PLoS ONE: Omfattende Evaluering af Nuclear Factor-κΒ Expression Opskrifter i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Nuklear faktor (NF) -κB signalering er nødvendig for lunge adenocarcinom udvikling i mus, og begge af dets underenheder

Rel

A og

Rel

B blev uafhængigt rapporteret at være stærkt udtrykt i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Til omfattende undersøge NF-KB udtryk i NSCLC, vi analyserede serielle sektioner af primær tumor prøver fra 77 veldokumenterede patienter (36 adenocarcinomer, 40 planocellulært karcinom og 3 store celle carcinomer) til immunoreaktivitet af

Rel

A,

Rel

B, P50, og P52 /P100. Tumor og intratumoral stroma områder blev diskrimineret på grundlag af prolifererende cellekerneantigen immunoreaktivitet og inflammatorisk infiltration blev vurderet i intratumorale stroma områder. NF-KB-immunreaktivitet blev kvantificeret ved intensitet, omfang og nuklear lokalisering og var krydsforhøres med tumorcelleproliferation, inflammatorisk infiltration, og klinisk-patologiske data. Vi fandt, at ekspressionen af ​​de forskellige NF-KB underenheder ikke var overensstemmende, berettiger vores integreret tilgang. Samlet set

Rel

En,

Rel

B, og P50 blev udtrykt ved højere niveauer sammenlignet med P52 /P100. Men

Rel

, A og P50 blev overvejende udtrykt i intratumoral stroma, men

Rel

B i tumorceller. Vigtigt er det, blev tumor-området

Rel

En udtryk korreleret med intensiteten af ​​inflammatoriske infiltration, hvorimod

Rel

B ekspression blev identificeret i prolifererende tumorceller. Brug multipel logistisk regression, vi identificeret, at tumor

Rel

B udtryk var en uafhængig prædiktor for lymfeknude metastaser, og tumor P50 var en uafhængig prædiktor for TNM6 etape IIB eller højere, mens tumor

Rel

en var en uafhængig forudsiger af inflammatorisk infiltration. Vi konkluderer, at patologiske undersøgelser af NF-KB udtryk i kræft bør omfatte flere pathway komponenter. Ved hjælp af en sådan tilgang, vi identificeret spændende associationer mellem forskellige NF-KB underenheder og kliniske og patologiske funktioner i NSCLC

Henvisning:. Giopanou I, Lilis I, Papaleonidopoulos V, Marazioti A, Spella M, Vreka M, et al. (2015) Omfattende Evaluering af Nuclear Factor-κΒ Expression Mønstre i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (7): e0132527. doi: 10,1371 /journal.pone.0132527

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: Marts 3, 2015; Accepteret: 15 Juni 2015; Udgivet: Juli 6, 2015

Copyright: © 2015 Giopanou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information fil

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af et europæisk forskningsråd 2010 Starting Independent Investigator Grant (tilskud nummer # 260.524 til GTS; https://erc.europa.eu/KRAS-mutation-interaktioner-host-immunitet-maligne-pleural-effusion). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige menneskelige kræftformer og den førende kræft dræber verdensplan [1]. Lungekræft består af to primære histologiske typer, småcellet carcinom og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), med sidstnævnte tegner sig for mere end 80% af nye tilfælde [2]. NSCLC betegner en histologisk forskelligartet gruppe af tumorer, underklassificeres i adenocarcinomer, pladecellecarcinomer og storcellede carcinomer, der tegner sig for 40, 30, og 10% af de nye NSCLC tilfælde henholdsvis [2]. Adenocarcinom er den dominerende NSCLC undertype med stigende forekomst [3].

pattedyr nukleare faktor (NF) -κB vej består hovedsageligt af

relativ

A, C-

Rel

,

Rel

B, NF-κB1 (P105 /P50), og NF-κB2 (P100 /P52) [4]. Disse allestedsnærværende proteiner danner homo- eller heterodimerer, der bor i cytoplasmaet i en inaktiv form, bundet til hæmmende proteiner kendt som hæmmere af NF-KB (ΙκΒ). Ved stimulering, IKB undergå phosphorylering af flere IKB-kinaser (IKK; a, β, γ, ε, og andre), såvel som ubiquitinering og proteolytisk nedbrydning af proteasomet og andre proteaser, til frigivelse aktive NF-KB-underenheder for nuklear translokation og aktivering af målgen transkription [5, 6]. Der er to primære NF-KB aktivering veje, den kanoniske (eller klassisk) og ikke-kanoniske (eller alternative), som er medieret af

