PLoS ONE: Iberis amara Uddrag inducerer Intracellulær Dannelse af reaktive oxygenarter og Hæmmer Colon Cancer

Abstrakt

Massively stigende globale forekomst af kolorektal cancer kræver effektive behandling og forebyggelsesstrategier. Her rapporterer vi uventede anticancerogenic virkninger af Hydroethanoliske

Iberis amara

ekstrakt (IAE), der er kendt som en meget brugt phytomedical produkt til behandling af gastrointestinale klager. IAE inhiberede signifikant proliferationen af ​​HT-29 og T84 coloncarcinomceller med en inhibitorisk koncentration (IC

50) af 6 og 9 ug /ml, og yderligere genererede inhibitoriske virkninger i PC-3 prostata og MCF7 brystcancerceller . Inhibering af proliferation i HT-29-celler var forbundet med en G2 /M-fase-cellecyklusstandsnings herunder reduceret ekspression af forskellige regulatoriske markørproteiner. Især i HT-29-celler IAE yderligere induceret apoptose ved intracellulær dannelse af reaktive oxygenarter (ROS). I overensstemmelse med forudsigelser afledt fra vores

in vitro

eksperimenter, BiDaily oral gavage på 50 mg /kg af IAE over 4 uger resulterede i signifikant inhibering af tumorvækst i en mus HT-29 tumor xenograft model. Tilsammen

Iberis amara

uddrag kunne blive nyttige alternativer til forebyggelse og behandling af udviklingen af ​​tyktarmskræft

Henvisning:. Weidner C, Rousseau M, Plauth A, Wowro SJ, Fischer C, Abdel -Aziz H, et al. (2016)

Iberis amara

Uddrag inducerer Intracellulær Dannelse af reaktive oxygenarter og Hæmmer tyktarmskræft. PLoS ONE 11 (4): e0152398. doi: 10,1371 /journal.pone.0152398

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: April 23, 2015; Accepteret: 14. marts 2016 Udgivet: April 6, 2016

Copyright: © 2016 Weidner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning (BMBF, tildele numrene 0315082, 01EA1303). Forfatter HAA blev støttet af Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH i form af løn. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Heba Abdel-Aziz er ansat af Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH, et selskab, der sælger phytomedical produkter . Heba Abdel-Aziz og de andre forfattere har erklæret nogen potentiel interessekonflikt. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform globalt og den fjerde hyppigste årsag til kræft -relaterede død [1]. CRC regnskab for 1-2 millioner nye tilfælde og mere end 600.000 dødsfald om året [1]. Den globale forekomst af CRC er støt stigende og synes at være forbundet med en vestlig livsstil [1].

Effektiv terapi af CRC er hæmmet af reduceret overholdelse screening anbefalinger, sent tidspunkt diagnose af nye CRC tilfælde, svær terapi toksicitet, lægemiddelresistens og cancer tilbagefald [2, 3]. For at overvinde disse begrænsninger er nødvendige nye metoder til effektiv forebyggelse og behandling af CRC, herunder komplementering af stærk cytotoksisk eller målrettet medicinsk behandling, for eksempel ved hjælp af sikre fytoterapeutiske alternativer [4].

Generelt pools af naturlige stoffer sådanne som flavonoider, phenolsyrer, polyphenoler og terpenoider kan modulere flere molekylære veje, der er involveret i patobiologien af ​​komplekse sygdomme. Navnlig plantebaserede sammensatte blandinger generelt provokere lave toksiske bivirkninger [5]. Nylige undersøgelser har vist, at milde urteekstrakter reducerer cancercellevækst, ved at inducere apoptose og frembringe synergistiske virkninger i CRC. For eksempel, ekstrakter fra grøn te, vindruer, ingefær, gurkemeje, soja og hvidløg [4], kamille [6] eller melissa officinalis [7, 8] blev rapporteret til at udøve sundhedsfremmende gavnlige virkninger.

Iberis amara

(også kaldet bitter candytuft) tilhører familien

Brassicaceae

, og er almindelig i det centrale og sydlige Europa [9]. Her har vi analyseret et godt valideret og godkendt Hydroethanoliske ekstrakt af

Iberis amara

(IAE), der rutinemæssigt anvendes til gastrointestinal brug.

