 binder til og aktiverer

RB1 ​​

promotor [4]. Interessant, en punkt-mutation i -201 /U-GCbox af

RB1 ​​

promotor blev identificeret i en arvelig retinoblastoma familie [11]. Det skal understreges, at det -201 /U-GCbox af

RB1 ​​

og bindende transkriptionelle kompleks, der omfatter RB1CC1, hSNF5 og p53 spiller vigtige roller i human carcinogenese.

I den foreliggende undersøgelse , RB1CC1, i samarbejde med hSNF5 og p53, aktiverer RB1 vej og undertrykker tumorcellevækst. For at aktivere RB1 pathway effektivt skal RB1CC1 udtrykkes i cellekerner og bør danne et kompleks med hSNF5 og /eller p53, som foreslået i de immuncytokemiske og immunohistokemiske data af denne undersøgelse. PIASy (et protein-inhibitor af aktiveret STAT-protein y) interagerer med den C-terminale ende (aa 1350-1594), i RB1CC1 og rekrutterer et interagerende kompleks mellem PIASy og RB1CC1 fra cytoplasma i kerner [12]. Desuden PIASy regulerer negativt mammalian target of rapamycin (mTOR) aktivitet stimuleret af cytoplasmatisk RB1CC1, og positivt aktiverer p53-p21-signalvejen sammen med nukleart RB1CC1 [12]. Disse data synes at være kompatibel med vores præsenterede data om sublokalisering af komplekset består af RB1CC1, hSNF5 og p53. Den nukleare molekylære kompleks, herunder RB1CC1, hSNF5, p53 og ekstra PIASy, kan danne en stor transkriptionel komponent for at aktivere RB1 vej sideordnet og undertrykker tumorigenese i humant brystvæv.

Nuklear udtryk for RB1CC1 kunne være vigtigt for tumor undertrykkelse. Som tidligere rapporteret, er RB1CC1 ligger ikke kun i kernen, men også i cytoplasmaet [4], [6], [13], [14]. Cytoplasmatisk RB1CC1 er blevet foreslået at være svarende til gær Atg17, og flere undersøgelser har indikeret, at RB1CC1 fungerer som en væsentlig molekyle i autophagy regulering [13], [14], [15]. Autophagy har været impliceret i tumorigenese, men dens præcise rolle er tvetydig. Det er tænkeligt, at autophagy har forskellige roller i de forskellige faser, eller sammenhænge, ​​af tumorigenese. Young et al. [16] har rapporteret, at autofagi medierer mitotiske aldring, et vindue ind tidligt tumor udvikling. Vi foreslår, at cytoplasmatisk-nukleare overgang RB1CC1 spiller en central rolle i autofagi-ældning forening. Vores data

in vitro

og

in vivo

tyder på, at RB1CC1 spiller forskellige roller i henhold til dens subcellulære placering. Nuclear RB1CC1 danner et kompleks med hSNF5, p53 og enhver anden komponent, der bidrager til transkriptionen af ​​RB1 pathway, hvilket indikerer en mulig relation til mitotisk senescens. , Cytoplasmatisk RB1CC1 synes dog at spille nogen rolle som en tumor suppressor aktivere RB1 vej.

Nuclear RB1CC1 udtryk signifikant korreleret med de RB1 og p16 i brystkræft væv

in vivo

, uanset p53-status. Ki-67 spredning indeks og p21-ekspression var påvirket af både RB1CC1 og p53, og Ki-67-indekset også afhang RB1 status. Udtrykkene for RB1, p16 og p21 påvirker Ki-67 indeks for proliferativ aktivitet, så den immunhistokemiske status RB1 og p53 samt den for RB1CC1 kan forudsige den proliferative aktivitet af tumoren. Den foreliggende data tydede således at progression af brystcancere var under stærk indflydelse af RB1CC1 samt RB1 og p53 status. Vi forventer, at den kombinerede immunhistokemisk evaluering af RB1, vil RB1CC1 og p53 give indsigt i deres kliniske applikationer, såsom mulig anvendelse som prognostiske biomarkører.

Sammenfattende har vi rapporteret her, at RB1CC1, der forbinder RB1 og p53 veje som en mulig mediator, danner et kompleks med hSNF5 og /eller p53, som øger RB1 pathway globalt. Immunhistokemisk evaluering af RB1 og p53 i kombination med RB1CC1 kan være en nyttig biomarkør i praktiske, rutinemæssige kliniske assays og give en forudsigelse af den biologiske opførsel af bryst neoplasmer og /eller tumorer i andre organer.

