PLoS ONE: JAG1 Er forbundet med dårlig overlevelse gennem Induktion Metastase i Lung Cancer

Abstrakt

JAG1 er en Notch ligand, der spiller en afgørende rolle i flere signalveje. Imidlertid har funktionaliteten af ​​JAG1 i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) ikke undersøgt grundigt. Ved sammenligning af gen transskriberet RNA profiler i cellelinjen par med differential invasion evne, der er konstateret vi JAG1 som en potentiel metastase enhancer i lungekræft. Ektopisk udtryk for JAG1 om lungekræft celler forbedret celle migration og invasion samt metastaser

in vitro

in vivo

. Omvendt knockdown af JAG1 med siRNA i stærkt invasive kræftceller førte til reduktion af migration og invasion. I klinisk analyse, JAG1 mRNA-ekspression var højere i tumorer end i det tilstødende normale væv i 14 ud af 20 patienter med pladecellecarcinom (SCC). SCC patienter med højere JAG1 transskription havde dårlig samlet overlevelse end dem med lav-transskriberet JAG1. Microarray analyse viste, at tvungen JAG1 transskription var forbundet med en forhøjet HSPA2 RNA transskription, som spillede en rolle i at fremme kræft celle migration og invasion. Sammenfattende er dette den første undersøgelse, der viste, at JAG1 kan virke som en potentiel prognostisk markør og JAG1 /HSPA2 akse medierer lungekræft malignitet mindste delvist

Henvisning:. Chang WH, Ho BC, Hsiao YJ, Chen JS, Yeh CH, Chen HY et al. (2016) JAG1 Er forbundet med dårlig overlevelse gennem Induktion Metastase i lungekræft. PLoS ONE 11 (3): e0150355. doi: 10,1371 /journal.pone.0150355

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: September 28, 2015; Accepteret: 12. februar 2016 Udgivet: 1. marts 2016

Copyright: © 2016 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Den microarray CEL-filer, normaliserede data og eksperimentel information er blevet deponeret i Gene Expression Omnibus og er tilgængelige ved tiltrædelsen nummer GSE14995

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan, ROC (NSC98-2314-B-002-038-MY2, NSC101-2911-I-002-303, 103-2320-B-002 -052, 104-2320-B-002 -030). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Metastase er en afgørende faktor der bidrager til kræft progression og dødelighed, og celle motilitet og invasion er det første skridt [2]. Generelt kan de fleste cancer tilskrives et stigende antal genetiske ændringer, som omfatter onkogen aktivering eller tumorsuppressorgen inaktivering [3, 4]. I vores tidligere undersøgelser, vi etableret en række lungekræft cellelinjer med varieret invasionsevne [5], og vi identificeret og valideret flere onkogener eller tumor undertrykkere fra disse model cellelinjer [6-8]. Opdagelsen af ​​disse ændringer kan gavne kræftpatienter som kræft markører eller druggable mål [9]. Men de fleste vekslen er endnu ikke klarlagt fuldstændigt.

JAG1 er en af ​​de kanoniske ligander for Notch-receptorer. Efter interaktionen af ​​ligander med receptorer, Notch receptorer undergår proteolytiske spaltninger, og Notch intracellulære domæne translokere ind i kernen og fik på ekspressionen af ​​Notch-målgener, hvilket resulterer i celledifferentiering, proliferation, overlevelse og apoptose [10]. I human sygdom, er JAG1 blevet rapporteret at være forbundet med Alagille syndrom [11, 12]. Desuden er JAG1 stærkt udtrykt i medulloblastom og kolorektal cancer [13, 14], og giver en ringere samlet overlevelse i brystkræft [15]. I ikke-småcellet lungekræft, er JAG1 blevet identificeret i en ni gen-signaturer, som eventuelt kan anvendes som genetiske markører [16]. På trods af disse kliniske observationer, den molekylære bidrag og funktionaliteten af ​​JAG1 i neoplastiske sygdomme mangler at blive etableret.

I denne undersøgelse har vi undersøgt effekten af ​​JAG1 på lungekræft invasion både

in vitro

og

in vivo

. Den microarray analyse blev anvendt til at undersøge den mulige nedstrøms signalering af JAG1. Klinisk blev også analyseret korrelationen af ​​JAG1 transskription og de rester af NSCLC.