IAE udøvede overraskende stærk antiproliferativ og apoptotisk aktivitet, for eksempel i coloncarcinomceller. Disse antitumorale virkninger blev forårsaget af intracellulær dannelse af reaktive oxygenarter (ROS), hvorimod quenching af ROS ved antioxidanter beskyttede cancerceller fra apoptose. Især anvendelse af IAE i en xenograft musemodel resulterede i effektiv hæmning af tumorvækst

in vivo

, som godtgør, at IAE kunne med fordel anvendes til forebyggelse og supplerende behandling af tyktarmskræft.

Materialer og metoder

Materialer

Kemikalier blev indkøbt fra følgende kilder: staurosporin (STN) og irinotecan (IRI) fra LKT Laboratories (Biomol), oxaliplatin (OX) fra Cayman Chemical (Biomol, Hamburg , Tyskland). Paclitaxel (PTX), 5-fluorouracil (5-FU), menadion (MD), tert-butylhydroperoxid (TBHP), N-acetylcystein (NAC), glutathion (GSH), 3H-1, 2-dithiol-3- thion (D3T), α-tocopherol (α-TOC) og ascorbinsyre (AA) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Tyskland). Hydroethanoliske

Iberis amara

ekstrakt (IAE) er en industriel, valideret Hydroethanoliske (31% v /v) ekstrakt fra Steigerwald Arzneimittelwerk (Darmstadt, Tyskland). Ekstrakten blev frembragt ifølge en standardprocedure. Kvalitet blev kontrolleret ved hjælp af HPLC fingeraftryk, og indholdet af ekstrakten blev bestemt nøjagtigt som beskrevet tidligere i detaljer [10].

Cellekultur

Humant HT-29 (ACC-299 , DSMZ, Braunschweig, Tyskland) og T84 kolorektal cancer-celler (CCL-248, ATCC, LGC Promochem, Wesel, Tyskland) blev dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium /Nutrient Blanding F-12 (DMEM /F-12, # 11.330-057 , Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS, Biochrom, Berlin, Tyskland) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Biochrom). HT-29 celler blev etableret fra den primære tumor af en 44-årig kaukasisk kvinde med colon adenocarcinom; T84-celler blev isoleret fra en lunge metastase af en coloncarcinom i en 72-årig mand. PC-3 prostatacancerceller (CRL-1435, ATCC) blev dyrket i RPMI 1640 (Biochrom) suppleret med 10% FBS og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. MCF7 brystcancerceller (HTB-22, ATCC) blev dyrket i DMEM GlutaMAX (Gibco, Life Technologies) suppleret med 10% FBS, 10 ug /ml human insulin (Sigma Aldrich) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin . CCD 841 con primære kolon celler (CRL-1790, ATCC) blev dyrket i DMEM Glutamax (Life Technologies) indeholdende 10% FBS. Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Cellerne blev behandlet ved hjælp Hydroethanoliske IAE, angivet forbindelser opløst i DMSO, eller tilsvarende kontroller køretøjer.

Behandlinger af celler med IAE var især optimeret med hensyn til koncentration og behandlingstider, som varierede afhængig af biologiske respons og markører anvendt til detektion.

proliferationsassay

proliferation af cancerceller blev bestemt ved anvendelse af CyQUANT NF Cell Proliferation assay Kit (Life Technologies). Til dette formål HT-29, T8, PC-3 og MCF7 cancerceller og normale CCD 841 Con celler blev podet i sorte 384 brønde (# 3712, Corning, Fisher Scientific, Schwerte, Tyskland) med en densitet på 750 celler /brønd (HT-29), 900 celler /brønd (T84), 250 celler /brønd (PC-3), 900 celler /brønd (MCF7) og 900 celler /brønd CCD 841 con primære colonceller henholdsvis i et endeligt volumen på 50 pl /brønd. Celler blev derefter behandlet med koncentrationen række forbindelser ved tilsætning af 10 pi af en 6-fold stock koncentration. Efter 72 h (HT-29, PC-3) og 96 timer (T84, MCF7, CCD 841 con) behandling henholdsvis det relative antal af celler blev bestemt ved måling af cellulært DNA-indhold under anvendelse af fluorescerende CyQUANT farvestof ifølge producentens instruktioner. For samtidig behandling med antioxidanter, blev behandlingstiden reduceret til 48 h. Fluorescensintensitet blev målt under anvendelse af POLARstar Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland) og transformeret til andelen af ​​celler. For koncentration serie blev data monteres med GraphPad Prism 5,0 ifølge ligning: Y = Top + (Bund-Top) /(1 + 10 ^ ((logisk

50-X) * HillSlope)) med variabel Hill hældning. Effektivitet er den maksimale observerede induktion af celledød (100% Bunden) i forhold til ikke-behandlede celler (indstillet til 0%).