Rel

A /P50 eller c-

Rel

/P50 og

Rel

B /P52 dimerer henholdsvis [4-7]. For nylig blev yderligere mekanismer af NF-KB-aktivering afsløret, herunder, men ikke begrænset til inducerbar behandling af P100 til P52 reguleret af IKKα homodimerer, yderligere forøger systemets kompleksitet [8]. Canonical og /eller alternative NF-KB-aktivering forekommer efter cellulær stimulering med cytokiner, bakterier eller vira, endotoksiner, oxidativt stress, bestråling osv, og kan føre til celledifferentiering, proliferation, inhibering af apoptose og /eller inflammatorisk signalering [9] .

NF-KB-aktivering er blevet identificeret i adskillige humane cancere, herunder men ikke begrænset til lymfom, colorektale tumorer, esophageal og hoved og hals-carcinom, brysttumorer, hepatocellulært carcinom og prostatacancer [10-16] . Men undersøgelser har fokuseret næsten udelukkende på den kanoniske NF-KB-vejen, mens rollen som alternativ NF-KB-signalering i tumor promotion og progression er stadig uklar [17-19]. I humant NSCLC, øge den nukleare

Rel

En immunoreaktivitet er blevet beskrevet med progressiv sygdom [20]. Canonical NF-KB-signalering har også vist sig at være afgørende for lunge tumor dannelse i musemodeller af NSCLC fremkaldt af onkogene

KRAS

G12D

og /eller tab af tumorundertrykkere

Trp53

og

Gprc5a

, cigaretrøg eksponering, og tobak kræftfremkaldende urethan [21-25]. andre undersøgelser tyder imidlertid på, at konstitutiv eller tumor mikromiljø-induceret NF-KB-aktivering i NSCLC er mere kompleks og hviler på mere end én vej [26-28].

Her er vi satte os for at teste dette ved hjælp af omfattende analyser multiple NF-KB-underenhed ekspression af 77 veldokumenterede patienter med NSCLC. Til dette formål har vi udviklet en semi-kvantitativ NF-KB-underenhed pointsystem, der tager højde for både ekspressionsniveauerne samt nuklear lokalisering. Vi konsekvent identificeret forskellige NF-KB subunit ekspressionsmønstre i tumorceller versus intratumoral stroma og fundet interessante relationer mellem disse mønstre og klinisk-patologiske træk ved menneskelig NSCLC. Endelig har vi gengivet nogle af disse resultater i to forskellige musemodeller for NSCLC, hvilket indikerer, at divergerende NF-KB aktivering mønstre er faktisk på spil i NSCLC og kan have forskellige funktioner.

Materialer og metoder

patienter

Seventy syv arkivering formalinfikserede, paraffinindstøbte vævsprøver af patienter med NSCLC, der undergik kirurgisk resektion med helbredende hensigt mellem 2001 og 2008 på University Hospital of Patras diagnostiske blev retrospektivt indskrevet i undersøgelsen. Nogle af disse patienter var også blevet undersøgt i en tidligere rapport fra vores institution [28]. Patienter, alle hvide, 69 mænd og 8 kvinder i alderen fra 46 til 84 år, blev nøje udvalgt på baggrund af tilgængeligheden af ​​omfattende kliniske og patologiske data udtrukket fra de primære patologi rapporter og patienternes filer, herunder alder, køn, histologiske type, kvalitet og detaljeret patologisk stadium. Patienter udvalgte omfattede 34 patienter med lunge adenokarcinomer, 40 med planocellulært karcinom, og tre med store celle carcinomer. Alle patienter blev iscenesat i henhold til den sjette udgave af TNM klassifikationen for NSCLC, strøm på tidspunktet for deres diagnose [29]. Undersøgelsens observationsstudier protokol blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen, blev godkendt af den etiske komité af Universitetshospitalet i Patras, Grækenland, og alle patienter gav skriftligt informeret samtykke.