Materialer og metoder

Cell kultur

TTC642 er venligst leveret af Drs. Shigeru Ohta, Hiroyuki Shimada og Timothy J. Triche (Childrens Hospital Los Angeles, Los Angeles, CA). HeLa, HEK293, MCF-7, SK-BR3 og H1299-celler blev anskaffet fra American Type Culture Collection (MD) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) eller RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum. Alle celledyrkningsmedier blev suppleret med penicillin (50 enheder /ml) og streptomycin (50 mg /ml).

Antistoffer og reagenser

Kanin antisera mod RB1CC1 (aa. 25-271, 549 -817 som hver epitop) blev dannet som tidligere beskrevet [4], [17], og det oprensede IgG blev anvendt i eksperimenterne. Anti-p53 (FL-393) og anti-p21 (F-5) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (CA). Anti-HA (3F10) var fra Roche (Tyskland). Anti-Flag (M2) og anti-tubulin α (DM 1A) blev indkøbt fra Sigma (MO). De andre antistoffer var fra BD Biosciences (CA).

Immunopræcipitation af protein-kompleks fulgt af væske schromatografi tandem massespektrometri (LC-MS /MS)

MCF-7-brystcancerceller blev lyseret i EBC lysepuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,25% natriumdeoxycholat, 0,2 mM Na

3VO

4, 100 mM NaF og 1% protease inhibitor cocktail (Wako Chemicals, Japan), og derefter centrifugeret i 20 minutter ved 20.000 x g ved 4 ° C. 5 ml supernatant (~10mg /ml) blev inkuberet med 100 ug af anti-RB1CC1 oprenset IgG primært antistof ved 4 ° C natten over. Immunkomplekserne blev bundet til protein G-agarose (Pierce, IL) i yderligere 2 timer ved 4 ° C og vasket fem gange med NETN (20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP 40). Proteinerne bundet til protein G-sepharose blev elueret ved tilsætning af Laemmli SDS-prøvebuffer indeholdende 62,5 mM Tris-HCI (pH 6,8), 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 2% SDS og 0,01% bromphenolblåt til gelen og kogende det i 3 min. Efter centrifugering ved 10.000 x g i 2 minutter blev supernatanten underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), og de separerede proteiner blev visualiseret ved sølvfarvning. Den stærkt farvede specifikt bånd blev i-gel fordøjet med trypsin, og de genvundne peptider blev analyseret ved hjælp af en elektrosprayionkilde-trap massespektrometer (LCQ, Finnigan MAT, CA) kombineret online med kapillar HPLC (Magic 2002 Michrom BioResorces, CA) til erhverve massespektrometri /massespektrometri (MS /MS-spektre). Data fra MS /MS-spektre blev anvendt til at søge en kompileret protein database, der bestod af database NR og en seks-læsning-frame oversat EST-database, til at identificere proteinet ved hjælp af offentligt tilgængelige program rov (http: //prowl.rockefeller.edu).

plasmid-DNA og genoverførsel

ekstern og intern deletionsmutanter for

RB1CC1

(GenBank nr. NM_014781) blev genereret i pcDNA3.1 plasmidvektor (Invitrogen), ved en kombination af PCR-baserede manipulationer med relevante eksterne primere ved de nedenfor beskrevne positioner og restriktionsenzymfordøjelse. Nukleotiderne i alle konstruktioner blev bekræftet ved DNA-sekventering.

RB1CC1

mutanter Erhvervs- og Selskabsstyrelsen, dccB, DLZ, LZC, DCC og FCC slettet aminosyrerne 863-1083, 1078-1363, 1364-1594, 1-1356, 824-1594 og 1-863 henholdsvis ( fig. 1C, venstre panel). Transfektion blev udført ved anvendelse FuGENE HD (Roche) ifølge leverandørens anbefalinger. Plasmidvektorer af RNAi til

RB1CC1

blev udarbejdet som tidligere [17] beskrevet. Kort fortalt to slags lentiviral sh-RNA-vektorer (SH-

RB1CC1

-1 og -2) svarende til forskellige målgrupper sites (nt. 2070-2090 og nt. 4611-4631, henholdsvis) på

RB1CC1

mRNA (GenBank nr. NM_014781) blev syntetiseret in vitro ved at indsætte kunstige oligonukleotider i pSIH1-H1-Puro sh-RNA-vektor (System Biosciences, CA). Vektorer til sh-RNA

hSNF5

p53

fremstilledes ved OpenBiosystems (AL). For ikke-tavshed kontroller, SH-

GL3

kapløbet vektorer blev købt fra System Biosciences og OpenBiosystems hhv. Derudover human

RB1CC1

cDNA blev subklonet i en pLenti6 vektor (Invitrogen). Lenti-virus overfører sh-RNA eller cDNA blev forberedt med hver emballage mix, i henhold til hver producentens anvisninger. Klonede og ekspanderede celler blev udvalgt under tilstedeværelse af puromycin eller blasticidin henholdsvis og anvendt i forsøgene.