Cell cyklus analyse

Modulation af cellecyklussen blev bestemt i HT -29 celler behandlet med 30 ug /ml IAE i 24 timer. Efter trypsinisering celler blev fikseret i 70% ethanol og inkuberet på is i 15 min. Celler blev derefter mærket med propidiumiodid (PI) /RNase farvningsopløsning (# 4087, Cell Signaling Technology, New England Biolabs, Frankfurt am Main, Tyskland) og yderligere inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur. Fikserede celler blev frosset ved -20 ° C før analyse. Endelig blev cellerne analyseret under anvendelse af FACS Aria II flowcytometer (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Dataanalyse blev udført ved hjælp FlowJo 7.6 (Tree stjerne), og cellecyklus stater blev tildelt ved hjælp af implementeret Dean-Jett-Fox model. Histogrammer blev visualiseret ved GraphPad Prism 5.0. Bemærk, at denne analyse i vores hænder var desværre ineffektiv, når du bruger alternative kolon-afledte T84 celler på grund af vanskeligheder med at opnå et betydeligt antal enkelte celler. Dette problem blev endda steg i fiksering, hvilket resulterer i at akkumulere T84 celler (f.eks dubletter), hvilket gjorde dataanalyse af forskellige cellecyklus hedder umuligt i praksis.

Immunoblotting

Celler blev lyseret i 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1% SDS med proteasehæmmere (Roche Diagnostics) og phosphatase-inhibitorer (Sigma Aldrich), og sonikeret (ved anvendelse af en enhed fra Bandelin elektronisk, Berlin, Tyskland). Efter centrifugering ved 10.000 g i 10 minutter blev supernatanter opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Prøver blev denatureret og separeret ved anvendelse af NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris proteingeler (Life Technologies) og blottet på Hybond ECL nitrocellulosemembraner (GE Healthcare, Freiburg, Tyskland). Membraner blev blokeret med 5% mælkepulver i 0,1% Triton X-100 /TBS (TBS-T, pH 7,6) ved stuetemperatur i 1 time og efterfølgende vasket i TBS-T (0,1%). Primære antistoffer mod cyclin A2 (# 4656), cyclin D3 (# 2936), CDK 2 (# 2546), CDK 4 (# 2906), CDK 6 (# 3136), caspase 3 (# 9665), spaltet caspase 3 (# 9664), caspase 9 (# 9502), spaltet caspase 9 (# 9501), PARP (# 9542), spaltet PARP (# 5625), p18 (# 2596), p21 (# 2947, alle fra Cell Signaling Technology), og GAPDH (# sc-48167, Santa Cruz) blev fortyndet i TBS-T (0,1%) med mælkepulver og BSA, henholdsvis ifølge fabrikantens protokoller. Membraner blev rystet ved 4 ° C natten over, derefter vasket med TBS-T (0,1%) og inkuberet med anti-kanin IgG-HRP (# sc-2004), anti-muse-IgG-HRP (# sc-2005) og anti gede-IgG-HRP (# sc-2020 alle Santa Cruz), henholdsvis i overensstemmelse med producentens anvisninger. Proteiner blev påvist ved anvendelse af Western Lightning ECL-opløsning (Perkin Elmer, Rodgau, Tyskland). Membraner blev strippet med Restore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) i 7 min ved stuetemperatur. Densitometriske analyser blev udført ved hjælp af FUSION-SL Advance 4.2 MP System (Peqlab, Erlangen, Tyskland).

Caspase aktivering

Aktivering af caspaser 2, 3/7, 6, 8 og 9 var undersøgt under anvendelse af de luminometriske Caspase-Glo assays (Promega, Mannheim, Tyskland). Kort fortalt, en dag før behandling HT-29-celler blev podet i sorte 384-brønds plader (# 3712, Corning) med en tæthed på 2.000 celler /brønd i et slutvolumen på 20 ul /brønd. Cellerne blev derefter behandlet i 24 timer med 60 ug /m IAE, 10 uM staurosporin eller køretøj alene. Luminescens blev målt i overensstemmelse med producentens instruktioner ved anvendelse af POLARstar Omega (BMG Labtech).