Mus

Eksperimenter blev godkendt på forhånd af Veterinary Administration af vestlige Grækenland (protokol nummer: 276134/14873/2) og blev gennemført i henhold til direktiv 2010/63 /EU (https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do ? uri = OJ: L: 2010: 276: 0033: 0079: EN: PDF). For mutant KRAS-drevet lunge tumorigenese,

C57BL

/6 mus heterozygote for loxP-STOP-loxP.

KRAS

G12D transgen blev brugt, som udtrykker mutant KRAS i nogen somatiske celler på CRE-medieret rekombination (i det følgende benævnt

LSK

mus, Jackson Laboratories, Bar Harbor, MN) [22]. For lunge tumor induktion,

LSK

mus modtog rekombinant adenovirale vektorer koder CRE rekombinase (Ad-

Cre

, Baylor College of Medicine, Cell og Gene Therapy Center, Vector Development Lab, Houston, TX) intratrachealt (5×10

8 plakdannende enheder i 50 pi phosphatpufret saltvand) og blev aflivet efter fire måneder [30]. Til kemisk-induceret lunge tumorigenese,

FVB

mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MN) modtog tobakken kræftfremkaldende urethan intraperitonealt (1 g /kg i 100 pi phosphatpufret saltvand) og blev aflivet efter 6 måneder [21 , 31]. Mus lunger blev afblødt ved 20 ml intrakardial saltvandsinfusion blev oppustet med 10% neutral-bufferet formalin hjælp 20 CMH

2O pres, er fastsat i% neutral-bufferet formalin, og blev indlejret i paraffin.

immunhistokemi

humane og muse vævsblokke blev skåret i 4 um-tykke snit, som efterfølgende blev deparaffinised af ethanol-gradient, rehydreret og kogt i varmeinduceret epitop antigen-genvinding opløsning (0,1 M natriumcitrat, pH = 6,0 ). Endogen peroxidaseaktivitet blev inhiberet under anvendelse af 3% H

2O

2 og ikke-specifikt antistof-proteinbinding blev forhindret ved anvendelse af 3% bovint-serumalbumin-indeholdende Tris-bufret saltvand. Følgende primære antistoffer og fortyndinger blev anvendt natten over ved 4 ° C: anti-P50 (sc-114 kanin-polyklonalt IgG, 1/150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti P100 /P52 (ab31409 kanin polyklonalt IgG; 1 /150; Abcam, Cambridge, UK), anti-