Materialer og metoder

Celledyrkning

CL1-0 og CL1-5 celler blev etableret og karakteriseret som tidligere beskrevet [5]. A549 og H226 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

plasmidkonstruktion transfektion og stabile kloner

JAG1 og HSPA2 udtrykkende plasmider, pcDNA3.1-JAG1-V5 og pcDNA3.1-HSPA2-V5, blev konstrueret ved kloning af fuldlængde human JAG1 eller HSPA2 cDNA med C-terminale V5-tag ind i pcDNA3.1-vektoren (Life Technologies, Grand Island, NY), hhv. To siRNA bruges til knockdown JAG1 mRNA blev købt fra Lyddæmper

® Vælg siRNA (kat. S1175 og s1176) (Life Technologies, Grand Island, NY). Alle transfektionsforsøg blev udført med Lipofectamine

® 2000-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) i overensstemmelse med producentens protokol. CL1-0 celler blev transficeret med pcDNA3.1-JAG1 eller pcDNA3.1 tom vektor. Efter dyrkning i medium indeholdende 1 mg /ml geneticin (G418) i 2-3 uger, samlet stabile kloner blev isoleret. Kloner, der udtrykker JAG1 cDNA kodende område blev opretholdt i medium indeholdende 0,5 mg /ml geneticin og anvendt til yderligere undersøgelse.

Real-time kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret ved TRIzol-reagens (Life Technologies, Grand Island, NY), og 1 ug af total RNA blev anvendt i cDNA-syntese med tilfældige hexamere primere ved hjælp Superscript II revers transkriptase (Life Technologies, Grand Island, NY). 20 ng RNA’er eller 10 ng cDNA’er blev tjente som template for mRNA-ekspression påvisning af real-time kvantitativ PCR med SYBER Green. Den relative mRNA-ekspression niveau af target-genet blev bestemt som -ΔCT = – [CT

target-CT

TBP]. Målet /TBP mRNA-forholdet blev beregnet som 2-ACt × K, hvori K er en konstant. Den detalje primersekvensen for hver målgenet real-time kvantitativ PCR blev opført i S1 tabel.

immunblotting

Fremstillingen af ​​hel-cellelysater og Western blot-analyse blev beskrevet som tidligere nævnt [7 , 8]. Kort fortalt blev cellelysater for immunoblot fremstillet i RIPA-puffer (1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) indeholdende 1X komplet proteaseinhibitorcocktail (Roche, Indianapolis, IN). De proteinprøver blev adskilt ved 8% ~ 12% SDS-PAGE og overført til en poly (vinylidendifluorid) membran (Merck Millipore, Billerica, MA). Proteiner blev probet med specifikke antistoffer, visualiseret ved kemiluminescens-assay kit (Merck Millipore, Billerica, MA) og detekteret ved FUJIFILM LAS-3000 ECL-systemet (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Primære antistoffer anvendt til immunoblot var som følger: anti-JAG1, anti-NiCd-3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-NiCd-1, anti-NiCd-2, anti-NiCd-4 (GeneTex, Irvine , CA), anti-β-actin (Sigma, St. Louis, MO), og anti-V5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Den fluorescerende immunhistokemi farvning i patienternes tumor biopsi blev descripted i S1 Text.

Migration og invasion analyser

In vitro

celle migration og invasion analyser blev udført som beskrevet tidligere [ ,,,0],17] ved brug transwell kamre (8 um porestørrelse; Costar, Cambridge, MA). I migration assay blev 1 × 10

5-celler podet på toppen af ​​polycarbonatfiltre og inkuberet i 8 timer. Filtre blev podet med en vatpind, fikseret med methanol og derefter farvet med Giemza løsning (Sigma, St. Louis, MO). For invasionen assayet blev filtre overtrukket med Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), og 1 x 10

5-celler blev podet på Matrigel og inkuberes i 18 timer. Cellerne er knyttet til den nedre overflade af filteret blev talt under et lysmikroskop (forstørrelse x 100).

In vivo

metastaser

dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for National Taiwan University med IACUC No. 20080239. for metastaser assay [7], 1 × 10

6 celler blev vasket og resuspenderet i 100 pi PBS. Efterfølgende blev cellerne injiceret i den laterale halevene af 6 uger gamle SCID-mus (leveret af Laboratory Animal Center College of Medicine, National Taiwan University, Taipei, Taiwan). Efter implantation af 10 uger, blev lungerne fra musene fjernet og fikseret i 10% formalin, og antallet af lunge mikrometastatiske læsioner blev talt under et dissektionsmikroskop. Indlejrede væv blev skåret og farvet med hematoxylin-eosin til histologisk analyse.