DNA fragmentation assay

BrdU-mærkede DNA-fragmenter i cytoplasmaet af behandlede HT-29-celler blev kvantificeret under anvendelse af cellulært DNA Fragmentation ELISA-kit (Roche Diagnostics). Kort fortalt blev HT-29-celler podet i 96-brønds plader (TPP) med en densitet på 13.000 celler /brønd i nærvær af 10 uM 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) og inkuberet i 2 dage ved 37 ° C. Supernatanten blev fjernet, og cellerne blev behandlet i 6 timer med IAE, STS eller køretøj som angivet i den tilsvarende resultater figur. De cytosoliske fraktioner blev høstet og analyseret på en 96-brønds halv-område klar high-bindende mikroplade (# 3690, Corning). Cellefri prøver blev anvendt som baggrund kontrol for subtraktion, og data blev normaliseret til bærerbehandlede celler.

Phosphatidylserin eksternalisering (annexin V) assay

eksternalisering af phosphatidylserin blev analyseret ved hjælp af annexin- V-FLUOS Staining kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev HT-29 og T84 celler behandlet som angivet i de tilsvarende resultater figur og efterfølgende mærket med Annexin-V-FLUOS og propidiumiodid. Flowcytometri blev udført under anvendelse af Accuri C6 (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Data blev analyseret ved anvendelse FlowJo 7,6 (Tree stjerne). For bar plot præsentation, apoptose omfattede tidligt (annexin positiv, PI negativ) og sen fase apoptotiske begivenheder (annexin positiv, PI positiv).

Påvisning af reaktive ilt arter (ROS)

Dannelse af ROS blev påvist under anvendelse af ROS-sensitive CellROX Orange probe (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Denne celle-gennemtrængende farvestof er ikke-fluorescerende i en reduceret tilstand og udviser klart orange fluorescens ved oxidation. CellROX Orange blev valgt til måling af ekstracellulære samt intracellulære ROS fordi dette farvestof er kompatibel med fuld mediebetingelser og kræver ingen cellulær aktivering. Til påvisning af ekstracellulært ROS blev CellROX Orange fortyndet til en slutkoncentration på 10 uM i fuld celledyrkningsmedium, og IAE og testforbindelser blev tilsat som indikeret i den tilsvarende resultater figur. Måling blev udført i sorte plader med 96 brønde (# 655.090, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland) i et endeligt volumen på 150 pl /brønd. At øge assayfølsomhed, blev farvestoffet beskyttet mod atmosfærisk oxygen ved at tilføje et forseglingslag på 100 pi mineralsk olie (Luxcel Biosciences, Cork, Irland) til hver brønd. Fluorescensintensitet (529/590 nm) blev registreret i 24 timer ved 37 ° C ved hjælp af POLARstar Omega (BMG Labtech). Fluorescens værdier ved tiden nul blev trukket for data-analyser ved hjælp af GraphPad Prism 5.0. Til påvisning af intracellulære ROS blev HT-29-celler podet i 12-brønds plader (TPP, Biochrom) med en densitet på 250.000 celler /brønd én dag før behandling. Efter behandling med IAE, MD eller vehikel blev cellerne trypsineret og derefter vasket med PBS. Pelleterede celler blev resuspenderet i 1 ml af 5 uM CellROX Orange i PBS og inkuberet i 20 minutter ved 37 ° C. At fjerne ikke-inkorporeret farvestof blev cellerne vasket og resuspenderet igen i PBS før flowcytometri detektion (ved anvendelse af en Accuri C6-enhed). Data blev analyseret ved hjælp FlowJo 7.6 (Tree stjerne) og GraphPad Prism 5.0.