Rel

A (sc-8008 mus monoklonalt IgG, 1/200, Santa Cruz), anti-

Rel

B (sc-226 kanin polyklonalt IgG, 1/400, Santa Cruz), og anti-prolifererende cellekerneantigen (PCNA; ab2426 kanin polyklonalt IgG, 1/2000; Abcam). Påvisning af primære antistoffer blev udført under anvendelse af et peberrodsperoxidase-konjugeret polymer ifølge producentens instruktioner (EnVision, Dako, Glostrup, Danmark) og diaminobenzidin som det kromogene substrat. Sektioner blev modfarvet med Harris ‘hæmatoxylin, dehydreret, og derefter monteret. For isotypekontroller blev det primære antistof udeladt. Normal tonsil væv blev ansat som positiv kontrol. Alle antistoffer blev valideret for immunhistokemi under anvendelse seriefortyndinger startende fra 1/100 (bortset fra PCNA hvor fortyndinger begyndte på 1/1000) og forskellige albuminkoncentrationer bovint serum i Tris-bufret saltvand efter eller modificere producentens instruktioner for at maksimere signalet til baggrund-forhold. Immunreaktivitet blev scoret af tre blindet til case efterforskere (I.G., H.P., og G.T.S.), herunder en Hellenic bord-certificeret patolog (H.P.) og konsensus søgt i tvetydige tilfælde ved co-observation. PCNA immunreaktivitet blev defineret som procentdelen af ​​positive celler i tumor områder og blev anvendt til at skelne disse (høj procentdel af immunoreaktive celler) fra intratumoral stroma områder (lav procentdel af immunoreaktive celler). Sektioner blev talt ved høj effekt (X400), og 5-8 felter blev vurderet tilfældigt for tumorceller og til intratumorale stroma områder hhv. Et tusind cellekerner blev talt henholdsvis og blev registreret antallet af celler, der viser positiv nuklear farvning. NF-κΒ subunit immunoreaktivitet blev scoret som følger: intensiteten (0: negativ; 1: svag; 2: moderat og 3: stærk), omfang (0: 10% af cellerne positive, 1: 10-35% af celler positive, 2: 35-70% af celler positive, og 3: 70% af celler positive) og distribution (0: negativ; 1: cytoplasmatisk kun; 2: cytoplasmatiske og nukleare og 3: nukleare kun) af immunreaktivitet blev bedømt separat for hver NF-κΒ underenheden for prøven samlet, samt særskilt for tumorceller og intratumoral stroma af hver tumor, og blev kombineret i subunit-specifik samlet, tumor, og stroma scorer ved anvendelse af formlen: NF-κΒ subunit score = (intensitet + omfang) * distribution. NF-κΒ subunit scoringer blev yderligere kategoriseret i lav (0-4), mellemprodukt (5-6), og høj (7-18). Inflammatoriske infiltrater blev bestemt semikvantitativt ved hjælp af PCNA-farvede og isotype kontrolprøver og blev defineret som lav ( 5%), moderate (5-20%), og høj ( 20%), afhængigt af procentdelen af ​​leukocytter i intratumorale stroma områder. Sidstnævnte blev identificeret ved morfologi og manglende immunoreaktivitet for PCNA. Billeder blev taget ved anvendelse af en opretstående Axio Lab.A1 mikroskop forbundet til en AxioCam ERC 5s kamera (Zeiss, Jena, Tyskland). For immunfluorescens blev vævssnit inkuberet samtidig med anti-PCNA (enten ab2426 kanin polyklonale IgG, 1/100 fortynding Abcam for collocalization med

Rel

A eller sc-56 mus monoklonalt IgG, 1/100 fortynding; Santa Cruz collocalization med

Rel

B) og enten anti-

Rel

A (sc-8008 mus monoklonalt IgG, 1/100 fortynding Santa Cruz) eller anti-

Rel

B (sc-226 kanin polyklonale IgG, 1/100 fortynding Santa Cruz) antistoffer som ovenfor, efterfulgt af nuklear kontrastfarvning med Hoechst 33258 (Molecular Probes, Eugene, OR). Påvisning af primære antistoffer blev udført under anvendelse æsel-anti-kanin Alexa568-konjugeret (A10042, 1/500 fortynding Invitrogen, Carlsbad, CA) og æsel-anti-muse Alexa488-konjugeret (A21202, 1/500 fortynding Invitrogen, Carlsbad, CA) sekundære antistoffer. For isotypekontroller ene eller begge primære antistoffer blev udeladt. Immunreaktivitet blev fanget på en Zeiss Axio Observer.D1 inverteret mikroskop tilsluttet en AxioCam MRC 5 kamera (Zeiss, Jena, Tyskland) og blev co-registreret bruger Fiji akademiske imaging freeware (https://fiji.sc/Fiji).

Statistik

Sandsynlighedsværdier (

P

) mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante. Humane NF-κΒ subunit scoringer blev normalt ikke fordelt, som testet af Kolmogorov-Smirnov test (

P

0,05), og er vist i søjlediagrammer som median med kasser angiver interkvartile område og whiskers angiver 95% percentiler. Matchet numeriske NF-κΒ subunit snesevis af de samme tumorer blev sammenlignet ved hjælp af Friedmans test efterfulgt af Dunns post-tests. Kategoriske NF-κΒ subunit scoringer blev sammenlignet ved hjælp af χ

2 test efterfulgt af Fishers eksakte test. Korrelationer mellem numeriske NF-κΒ subunit scoringer og klinisk-patologiske data blev udført ved hjælp af Spearman tests, hvorved den overordnede tærskel af statistisk signifikans (

P

0,05) blev justeret til det totale antal af sammenhænge undersøgt (n = 153) ved Bonferroni-metoden til

