PLoS ONE: høj forekomst af HPV-associeret hoved og hals kræft i FA Mangelfuld mus er associeret med E7 s Induktion af DNA-skader gennem sin Inaktivering af Pocket Proteins

Abstrakt

fanconis anæmi (FA) patienter er meget modtagelige til faste tumorer på mange anatomiske steder, herunder hoved- og halsområdet. En undergruppe af hoved og hals kræft (HNCs) er forbundet med ‘høj risiko’ HPV’er, især HPV16. Men sammenhængen mellem HPV onkogener og kræft i FA patienter er stadig uklart. Vi har tidligere erfaret, at FA mangel hos mus prædisponerer HPV16 E7 transgene mus til HNCs. For at løse HPV16 E6 s onkogent potentiale under FA-mangel i HNCs, udnyttede vi HPV16 E6-transgene mus (

K14E6

) og HPV16 E6 /E7-bi-transgene mus (

K14E6E7

) om genetiske baggrunde tilstrækkelig eller mangelfuld for en af ​​de

fancy

gener,

fancD2

og overvåges deres følsomhed over for HNCs.

K14E6

mus undladt at udvikle tumor. E6 og

fancD2

-deficiency accelererede imidlertid E7-drevet tumor udvikling i

K14E6E7

mus. Den øgede tumorincidens var mere korreleret med E7-drevne DNA-skader end spredning. Vi fandt også, at mangel på lomme proteiner, pRb, p107 og p130, der er veletablerede mål for E7, kunne rekapitulere E7 er induktion af DNA-skader. Vores resultater støtter den hypotese, at E7 inducerer HPV-associerede HNCs ved at fremme DNA skader gennem inaktivering af pocket proteiner, hvilket forklarer, hvorfor en mangel i DNA-skader reparation ville øge modtageligheden for E7-drevet kræft. Vores resultater viser yderligere det uventede fund, at FA-mangel ikke prædisponere E6 transgene mus til HNCs, hvilket indikerer en specificitet i synergien mellem FA-mangel og HPV onkogener i forårsager HNCs

Henvisning:. Park JW, Shin MK, Pitot HC, Lambert PF (2013) høj forekomst af HPV-associeret hoved og hals kræft i FA mangelfuld mus er associeret med E7 s Induktion af DNA-skader gennem sin Inaktivering af Pocket Proteins. PLoS ONE 8 (9): e75056. doi: 10,1371 /journal.pone.0075056

Redaktør: Joseph S Pagano, The University of North Carolina i Chapel Hill, USA

Modtaget: 15 juli, 2013; Accepteret: August 6, 2013; Udgivet: 23 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Kilden af midler til dette arbejde var National Institutes of Health (NIH) (CA098428, CA022443). NIH havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Fanconi anæmi (FA), som er en sjælden heterogen og recessiv genetisk sygdom, frembydes udviklingsmæssige defekter og abnormaliteter i hæmatopoietiske stamceller såsom knoglemarv fiasko og akut myeloid leukæmi, de store fænotyper vises i den tidlige barndom af patienterne . Til dato 15 cellulære gener (

fancy Salg gener) er blevet identificeret, for hvilke homozygote mutationer er associeret med FA sygdom.

fancy

genprodukter (fancy) sammensætter en DNA-reparation vej kaldet FA vej med flere andre cellulære proteiner for at hjælpe reparere beskadiget DNA, specifikt DNA interstreng-links (ICLs) skader. Otte af fancy proteiner (FancA, B, C, E, F, G, L og M) interagerer hinanden og danner et proteinkompleks kaldet FA kerne kompleks. FancL i komplekset, som har en