Påvisning af lipidperoxidation

Dannelse af cellulære lipid peroxider blev undersøgt ved hjælp af Click-iT lipidperoxidation assay (Life Technologies ). Dette assay gør brug af linoleamide alkyn (LAA, alkyn-modificeret linolsyre), der samles med cellulære membraner. LAA kan oxideres resulterer i alkyn-modificerede proteiner, der kan mærkes ved anvendelse af et azid-modificeret Alexa Fluor 488 farvestof gennem kobber-katalyseret klik kemi. Således detekteres stigende fluorescensintensiteter som følge af bedre lipidperoxidation efter behandling. En dag før behandling HT-29-celler blev podet i 12-brønds plader med en densitet på 250.000 celler /brønd. Cellerne blev derefter behandlet i 24 timer med IAE eller menadion i tilstedeværelse af 50 uM LAA. Efter trypsinisering blev cellerne vasket med PBS og fikseret i 3,7% formaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Celler blev vasket i PBS igen, permeabiliseret ved anvendelse af 0,5% Triton X-100 i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter blokeret ved tilsætning af 1% BSA i 30 minutter ved stuetemperatur. Resterende BSA blev fjernet ved fuldt vask af cellerne med PBS. Pelleterede celler blev inkuberet med 500 pi Click-iT reaktion cocktail i 30 minutter ved stuetemperatur ifølge fabrikantens protokol. Click Reaktionen blev standset ved tilsætning af 1% BSA /PBS. Cellerne blev igen vasket og resuspenderet med PBS. Flowcytometri blev udført under anvendelse af Accuri C6-enheden. Data blev analyseret ved hjælp FlowJo 7.6 (Tree stjerne) og GraphPad Prism 5.0.

Fluorescens mikroskopi

Til visualisering af lipidperoxidation hjælp af Click-iT lipidperoxidation metode HT-29-celler blev podet på 13 mm dækglas placeret i 24-brønds plader med en densitet på 125.000 celler /brønd én dag før behandling. Celler blev behandlet i 24 timer med IAE eller menadion i nærvær af 50 uM linoleamide alkyn (LAA). Bagefter blev adhærerende celler vasket med PBS og fikseret i 3,7% formaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Celler blev vasket i PBS, permeabiliseret ved anvendelse af 0,5% Triton X-100 i PBS (PBS-T) i 10 minutter ved stuetemperatur og blokeret ved tilsætning af 1% BSA i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS, 250 pi Click-iT reaktionen cocktail sattes ifølge producentens protokol, og cellerne blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktioner blev stoppet ved vask med 1% BSA i PBS, og cellerne blev igen vasket med BSA-frit PBS. Dækglas blev endelig modfarvet med forlænge Gold antifade Mountant opløsning (indeholdende DAPI) og inkuberet i 24 timer ved stuetemperatur. Fluorescens mikroskopi blev udført ved anvendelse af et LSM700 instrument (Zeiss, Jena, Tyskland).

Til påvisning af spaltet PARP blev HT-29-celler podet på 13 mm dækglas (Sarstedt, Nürnbrecht, Tyskland) og anbragt i plader med 24 brønde (Nunc, Wiesbaden, Tyskland) med en densitet på 125.000 celler /brønd én dag før behandling. Celler blev behandlet i 24 timer med IAE eller testforbindelser, vasket med PBS, og endelig fikseret i 4% formaldehyd /PBS i 15 min. Celler blev permeabiliseret i 0,3% Triton X-100 /PBS (PBS-T) i yderligere 10 minutter ved stuetemperatur og derefter blokeret i 5% gedeserum (Sigma Aldrich) i PBS-T (0,3%) i 60 min ved stuetemperatur . Bagefter blev cellerne inkuberet natten over ved 4 ° C med et primært antistof mod spaltet PARP (# 5625, Cell Signaling Technology), som blev fortyndet (1: 200) i 1% BSA /PBS-T (0,3%). Celler blev vasket med PBS-T (0,3%) og mærket med anti-kanin IgG (H + L), F (ab ‘) 2-fragment Alexa Fluor 488 konjugat (# 4409, Cell Signaling Technology) fortyndet (1: 1.000) i 1% BSA /PBS-T (0,3%) i 1 time ved stuetemperatur.