P

0,05 /153 = 0,000327. Sammenligninger af numeriske NF-κΒ subunit point ved inflammatorisk infiltration grad og klinisk-patologiske kategorier blev gjort ved hjælp Wilcoxon signed rank test eller Kruskal-Wallis tests efterfulgt af Dunns post-test, for to eller flere sammenligningsgrupper, hhv. For at bestemme om numeriske NF-κΒ subunit scores uafhængigt forudsige klinisk-patologiske variabler, blev sidstnævnte dikotomiseret ved deres median og binære logistiske regression blev udført ved hjælp af den tilbagestående Waldman metoden. Til dette blev NF-κΒ subunit scores bruges som input (uafhængige variable) og klinisk-patologiske variabler og inflammatoriske infiltration scoringer som output (afhængige variable). Muse NF-κΒ subunit score ved progressive trin i carcinogenese er præsenteret som gennemsnit ± SD og blev sammenlignet under anvendelse tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-test. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism v5.0.0 (GraphPad, San Diego, CA) og det statistiske pakke til Social Sciences v20 (IBM SPSS Statistics, Chicago, IL, USA).

Resultater

NF-κΒ subunit udtryk mønstre i NSCLC

de kliniske og patologiske træk af undersøgelsens patienter er sammenfattet i tabel 1. forsøgsresultater rå er vedlagt denne artikel som S1 Table. Vi undersøgte først NF-κΒ underenhedsekspression i normale lunge områder, der støder til vores kirurgisk resektion tumorprøver. I bronchiale og alveolær epitel,

Rel

A, P50 og P100 /P52 udviste lav eller moderat cytoplasmatisk immunoreaktivitet, mens

Rel

B vises højere ekspressionsniveauerne. I juxta-tumoral bronkier og alveolære Hyperplasier, immunoreaktivitet for alle NF-KB underenheder viste et stærkere udtryk mønster, med

Rel

B viser både cytoplasmatisk og nuklear lokalisering. I tumorer blev alle NF-KB subunits stærkt udtrykt i forhold til normale og hyperplastiske områder, med

Rel

B scorer højest og viser den højeste grad af nuklear lokalisering. Imidlertid

Rel

, A,

Rel

B, og P50 immunreaktivitet blev stærkere i forhold til P100 /P52 (fig 1A og 1B). Når NF-KB subunit scoringer blev opdelt i lav (0-4), mellemprodukt (5-6), eller høj (7-18), ingen forbindelse var tydelig mellem de forskellige underenheder (Fig 1C). Ingen statistisk signifikante forskelle blev noteret mellem de forskellige NSCLC histologiske undertyper. Men statistisk signifikante forskelle blev observeret i NF-KB subunit ekspressionsniveauerne inden for hver tumor: tumor områder viste forskellige ekspressionsmønstre sammenlignet med intratumorale stroma områder (Fig 1A, repræsentative paneler i rød ramme). Disse resultater antydede, at flere NF-κΒ underenheder progressivt er overudtrykt i NSCLC, viste, at ikke alle NF-κΒ underenheder udtrykkes ligeligt, og identificeret en uoverensstemmelse i ekspressionen af ​​flere NF-κΒ underenheder mellem tumor og intratumorale stromale områder, berettiger yderligere undersøgelser .

(A) Repræsentative billeder. Billeder i røde rammer repræsentativt vise forskellen NF-KB-underenhed udtryk i tumor og intratumorale stroma områder. (B) Samlet scoring af NF-KB-underenhed ekspressionsniveauer. Data præsenteret som median med bokse angiver interkvartile område og whiskers angiver 95% percentiler. ns, * og ***: P 0,05, P 0,05, og P 0,001 for angivne sammenligninger ved Friedmans test efterfulgt af Dunns post-tests. (C) co-ekspression matrixer af kategoriske NF-KB-underenhed ekspressionsniveauer. Til dette blev NF-KB scores fra (B) kategoriseret i lav (0-4), mellemprodukt (5-6), og høj (7-18). ns: P 0,05 ved χ

2 test efterfulgt af Fishers eksakte test.