E3

ubiquitin-ligaseaktivitet sætte mono-ubiquitin på FancD2 /I i reaktionen af ​​DNA-beskadigelse [1]. Desuden gået i stå DNA-replikation gafler i S-fasen aktiverer FA pathway [2]. Mono-ubiquitineret FancD2 /jeg er lokaliseret til steder med DNA-skader, hvor de interagerer med andre proteiner er kendt for at være involveret i reparation af beskadiget DNA, såsom BRCA1, FancD1 /BRCA2, FancN /PALB2 og RAD51 fører til DNA-reparation [3, 4]. Forstyrrelse af denne FA sti fører til øget følsomhed over for DNA krydsbindere, kromosomal ustabilitet, spontan søsterkromatid ombytning, og cellecyklus forstyrrelser [5,6]. Nylige undersøgelser viste, at mono-ubiquitineret FancD2 rekrutterer kritiske effektormolekyler såsom ventilator1 nuclease (eller SLX4) via deres ubiquitin-bindende domæner [7,8]. Således mono-ubiquitinering af FancD2 er kritisk for ikke kun dens kromatin lokalisering men også virker som et stillads til specifikke DNA reparation faktorer. FA-vejen virker sammen med homolog rekombination reparationssystem (HR) for at opretholde genomisk ustabilitet [9]. Udtømning af FancD2 inhiberer HR respons, hvilket indikerer, at HR virker nedstrøms for FancD2 [10]. Øget genomisk instabilitet menes at bidrage til øget følsomhed af FA patienter til kræft. Hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) kunne være en løsning til at hjælpe de defekter i hæmatopoietiske celler. Selv efter vellykket HSCT, planocellulært karcinom (VKF) ved hoved og hals regioner bliver en stor risiko for patienterne [11-15].

En undergruppe af hoved og hals kræft (HNCs) (~ 25%) primært blandt tumorer fra oropharynx i den almindelige befolkning er positiv for humane papillomavira højrisikopatienter (HPV’er), navnlig HPV-type-16 (HPV16) koder for tre onkogenet, E5, E6 og E7 [16,17]. Navnlig FA patienter fra Nordamerika en høj procentdel (84%) af HNC opstår på forskellige steder i hoved og hals region (dvs. ikke begrænset til oropharynx) viste sig at være positiv for højrisiko-HPV’er [18]. I overensstemmelse med en rolle af HPV i disse kræftformer, mutationer i p53, en tumorsuppressor, som inaktiveres ved HPV16 E6, blev ikke fundet i HNCs fra disse patienter. Men hos patienter fra europæiske lande, HNCs var HPV-DNA-negative og over 50% af disse tumorer havde p53 mutationer [18,19]. På baggrund af disse modstridende kliniske data, er det fortsat uklart, om HPV’er spille en stor rolle i HNCs opstår i FA patienter. Flere undersøgelser peger på et bidrag på FA-mangel i HPV-associeret sygdom på molekylært niveau. I vævskultur blev HPV16 E7 udtryk vist sig at stimulere transskription af

fancD2

[20] og aktivere FA vej [21]. I en anden undersøgelse at gøre brug af organotypiske kulturer af humane keratinocytter til at rekapitulere HPV livscyklus blev HPV16 og HPV18-induceret epitelial hyperplasi steget i

fancA

deficiente celler eller i celler slået ned i sit udtryk; henviser til, at restaurering af

fancA

udtryk svækkede denne effekt [22]. Disse undersøgelser indikerer, at der er et samspil mellem HPV og FA-vejen.

Vores laboratorium udviklet en dyremodel for HPV-associerede HNCs vha HPV16 onkogen transgene mus, når de behandles med et kemisk carcinogen, 4NQO, som inducerer DNA-addukter beslægtet med dem, der forårsages af tobak-associeret kræftfremkaldende stoffer synergistisk med HPV16 onkogener at fremkalde HNC [23]. De kræftformer opstår i vores dyremodel aksjer histopatologisk og molekylære egenskaber med HPV-positive HNCs hos mennesker. Stedet, hvor tumorer opstå, er mindre restriktiv end i mennesker, formentlig reflekterende af mønstret for HPV transgenekspression hele musen oral /øvre GI epitel. Mellem E6 og E7, HPV16 E7 har større potentiale for at forårsage HNC i dyremodeller [23,24] med E6 bidrager til øget forekomst i kombination med E7 [25]. Bidrag HPV16 E5 til HNC i denne musemodel er ikke blevet fuldt evalueret, men ser ud til at være langt mindre end E7 (Strati og Lambert, upublicerede resultater).