F-actin blev farvet med Texas Red-X phalloidin (Life Technologies) i 30 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev dækglas modfarvet ved anvendelse forlænge Gold antifade Mountant opløsning (indeholdende DAPI) og inkuberet i 24 timer ved stuetemperatur. Fluorescens mikroskopi blev udført ved hjælp af en LSM700 enhed (Zeiss, Jena, Tyskland).

cytotoksicitet assay

For at undersøge effekten af ​​IAE på celle-levedygtighed i tyktarmskræft og primære celler, vi anvendte den CytoTox-Glo Cytotoksicitetsassay (Promega, Mannheim, Tyskland), som beskrevet for nylig [11]. Derfor blev HT-29, og CCD 841 Con celler udsået i sorte 384 brønde (# 3712, Corning, Wiesbaden, Tyskland) med en densitet på 5000 celler /brønd i et slutvolumen på 25 ul /brønd. Cellerne blev behandlet i 24 timer med koncentration række IAE ved tilsætning af 10 pi af en 3,5-fold koncentration af stamopløsning. Efter behandling luminescens blev målt ved anvendelse af POLARstar Omega indretning (BMG Labtech). Levedygtighed blev beregnet ved subtraktion af døde celler luminescens fra total luminescens værdier. Data blev monteret ved hjælp af GraphPad Prism 5,0 ifølge ligning:. Y = Bund + (Top-bund) /(1 + 10 ^ ((X-LogIC50))

Tumor xenograft undersøgelse

Til studere

in vivo

effekt af IAE til behandling human CRC blev en tumorvækstinhibering undersøgelse udført under anvendelse af HT-29 tumor xenograft musemodel. undersøgelsen blev godkendt den 13. august

th 2014 ved Charles River Discovery Research Services NC Animal Care og brug Udvalg og udført af Charles River Discovery Research Services (Morrisville, NC, USA). dyrevelfærd af Charles River Discovery Research Services blev godkendt af den amerikanske Office of Laboratory Animal Welfare den 14. december

th 2011 for tidsperioden mellem 14 2011 December indtil den 31. oktober

st 2015 (identifikationsnummer A4358-01). undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Charles River Discovery Research Services NC og US Public Health service politikker og retningslinjer (dyreforsøg protokol nummer:. # 980.702) Kort fortalt 36 kvindelige atymiske nøgen (NCR nu /nu) mus blev implanteret med 5 millioner HT-29 celler subkutant i flanken. På dagen for inokulering blev musene tilfældigt inddelt i to grupper (n = 18), og oralt tvangsfodret BiDaily i 4 uger med 50 mg /kg IAE i deioniseret vand eller med kun vehikel. Tumor volumener og kropsvægt blev overvåget under hele forsøget ved Charles River Discovery Research Services og dokumentation af data blev sendt til forfatterne af denne artikel for dataanalyse. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev tumorer indsamlet, vejet og opbevaret ved -80 ° C før yderligere analyser. Blod blev opsamlet ved terminal hjertepunktur under isofluran anæstesi, og serum blev analyseret ved klinisk kemi test ved Charles River.

Statistiske analyser

Data er udtrykt som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM) hvis ikke andet er angivet. Statistiske tests blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism 5.0. Til sammenligning af to grupper statistisk signifikans blev undersøgt ved uparret to-halet t-test, medmindre andet er angivet. For multiple sammenligninger data blev analyseret ved envejs ANOVA med efterfølgende Dunnetts slutværdierne. En

s Drømmeholdet værdi ≤ 0,05 blev defineret som statistisk signifikant.

Resultater

IAE hæmmede spredning af kræftceller og inducerede G2 /M-cellecyklusstandsnings

at undersøge virkningerne af IAE på proliferationen af ​​colorektal cancer, blev HT-29 og T84-celler behandlet med koncentrationen række IAE i 72 og 96 timer (afhængig af varierende tid, der kræves for celleproliferation af HT-29 og T84-celler), henholdsvis. Celleproliferation blev bestemt ved måling af cellulært DNA-indhold. IAE inhiberede proliferationen af ​​HT-29 og T84 coloncarcinomceller i en koncentrationsafhængig måde med IC

50 værdier (middelværdi ± SD) af 6 ± 1 ug /ml (Fig 1A) og 9 ± 1 ug /ml ( fig 1B) henholdsvis.

Inhibering af proliferation af HT-29 coloncancer-celler (A), T84 coloncancerceller (B), PC-3 prostatacancerceller (C), MCF7 brystcancerceller (D ) og normal CCD 841 con (kolon) celler (E) efter behandling med IAE og en lille panel af lægemidler mod cancer (nemlig irinotecan, 5-FU og oxiliplatin). Celler blev behandlet med koncentrationen række IAE og forbindelser i 3 dage (A og C) og 4 dage (B og D, E), henholdsvis. Det relative antal celler blev bestemt ved måling af cellulært DNA indhold via fluorescerende farvestof binding. Data er udtrykt som middelværdi ± SD (n = 4).