Differential NF-κΒ udtryk i tumor og stromale rum i NSCLC

At studere dette nærmere , alle prøver blev farvet for PCNA, som klart identificeret tumor områder (høj overflod af PCNA + celler) fra intratumoral stroma rum (meget lav overflod af PCNA + celler), og NF-KB-underenhed scoring blev gentaget særskilt for disse to områder i serielle sektioner af alle patienter (fig 2A). Disse analyser viste, at

Rel

B var den underenhed udtrykte de stærkeste i områder af tumorceller viser en både nukleare og cytoplasmatisk mønster udtryk. På den anden side, de resterende underenheder undersøgte viste kun moderat cytoplasmisk ekspression i tumorceller områder (fig 2a og 2b). Når tumor rum NF-KB subunit scoringer blev opdelt i lav (0-4), mellemprodukt (5-6), eller høj (7-18) og sammenlignet inden for hver tumor,

Rel

B og P50 viste signifikant uoverensstemmelse, med tumorer med stærk

Rel

B immunoreaktivitet udviser lav P50 scores (fig 2C). Overraskende evaluering udelukkende af intratumoral stroma givet forskellige resultater: her

Rel

, A og P50 underenheder blev mest overvejende udtrykt i kerner af stromale celler. I stærk kontrast,

Rel

B og P100 /P52 viste kun svag cytoplasmatisk immunoreaktivitet (Fig 2A og 2D). Når stroma NF-KB subunit scoringer blev opdelt i lav (0-4), mellemprodukt (5-6), eller høj (7-18) og sammenlignet inden for hver tumor,

Rel

B og P100 /P52 viste betydelig konkordans, med 49/77 tumorer viser samtidig lave scores for begge underenheder, sandsynligvis afspejler de lave ekspressionsniveauer af begge proteiner (figur 2E). Vi endelig undersøgt forholdet mellem numeriske og kategoriske tumor og stroma scores for hver NF-KB-underenhed, finde, at kun P100 /P52 udtryk i tumor og den tilhørende stroma var overensstemmende og korreleret (Fig 2F og 2G).

(A) Repræsentative billeder. (B, D) Scoring af NF-KB-underenhed ekspressionsniveauer i tumor (B) og stroma (D) områder. Data præsenteret som median med bokse angiver interkvartile område og whiskers angiver 95% percentiler. ns og ***: P 0,05 og P 0,001 for angivne sammenligninger ved Friedmans test efterfulgt af Dunns post-tests. (C, E) co-ekspression matrixer af kategoriske NF-KB-underenhed ekspressionsniveauer i tumor (C) og stroma (E) områder. Til dette blev NF-KB scores fra (B) og (D) kategoriseret i lav (0-4), mellemprodukt (5-6), og høj (7-18). ns: P 0,05 og P: sandsynlighed værdier ved χ

2 test efterfulgt af Fishers eksakte test. (F) co-ekspression matrixer af tumor versus stroma NF-KB underenhedsekspression. ns: P 0,05 og P: sandsynlighed værdier ved χ

2 test efterfulgt af Fishers eksakte test. (G) Korrelation af tumor og stroma P100 /P52 udtryk scoringer. Vist er datapunkter, lineær regressionslinje med 95% konfidensinterval, kvadreret Spearmans korrelationskoefficient, og sandsynligheden værdi.

Korrelation af Rel subunit udtryk med cellulær proliferation og inflammatoriske infiltration

Siden NF-KB er mekanistisk impliceret i proliferationen og inflammatorisk signalering af lunge tumorceller i musemodeller [21-24], forsøgte vi at bestemme graden af ​​cellulær proliferation og inflammatorisk infiltration i vores 77 patienter med NSCLC. Til dette blev der serielle snit underkastet PCNA immunfarvning som ovenfor, med samtidig hematoxylin farvning af isotype kontrol sektioner, og procentdelen af ​​PCNA-positive celler i tumor områder blev vurderet som et mål for cellulær proliferation rate. Endvidere blev procentdelen af ​​tumor-infiltrerende PCNA-negative inflammatoriske celler i stroma områder bestemt for hver patient (fig 3A). Disse analyser identificerede, at selv om ekspressionsniveauer af