Pull-down assay

Flag-mærkede vildtype (wt)

RB1CC1

eller dets mutanter (Erhvervs- og Selskabsstyrelsen, dccB, DLZ, LZC, DCC og FCC) blev transficeret ind i HEK293 celler kombineret med HA-mærket hSNF5 (fuld). Cellerne blev lyseret i TNE-buffer (20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40 og 1 mM Na

3VO

4 indeholdende en blanding af proteaseinhibitorer). Lysaterne blev centrifugeret, og supernatanterne blev inkuberet med anti-Flag- eller anti-HA immobiliserede perler i 2 timer ved 4 ° C. Perlerne blev vasket fem gange med TNE-buffer og kogt i nærværelse af Laemmli SDS-prøvebuffer. De proteinkomplekser blev opløst ved SDS-PAGE, overført til PVDF membranfiltre og underkastet immunoblotanalyse med de angivne antistoffer.

Immunopræcipitation at detektere proteinkomplekset

MCF-7 monolag celler blev skyllet med iskold phosphatbufret saltvand (PBS) og skrabet over i iskold NP-40 lysispuffer (20 mmol /L Tris (pH 8,0), 137 mmol /l NaCl, 1% NP-40, 10% glycerol) suppleret med 1% protease inhibitor cocktail (Wako Chemicals) og 3 mmol /l Na

3VO

4. Lysater blev inkuberet på is i 20 minutter, klaret ved centrifugering, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved bicinchoninsyre-assay (Pierce). Opløsninger indeholdende 400 til 1.000 ug protein blev kortvarigt-klaret med protein-G-agaroseperler (Pierce) og derefter anvendt til immunfældning omsætning med 2 slags anti-RB1CC1 kanin polyklonale IgG’er eller normale kontrol kanin IgG’er ved 4 ° C natten over, efterfulgt ved inkubation med protein-G-perler i 2 timer for at indsamle immunkomplekser. Endelig blev kuglerne vasket med NP-40-puffer fem gange, resuspenderet i SDS-prøvebuffer, kogt, opløst på SDS-PAGE og analyseret ved immunoblots som beskrevet nedenfor.

Immunblotanalyse

celler blev generelt lyseret for Western blotting som beskrevet af Sarbassov et al [18]. Efter udredning lyserede materialer ved centrifugering ved 15.000 x g i 1 min blev supernatanterne kogt i SDS-prøvebuffer. Proteiner løses ved SDS-PAGE blev overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) filtre. Efter blokering af filtrene med TBS-T (10 mM Tris-HCI (pH 7,6), 150 mM natriumchlorid, 0,1% Tween 20) indeholdende 5% bovint serumalbumin (BSA), blev filtrene inkuberet natten over med de angivne primære antistoffer i TBS-T indeholdende 2% BSA ved 4 ° C. Filtrene blev derefter vasket i TBS-T og inkuberet i 1 time i peberrodsperoxidasekonjugeret anti-muse, anti-kanin eller anti-rotte IgG (GE Healthcare, UK) fortyndet 1:20,000 i TBS-T indeholdende 2% BSA . Efter adskillige vaske med TBS-T, blev immunoreaktiviteten detekteret ved anvendelse af ECL-systemet (GE Healthcare) ifølge fremgangsmåderne anbefalet af fabrikanten.

immunofluorescensbestemmelse Salg

MCF-7 og HeLa-celler var dyrket på Labtek ™ kammerobjektglas (BD Biosciences) til 70% konfluens, fikseret med 1% bufret formaldehyd og 70% ethanol, og derefter permeabiliseret med 0,1% Triton X-100. Den primære kanin anti-RB1CC1 IgG, muse-anti-hSNF5 IgG2a (BAF48), og kanin-anti-p53 IgG (FL393) blev konjugeret med Alexa 488, 594 og 350 af kittet ZenonTM mærkning (Molecular Probes). Forsøgene blev udført in triplo.