Vi har tidligere vurderet indflydelse FA vej på forekomsten af ​​HNCs i mus, der udtrykker lige HPV16 E7 onkogen. Mangel i FA-vejen stærkt forøget HPV16 E7-drevet tumorincidens [26]. Men i HPV-positive menneskelige kræftformer, er E7 altid fundet, at co-udtrykkes sammen med E6. Derfor søgte vi undersøgelser beskrevet heri til adresse påvirkninger FA pathway i hoved og hals carcinogenese i forbindelse med mus, som udtrykker E6 alene eller sammen med E7. Konkret har vi genereret

K14E6

K14E6E7

transgene mus på

fancD2

-Tilstrækkeligt og deficiente baggrunde. Vi observerede en signifikant stigning i tumor forekomst og sværhedsgrad af neoplastisk sygdom i

K14E6E7

/

FancD2

– /- iBooked.dk mus sammenlignet med

K14E6E7

/

FancD2

+ /+

mus; dog

fancD2

-deficiency steg ikke enten udlæsning for tumorigenese i

K14E6

mus udtrykker E6 alene. Både HPV16 E6 og E7 forårsagede en stigning i hyppigheden af ​​celler, der understøtter DNA-syntese og dette blev forstærket på FA-manglende baggrund. Faktisk alene FA-mangel førte til en stigning i celleproliferation. Men denne induktion af celleproliferation korrelerede ikke med indflydelse af FA-vejen på tumorigenese. På den anden side, frekvens i epitel af tungen og spiserøret af γ-H2AX nuklear foci positive celler, en markør for DNA-skader reaktion, havde korrelerer med tumorincidens. Denne markør blev induceret i væv, som udtrykte E7 onkogen; henviser til, at havde E6 Fremkald ikke udtryk for denne markør af DNA skade responset. Desuden to biomarkører, MCM7 og p16, der anvendes til at skelne mellem HPV-positive HNCs fra HPV-negative HNCs viste sig at være yderst opreguleret i

K14E6E7

mus uanset

fancD2

gen status , hvilket indikerer, at de kunne være nyttige til bestemmelse af HPV status HNCs opstår i FA patienter. Endelig bemærkede vi, at mangel på ekspressionen af ​​lommen proteiner, pRb, p107 og p130, som er etableret mål for E7, kunne rekapitulere E7 er induktion af DNA-skader reaktioner i hoved og hals epitel. Vores nuværende undersøgelse understøtter den hypotese, at E7 inducerer HNC ved at fremme DNA skader gennem inaktivering af pocket proteiner. Disse data kan forklare, hvorfor mangel i FA vej øger modtageligheden for E7-drevet kræft.

Materialer og metoder

Mus

K14E6

transgene

mus

[27]

og K14E7

transgene mus [28] på FVB genetiske baggrund, blev krydset til

fancD2

knockout (

FancD2

– /- Salg) mus [29], på 129S4 genetiske baggrund, for at generere F

1 mus,

K14E6 /FancD2

+/-

og

K14E7 /FancD2

+/-

(FVB /129S4 blandet baggrund). Alle eksperimentelle mus (

NTG /FancD2

+ /+

,

NTG /FancD2

– /-,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, og

K14E6E7 /FancD2

– /-

mus) var mænd, der genereres af Krydsning F

1 mus.

K14Cre /Rb

f /f

,

Rb f

/f /

p130

– /-

, og

K14Cre /Rb

f /f /p130

– /-

blev genereret på samme

FVB /129 /C57

blandet genetisk baggrund som tidligere beskrevet [30].

Rb f

/f /

p107

– /- Salg og

K14CreER /Rb

f /f /p107

– /-

blev genereret på samme

CD1 /129 /C57

blandet genetisk baggrund som tidligere beskrevet [30]. Alle mus blev genotypebestemt ved PCR. Mus blev injiceret intraperitonealt med 0,3 ml bromdeoxyuridin (BrdUrd; 12,5 mg /ml) 1 time før eutanasi at måle hastigheden af ​​DNA-syntese. Tunger og esophagi blev høstet og bearbejdet som tidligere beskrevet [23]. Musene blev opstaldet i Foreningen for Vurdering af Laboratory Animal Care-godkendt McArdle Laboratory Animal Care Unit. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med vores dyr protokol godkendt af University of Wisconsin Institutional Animal Care og brug Udvalg.

4-nitroquinolin-1-oxid (4NQO) induceret hoved og hals carcinogenese studie og histologisk analyse

behandling og retningslinjer for histologisk analyse af tumorer blev beskrevet tidligere [26]. Kort beskrevet blev mus behandlet med 4-nitroquinolin-1-oxid (4NQO; 10 ug /ml) i deres drikkevand i 8 uger og derefter holdt uden behandling i yderligere 16 uger. Ved slutpunktet eller når musene blev døende, blev de aflivet, åbenlyse tumorer i tungen og spiserøret blev bedømt, og væv blev indsamlet til histopatologiske analyser.