I den indledende fase af undersøgelsen, vi desuden testet to ubeslægtede cancercellelinier modeller, nemlig PC-3 (prostata) og MCF7 (bryst ), til nogenlunde udelukke celle specifikke følger af IAE. I lighed med de to coloncancer modeller, IAE induceret hæmning af proliferation (IC

50 værdier på 44 ± 4 ug /ml (Fig 1C) i PC-3 og 11 ± 1 ug /ml (Fig 1D) i MCF7 cancerceller , henholdsvis). Disse resultater antydede, at virkningerne af IAE ikke var begrænset til colon carcinomceller.

Da cytotoksiske anticancerlægemidler irinotecan, 5-fluorouracil (5-FU) og oxaliplatin, viste IAE behandling effektiviteter mellem 70 og 80%, indikerer en fraktion på 20-30% stadig prolifererende cancerceller efter behandling (figur 1, tabel 1). Generelt IC

50 værdi på IAE var omkring én størrelsesorden højere end de anvendte forbindelser. Især i normale CCD 841 Con-celler (primær kolon celler, der stammer fra et spædbarn), blev proliferation hæmmet af IAE-og også med 5-FU og oxaliplatin-at IC

50 værdier, der var omkring en størrelsesorden lavere end for cancercellelinier (fig 1E og tabel 1). På den anden side, i forhold til kræftceller i primære colonceller hæmning effektiviteter var klart lavere, hvilket indikerer et højere antal stadig prolifererende normale colonceller sammenlignet med de testede colon cancerceller.

Cellulær proliferation er generelt forbundet med progressionen af ​​cellecyklussen [12]. Vi således spurgt, om de observerede antiproliferative virkninger af IAE er et resultat af ændringer i cellecyklusregulering. Vi behandlede HT-29 coloncarcinomceller med 30 ug /ml IAE i 24 timer og analyserede celler efter propidiumiodidfarvning ved flowcytometri. IAE behandling resulterede i signifikant akkumulering i G2 /M-fasen (40 vs. 24%) med ledsagende reduktion i G0 /G1 (35 vs. 58%) og S-fasen (9 vs. 14%, figur 2A). IAE yderligere øget antallet af celler i SubG1 fase (17 vs. 3%), hvilket indikerer induktion af apoptose i disse celler.

A, Cell cyklus blev analyseret ved flowcytometri propidiumiodid farvede celler. Histogrammer (øverst) viser et repræsentativt eksperiment for hver behandling tilstand. Bar plots (nederst) viser procent af cellepopulationen i apoptotisk SubG1, G0 /G1, S og G2 /M-faser af cellecyklus og er udtrykt som middelværdi ± SEM (n = 3). * P ≤ 0,05, *** p≤0.001 kontra kontrol. B, blev Helcellelysater analyseret for ekspression af cyclin A2, cyclin D3, CDK2, CDK4, CDK6 og GAPDH-proteiner ved immunblotting under anvendelse af specifikke antistoffer.

Desuden analyserede vi ekspressionen af ​​cellecyklusregulerende proteiner ved immunblotting. Overensstemmelse med flowcytometri data, IAE behandling reducerede ekspressionen af ​​cycliner A2 og D3, og de cyclinafhængige kinaser (CDK) 2, 4, 6 (Fig 2B). Samlet set de observerede ændringer i ekspressionen af ​​cellecyklus regulerende proteiner samt den observerede G2 /M anholdelse eventuelt redegøre for de celle væksthæmmende effekter af IAE i kolorektale cancerceller.

IAE behandling aktiverede caspaser, induceret DNA-fragmentering og resulterede i phosphatidylserin eksternalisering i coloncarcinomceller

Aktivering af caspase signalering netværk er et kendetegn for apoptose, der forbinder ydre og indre stimuli med nedstrøms apoptotiske begivenheder. For at kaste mere lys over virkningerne af IAE på det cellulære caspase signalering netværk, vi målte enzymatiske aktivering af et panel af caspaser hjælp luminometriske analyser. Behandling af HT-29-celler med 60 pg /ml IAE i 24 timer udviste ingen virkninger på caspaser 2 og 6. I HT-29-celler IAE behandling resulterede i en signifikant 3 gange forøgelse af aktiviteten af ​​effektor-caspaser 3 /7, svarende til anvendelsen af ​​10 uM staurosporin (STN, 4-fold forøgelse). Lignende virkninger kunne observeres ved hjælp af en alternativ (metastatisk) tyktarmskræft model (T84 celler), underbygger resultaterne stammer fra HT-29 celle model (figur 3A).