Rel

A i tumor områder var ganske lav, de blev forhøjet i tumorer med høje niveauer af inflammatorisk infiltration (fig 3B). Selv procentdelen af ​​PCNA-positive celler ikke var forskellig mellem de forskellige histologiske undertyper (fig 3C), og var ikke forbundet med ekspressionen af ​​enhver NF-KB-underenhed (data ikke vist), dobbelt immunofluorescens for

Rel

A eller

Rel

b kombineret med PCNA afslørede, at PCNA + prolifererende celler overvejende udtrykt

Rel

b i deres kerne (fig 3D). Disse data viste, at tumor

Rel

En udtryk var forbundet med inflammatorisk infiltration, og at tumor

Rel

B udtryk var forbundet med cellulær proliferation inden for hver tumor. Da

Rel

B udtryk har vist sig at være reguleret af både den kanoniske samt de alternative NF-KB veje, vi næste forsøgt at undersøge en mulig sammenhæng mellem

Rel

En udtryk i tumor eller stroma rum, og

Rel

B udtryk i tumorceller. Men ingen statistisk signifikant korrelation blev fundet, da data blev vurderet enten i en parametrisk eller en ikke-parametrisk mode, tyder på, at tumor

Rel

A og

Rel

B udtryk forekommer uafhængigt i NSCLC.

(A) Repræsentative billeder af hæmatoxylin-farvede prøver viser forskellige grader af inflammatorisk infiltration af stroma områder. (B) NF-KB underenhedsekspression snesevis af tumorer med varierende grader af inflammatorisk infiltration. Data præsenteret som median med bokse angiver interkvartile område og whiskers angiver 95% percentiler. ns, ** og ***: P 0,05, P 0,01, og P 0,001 for angivne sammenligninger ved Kruskal-Wallis tests efterfulgt af Dunns post-tests. (C) Repræsentative billeder af PCNA-farvet NSCLC subtype prøver. (D) Nuclear co-lokalisering af PCNA immunreaktivitet med

Rel

B (pile), men ikke med

Rel

A, blev identificeret ved hjælp af dobbelt immunfarvning af prøver af 10 patienter (repræsentative billeder vist) .

Foreningen af ​​NF-κΒ subunit udtryk med kliniske og patologiske funktioner i NSCLC

Vi næste undersøgt, om NF-KB-underenhed udtryk i tumor og stroma rum er korreleret med klinisk og patologisk træk ved vores patienter med NSCLC. Til dette, analyser korrelation blev gjort, som afslørede ingen signifikante associationer (data ikke vist). NF-KB scoringer blev yderligere opdelt i henhold til kliniske og patologiske træk og undergrupper blev sammenlignet (figur 4A). Den stroma score på P100 /P52 var signifikant lavere i godt differentierede tumorer, sammenlignet med lave eller moderat differentierede dem. Desuden blev stromal P100 /P52-ekspression nedsat hos patienter med N2 sygdom, sammenlignet med patienter uden lymfatisk engagement. Ingen andre signifikante forskelle blev konstateret med hensyn til intratumoral stromale ekspression af nogen anden underenhed. Når tumor området NF-KB scoringer blev undersøgt på denne måde,

Rel

A viste sig at blive udtrykt ved højere niveauer hos mænd sammenlignet med kvinder, hos patienter over 65 år sammenlignet med yngre, og hos patienter med skællede celle karcinom sammenlignet med adenocarcinom. Vigtigere, blev tumor P50 scoringer forhøjet hos patienter med N2 og pTNM6 stadium III sygdom sammenlignet med patienter uden lymfe engagement og stadie II-sygdom, hhv. Endelig blev tumor P100 /P52 udtryk statistisk signifikant øget hos patienter med pTNM6 stadie II-sygdom i forhold til patienter med stadium I sygdom. I et tredje niveau af undersøgelserne blev kliniske og patologiske NSCLC funktioner dikotomiseret ved deres median og var opført som pårørende til binær logistisk regression analyser, ved hjælp af tumor og stromale NF-KB scores som input (uafhængige) variable (Fig 4B). Disse analyser viste, at tumor

Rel

En score var en uafhængig prædiktor for 65 år eller ældre, af pladecellekræft histologi, og inflammatorisk infiltration. Interessant tumor og stroma

Rel

B-ekspression blev identificeret som positive og negative prædiktorer for kirtelinvolvering hhv. Endelig blev tumor P50 score fundet at være en uafhængig markør for dårlig differentiering og pTNM6 fase IIB eller højere. Derfor adskiller NF-KB-underenhed (

Rel

B og P50, men ikke

Rel

A) udtryk var forbundet med fremskreden sygdom, og distinkte NF-KB-subunits var forbundet med definerede funktioner i NSCLC, validering vores integrerede tilgang.