Immunofluorescens

Immunofluorescens blev udført som tidligere beskrevet [31]. Anvendte antistoffer omfattede anti-p16 (1:50 i 5% fedtfri mælk /5% hesteserum, M156, Santa Cruz Biotech.), Anti-MCM7 (1: 200 i 5% hesteserum, NeoMarkers), anti-cytokeratin 14 konjugeret til FITC (CK14; 1: 100 i 5% hesteserum, CBL 197F, Millipore), anti-bromdeoxyuridin (BrdUrd; 1:50 i 5% hesteserum, Calbiochem), og anti-γ-H2AX (1: 100 i 5 % hesteserum, Millipore)

Kvantificering af BrdUrd positive kerner og γ-H2AX foci positive celler

mindst tre mus af hver genotype,

NTG /FancD2

+ /+

,

NTG /FancD2

– /-

,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, og

K14E6E7 /FancD2

– /-

mus, blev udvalgt og ~ 8 til 10 frames (400x) af celler i suprabasale (cytokeratin 14 negative) og basal (cytokeratin 14 positive) lag af tungen og spiserøret epitel blev kvantificeret for hver mus.

Statistisk analyse

ensidig Barnard eksakte test blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​forskelle i åbenlys tumorincidensen mellem hver gruppe af mus. Tosidet Wilcoxon rank sum test blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​forskelle i graden af ​​åbenlys læsion i dyret tungen og spiserøret. For at bestemme betydningen for BrdUrd-positive kerner og γ-H2AX nuklear foci positive celler mellem hver gruppe mus, blev en to-sidet Wilcoxon rank-sum test anvendt.

Resultater

forstyrrelse af FA pathway øger forekomsten af ​​HPV-onkogen associerede tumorer i E6 /E7 bi-transgene mus, men ikke i E6 transgene mus Salg

for at løse den rolle, E6 og mangel på FA-vejen i hoved og hals carcinogenese , HPV16 E6 transgene (

K14E6

) og HPV16 E7 transgene (

K14E7

) mus blev krydset til

fancD2

-null mus til at generere fire forskellige genotyper

K14E6

/

FancD2

+ /+

,

K14E6

/

FancD2

– /-

,

K14E6E7

/

FancD2

+ /+

, og

K14E6E7

/

FancD2

– /-

mus. Mus blev behandlet med 4NQO, en vandopløselig kemisk carcinogen, der fungerer som en co-carcinogen til induktion HNCs i vores HPV16 transgene mus [23], i 8 uger og derefter holdt i yderligere 16 uger. På 24 uger endpoint blev tunger og esophagi høstet, scorede for åbenlyse tumorer, og væv blev fikseret, paraffin-indlejret, sektioneret og underkastet histopatologiske analyser at vurdere den værste fase af neoplastisk sygdom.

Til

fancD2

-Tilstrækkeligt baggrund, kun to af 26

K14E6 /FancD2

+ /+

mus (8%) udviklede åbenlyse hoved og hals tumorer, som ikke var signifikant forskellig fra den observeret i ikke-transgen (NTG) mus (tabel 1). Dette er i overensstemmelse med vores forudgående undersøgelse [25]. På

fancD2

deficiente baggrund, to ud af 22

K14E6 /FancD2

– /- iBooked.dk mus (9%) udviklede åbenlyse tumorer (tabel 1) , hvilket var ikke signifikant forskellig fra den observeret på

fancD2

-Tilstrækkeligt baggrund (

K14E6 /fancD2

+ /+

vs.

K14E6 /FancD2

– /-

,

P

= 0,52). Således

fancD2

mangel førte ikke til en øget følsomhed af E6 transgene mus til hoved og hals tumorer.

Genotype

Group størrelse, n

Animalsk væv med åbenlys tumor, n (%)

Tongue Esophagus

Tongue

Esophagus

*

NTG/FancD2

+

/

+

240 (0) 0 (0) 0 (0)

*

NTG /FancD2

– /-

260 (0) 0 (0) 0 (0)

*

K14E7 /FancD2

+

/

+

204 (20) 2 (10) 3 (15)

*

K14E7 /FancD2

– /-

2111 (52) 5 (24) 6 (29)

K14E6 /FancD2

+

/

+

262 (8 ) 0 (0) 2 (8)

K14E6 /FancD2

– /-

222 (9) 0 (0) 2 (9)

K14E6E7 /FancD2

+

/

+

146 (43) 4

a (29) 4

en (29 )