A, HT-29 og T84 celler behandlet i 24 timer. Enzymatisk aktivering af caspaser 2, 3/7, 6, 8 og 9 blev bestemt ved anvendelse af luminescens-assays. Data er normaliseret til at styre behandlingen og er udtrykt som gennemsnit ± SEM (n = 4). B, Helcellelysater fra HT-29-celler behandlet i 24 timer, blev analyseret for ekspression af totale og spaltede proteiner af caspase 3, caspase 9 og PARP ved immunoblotting. Tal angiver densitometriske forhold mellem det spaltede til totale proteiner normaliseret til kontrol behandlinger. C, Fluorescensmikroskopi af HT-29-celler behandlet i 24 timer. Spaltet caspase 3 blev mærket grønne, F-actin rød og kernen blå. Scale barer, 25 um. D, HT-29-celler blev behandlet i 6 timer. DNA-fragmentering blev påvist gennem akkumulering af cytoplasmatisk BrdU-mærket DNA ved ELISA. Data er normaliseret til at styre behandlingen og er udtrykt som gennemsnit ± SEM (n = 5). N.S. ikke signifikant, * p ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001 vs. kontrol.

Af note, IAE behandling øget aktivitet både caspase 8 og caspase 9, ca. 4-fold (fig 3A), hvilket indikerer induktion af den ydre (død receptormedieret), samt den intrinsiske (mitokondrie medierede) pathway af apoptose i HT-29-celler. Som påvist ved immunoblotting, vi desuden observeret induceret spaltning af effektor caspase 3, således samstemmende ovenfor detekteret aktivering. IAE behandling resulterede yderligere i omkring 9 gange øget spaltning af chromatin-associerede poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (Fig 3B). PARP-spaltning blev også valideret ved fluorescensmikroskopi (fig 3C). Da PARP vides at blive aktiveret ved DNA-skade, vi undersøgt yderligere virkningerne af IAE på DNA integritet. I overensstemmelse med PARP-spaltning, viste eksperimenter BrdU-mærkning forhøjede niveauer af cytosolisk DNA i HT-29-celler behandlet med 60 ug /ml IAE i 6 timer, hvilket indikerer apoptotisk DNA-fragmentering ved IAE behandling (fig 3D).

Hos raske celler phosphatidylserin (PS) er generelt begrænset til den indre blad af cellemembranen, og af phosphatidylserin på den ydre folder betragtes som et kendetegn for apoptose [13]. Vi således behandlede coloncarcinomceller med 60 ug /ml IAE i 48 timer og bestemt PS eksternalisering ved flowcytometri af annexin V-FLUOS /propidiumiodid-mærkede celler. IAE steg signifikant antallet af apoptotiske celler fra 6% til 22% i HT-29 (Fig 4A) og fra 43% til 53% i T84-celler (Fig 4B). Lignende observationer blev foretaget med lave doser af anticancerlægemidlet paclitaxel (5-50 nM) (figur 4). Samlet viser disse data, at IAE effektivt induceret apoptose i humane coloncancer-celler.

Annexin V assays af HT-29 (A) og T84 (B) coloncarcinomaceller efter behandling med IAE i 48 timer. Apoptose blev bestemt ved flowcytometri af annexin V-FLUOS og propidiumiodid farvede celler. Scatter plots viser et repræsentativt eksperiment for hver behandling tilstand. Bar plots angive den procentdel af apoptotiske celler, der omfatter tidlig (annexin positiv, PI negativ) og sent (annexin positiv, PI positive) begivenheder. Søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 3). * P ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001 vs. kontrol.

Bemærkelsesværdigt kræftceller har en ubalance af reaktive ilt arter (ROS). Da forhøjede koncentrationer af ROS kan inducere apoptose, kunne øge oxidativ stress til cancerceller være en lovende strategi til terapi [14].