(A) NF-KB ekspressionsniveauerne opdelt af kliniske og patologiske parametre. Data præsenteret som median med bokse angiver interkvartile område og whiskers angiver 95% percentiler. ns, *, og **: P 0,05, P 0,05, og P 0,0501 for angivne sammenligninger ved Wilcoxon signed rank test eller Kruskal-Wallis tests efterfulgt af Dunns post-test, for to eller flere sammenligningsgrupper, hhv. (B) Resultater af binær logistisk regression analyser bruger NF-KB subunit udtryk scores som input (uafhængige variable) og dikotomiseret kliniske og patologiske parametre som output (afhængige variable). RR, risiko- nøgletal; CI, konfidensintervaller; P, sandsynlighed værdier.

NF-κΒ underenhedsekspression i musemodeller af NSCLC

Vi endelig forsøgt at kontrollere, om vores resultater også kunne sammenfattet i to forskellige musemodeller af menneskelig NSCLC , nemlig den model af urethan-induceret pulmonal adenom og af mutant

KRAS

induceret pulmonal adenocarcinom. Analyser, udfærdiget som for humane prøver, identificeret som

Rel

B blev overudtrykt i urethan-induceret hyperplastiske læsioner, men ikke i adenomer. Desuden

Rel

, B blev overudtrykt i både mutant

KRAS

inducerede hyperplastiske læsioner og adenokarcinomer (Fig 5). Disse fund var i overensstemmelse med de humane data, der viser fokal overekspression af

Rel

B i tumor områder af humant NSCLC (figur 2).

NF-KB-underenhed ekspression blev vurderet ved immunohistokemi i urethan-induceret mus lungeadenomer (A og C) og mutant

KRAS

inducerede lunge adenokarcinomer (B og D). (A, B) et repræsentativt udvalg. (C, D) Samlet scoring af NF-KB-underenhed ekspressionsniveauer fra fire mus per gruppe. Data præsenteret som gennemsnit ± SD. ** Og ***: P 0,01, og P 0,001 for den angivne farvekodede underenhed sammenlignet med den normale bronchiale og alveolær epitel via tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-test. Ikke-signifikante sammenligninger er ikke angivet.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi karakteriserede udtryk og den subcellulære lokalisering af flere NF-KB underenheder i human NSCLC og eksperimentelle modeller for sygdommen. Vi fandt forskellige mønstre af immunoreaktivitet for hver af de undersøgte underenheder, begrunder vores integrerede tilgang. I specifikke,

Rel

B blev stærkt udtrykt i tumorceller, mens

Rel

A og P50 i stromale celler. Interessant, tumor

Rel

En udtryk var korreleret med inflammatorisk infiltration og tumor

Rel

B-ekspression blev collocalized med prolifererende tumor cellekerner. Disse resultater var i overensstemmelse med binær logistisk regression analyser, afslørede, at tumor

Rel

En udtryk var en uafhængig prædiktor for inflammatoriske infiltrater, mens tumor

Rel

B immunoreaktivitet forudsagt mere fremskreden sygdom med lymfeknudeinvolvering. Endelig dette mønster af fremherskende

Rel

B udtryk i menneskelig NSCLC blev sammenfattet i musemodeller af sygdommen. Kollektivt, vores resultater tyder en multimodal aktivering af NF-KB i NSCLC og eventuelt foreslå afvigende funktioner for

Rel

A og

Rel

B i kørsel parakrin induktion af inflammation og celle-autonome eller autokrin fremme af cellulær proliferation, (fig 6).

NF-KB-underenhed ekspressionsniveauer i tumorceller og stromaceller fra 77 patienter med NSCLC er angivet med relativ skriftstørrelse.