K14E6E7 /FancD2

– /-

1411 (79) 9

b (64) 7

b (50) tabel 1. Sammenligning af 4NQO induceret åbenlys . tumor incidens hos musen tungen og spiserør væv

BEMÆRK:

K14E6E7 /FancD2

+ /

+ mus viser en betydelig forøgelse af tumorincidensen sammenligne med

K14E6 /FancD2

+ /

+ mus (

P

= 0,01). Forskellen i tumor forekomster mellem

K14E6 /FancD2

+ /+

og

K14E6 /FancD2

– /-

grupper viser ingen statistisk signifikans (

P

= 0,52). Men forskellen i tumor forekomster mellem

K14E6E7 /FancD2

+ /+

K14E6E7 /FancD2

– /-

grupper er statistisk signifikant (

P

= 0,03). Alle statistiske sammenligninger blev udført ved anvendelse af en ensidet Barnard eksakte test.

en To af

K14E6E7 /FancD2

+ /+

mus havde tumorer i både tunge og spiserøret.

b Fem af

K14E6E7 /FancD2

– /-.

Mus havde tumorer i både tunge og spiserør

* Åbenlys tumor tilfælde af

NTG /FancD2

+

/

NTG /FancD2

– /-

K14E7 /FancD2

+ /+

og

K14E7 /FancD2

– /- iBooked.dk mus er fra vores tidligere undersøgelse [26] CSV Hent CSV

Vi næste kigget på indflydelsen af ​​FA-mangel på hoved og hals tumorigenese i mus, der udtrykker både E6 og E7. På

fancD2

-Tilstrækkeligt baggrund,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

mus udviklede et øget antal åbenlyse hoved og hals tumorer i forhold til

K14E7 /FancD2

+ /+

mus (tabel 1), i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser demonstrerer en evne af E6 til at forøge effektiviteten af ​​E7-drevet hoved og hals tumorigenese [25]. På

fancD2

deficiente baggrund, observerede vi en signifikant stigning i forekomsten af ​​åbenlyse tumorer i

K14E6E7

mus, fra 43% til 79% (

K14E6E7 /FancD2

+ /+

vs.

K14E6E7 /FancD2

– /-

,

P

= 0,03 i tabel 1). Størrelsen af ​​stigningen i hyppigheden af ​​åbenlyse tumorer på

fancD2

deficiente baggrund ses med det E6 /E7 bi-transgene mus var ikke større end den, der ses med E7 kun transgene mus (tabel 1). Disse data indikerer, at FA vej påvirker onkogene potentiale E7 men ikke E6.

Mangel i FA vej førte til mere aggressiv neoplastisk HPV-associeret sygdom

Vi udførte detaljeret histopatologisk analyse af vævet høstet fra disse mus til at vurdere graden af ​​neoplastisk sygdom i disse kohorter af mus. Væv med åbenlyse tumorer blev høstet, fikseret, paraffin-indlejret og §§ udsat for histopatologi. Specifikt blev hver tiende 5 um sektion af tungen og spiserøret farvet med hematoxylin og eosin (H barer, SD. Stjerne (*) betyder, at mangel på

fancD2

gen forårsagede en signifikant stigning i DNA-syntese mellem genotyper (

P

0,05). Alle statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af en to-sidet Wilcoxon rank-sum test.

På

fancD2

-Tilstrækkeligt baggrund, E6 alene eller sammen med E7 markant stigning i antallet af BrdUrd -positive celler i epitel af tungen eller spiserøret (

NTG /FancD2

+ /+

vs.

K14E6 /FancD2

+ /+

eller

K14E6E7 /FancD2

+ /+

,

P

0,05 i figur 2B). Kombinationen af ​​E6 og E7 førte til en signifikant øget antal BrdUrd-positive epitelceller på

fancD2

-Tilstrækkeligt baggrund end gjorde E6 alene (

P

0,05 i figur 2B). Vigtigt er det, blev frekvensen af ​​celler, der understøtter DNA-syntese steget betydeligt i de epiteliale celler af tungen eller spiserøret af alle mus, der var deficiente for

fancD2

, uanset HPV16 onkogen status (

NTG /FancD2

+ /+

vs.

NTG /FancD2

– /-

,

K14E6

/

FancD2

+ /+

vs.

K14E6

/

FancD2

– /-

, og

K14E6E7

/

FancD2

+ /+

vs.

K14E6E7

/

FancD2

– /-

; alle

P

0,05 i figur 2B). Vi yderligere forfinet vores analyse af den indflydelse, HPV16 onkogener og FA mangel på induktionen af ​​DNA-syntese til to forskellige delrum af epitel: den basale rum, som er cytokeratin 14 (CK14) positiv, og suprabasale rum, som er CK14 negative (figur 2A). Ovenstående erklærede indflydelse begge faktorer (HPV16 onkogener og FA-status) blev mere ensartet observeret i den basale rum både tungen og spiserøret (figur S1). Sammenfattende mangel i

fancD2

førte til induktionen af ​​cellulær DNA-syntese i tungen og øsofagus epitel uanset HPV16 onkogen status. Disse resultater understøtter den hypotese, at FancD2 spiller en rolle at regulere S-fasen cellecyklus [6,36,37]. Men det faktum, at FA-mangel ikke forårsagede en øget modtagelighed for hoved og hals tumorigenese i E6 transgene mus men forårsage en stigning i celledeling i disse samme mus viser, at induktion af epitelial hyperplasi forklarer ikke, hvordan FA-mangel driver tumorigenese .

FA vej specifikt undertrykke E7-drevet DNA-skader

Både HPV16 E6 og E7 onkogener er blevet argumenteret at fremkalde DNA-skader baseret på komet analyser udført på celler i vævskultur [38,39 ]. Eftersom FA-vejen er involveret i reparation af beskadiget DNA, ville det være indlysende, at niveauet af DNA-skade forårsaget af E6 og E7 ville blive øget på en FA manglende baggrund. Tilstedeværelsen af ​​DNA-skader i celler kan indirekte scoret af overvågning af tilstedeværelsen af ​​nuklear foci positive for histon 2AX phosphoryleret ved serin-139 (γ-H2AX) [40,41]. Vi havde tidligere vist, at i

K14E7

mus E7, førte til en robust stigning i hyppigheden af ​​γ-H2AX nukleare foci-positive celler i epitel af tungen og spiserøret, og frekvensen blev yderligere forøget på

fancD2

deficiente baggrund [26]. I den aktuelle undersøgelse, vi ønskede at fastlægge den rolle, HPV16 E6 på DNA skade responset på

fancD2

-Tilstrækkeligt og deficiente baggrunde. Til dette formål blev immunfluorescensfarvning specifik for γ-H2AX udført på sektioner af tungen og spiserøret fra

NTG

,

K14E6

, og

K14E6E7

mus på

fancD2-

tilstrækkelig eller

fancD2

deficiente baggrunde (figur 3A).

A. For at vurdere induceret DNA-skade respons af HPV16 E6 og E7 i mangel på

fancD2

gen, væv fra hver gruppe blev farvet for anti-γ-H2AX (rød) og anti-cytokeratin 14 (CK14) protein (grøn ) antistoffer. DAPI bruges til en nuklear kontrastfarvning. Scale bar, 20 pm. γ-H2AX foci positive celler er fremhævet med grønne pile i billederne. B. Mindst tre mus af hver genotype,

NTG /FancD2

+ /+

, NTG /FancD2

– /-

,

K14E6 /FancD2

+ /+

,

K14E6 /FancD2

– /-

,

K14E6E7 /FancD2

+ /+

, og

K14E6E7 /FancD2

– /-

mus, blev udvalgt og ~ 8 til 10 rammer af celler ved de epiteliale lag af tungen og spiserøret blev kvantificeret for hver mus. Mængden af ​​celler med γ-H2AX positive foci celler over antallet af totale celler blev plottet i hvert tilfælde (søjler); barer, SD. Stjerne (*) betyder, at forskelle i antallet af celler med γ-H2AX foci mellem grupperne statistisk sammenlignet (

P

0,05). Alle statistiske sammenligninger blev udført ved anvendelse af en to-sidet Wilcoxon rank-sum test. Bemærk: Eksponeringskontrol gange bruges var de samme for alle analyserede prøver. Nogle celler i væv af

K14E6E7 /FancD2

+ /+

K14E6E7 /FancD2

– /-

mus havde meget lyse γ-H2AX-specifik nuklear farvning ved eksponering anvendes. Kortere eksponering bekræftede, at disse celler bevaret punktformig nukleare farvning reflekterende af DNA skade responset foci.

I epitel af tungen og spiserøret væv, E6 transgene mus viste meget få γ-H2AX foci positive celler, der ligner der ses i

NTG

mus. barer, SD. barer, SD.