Patienter og vævsprøver

Denne undersøgelse blev udført efter godkendelse af Institutional Review Board of National Taiwan University Hospital med NTUH-REC Nej 200812077R protokol. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Alle tumor vævsprøver de var behandling naive fordi ingen af ​​patienterne havde modtaget neo-adjuvant kemoterapi eller strålebehandling før operation. Enheder af lungekræft væv og ikke-tumor del af lungen opnået ved kirurgi blev straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Den histologiske klassifikation af disse tumorer var baseret på World Health Organization kriterier. Tumorstørrelse, lokal invasion, og lymfeknudemetastase blev bestemt ved patologisk undersøgelse. Den endelige stadieinddeling af sygdommen blev bestemt ud fra en kombination af kirurgiske og patologiske fund, ifølge den nuværende tumor-node-metastase system til lungekræft mellemstationer. Opfølgende data vil blive indhentet fra patienternes medicinske diagrammer og rapporteret fra vores tumor registreringsdatabasen service. Relapse tid blev beregnet fra datoen for operationen til datoen for påvisning af lokalt recidiv eller systemisk metastaser. Overlevelse tid blev beregnet fra datoen for operationen til dødsdagen. Patienter dør af postoperative komplikationer inden for 30 dage efter operationen blev udelukket fra overlevelse analyse, for at undgå bias. Analysen af ​​JAG1 mRNA-ekspression i patienter blev descripted i S1 Text.

microarray analyse

For cDNA microarray analyse blev cDNA forberedelse og array hybridisering udført i overensstemmelse med Affymetrix GeneChip Expression analyse Teknisk Manual. Kort fortalt 8 ug samlet RNA blev revers-transkriberet i nærvær af en T7-primer (One-cycle cDNA Synthesis kit, Affymetrix, Santa Clara, CA). Den cDNA-produktet blev oprenset og transskriberes

in vitro

med biotinmærkede ribonukleotider (IVT Labeling Kit, Affymetrix, Santa Clara, CA). En del af den biotinylerede RNA var fragmenteret og hybridiseret natten til menneskelige genom U133 plus 2,0 GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA). Den GeneChip blev vasket og udviklet af forstærkningen farvningsprotokollen leveret af Affymetrix. Den GeneChip blev scannet af Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G, og billederne blev ekstraheret med Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS) version 1.4. Alle hybridiseringsforsøg udførtes i biologisk triplo med cDNA-prober fremstillet ud fra CL1-0 /JAG1 og CL1-0 /vektorkontrol. Data blev filtreret af 2-fold ændringer under FDR beskyttelse (

s

0,05) ved hjælp Genespring GX 12,6 (Sillicon Genetics, Redwood City, CA). De microarray CEL-filer, normaliserede data og eksperimentel information er blevet deponeret i Gene Expression Omnibus, og er tilgængelige ved tiltrædelsen nummer GSE14995. Den detalje eksperimentelle procedure og fulgte identifikation af JAG1 nedstrøms gener blev descripted i S1 Tekst

Statistisk analyse

Alle forsøg udføres i tre eksemplarer og analyseres ved ANOVA (Excel, Microsoft, Taipei, Taiwan). .

s

værdi 0,05 anses statistisk signifikant. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD.

Resultater

JAG1 identificeres som en potentiel metastase-fremmende gen

For at identificere de nye gener involveret i lungekræft metastase, cDNA ekspressionssystemer microarrays blev anvendt til at undersøge en lungecancer invasion model i vores tidligere undersøgelser [18]. Efter sammenligning af mRNA ekspression profiler af de lave invasive celler (CL1-0) og de meget invasive celler (CL1-5), fandt vi mRNA ekspressionen af ​​JAG1 var 113 gange højere i CL1-5 end i CL1-0 (Fig 1A, venstre). Transkriptet ekspression og proteinekspression af JAG1 i både CL1-0 og CL1-5 cellelinier var i overensstemmelse med de opnåede resultater fra microarray analyse (Fig 1A, midterste og højre). For at kontrollere, om JAG1 spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​kræft metastase, vi brugte overekspression og RNAi lyddæmpende tilgange til at modulere JAG1 transkriptionel udtryk og udførte Transwell migration og invasion assays. Som vist i fig 1B og 1C, tvungen ekspression af JAG1 fremmet evne cellemigrering og invasion i den lave invasive CL1-0 celler. I modsætning hertil knockdown af JAG1 hæmmede begge aktiviteter i højt invasive CL1-5 celler. Disse data antydede, at JAG1 kan virke som en ny kandidat er involveret i acceleration af lungekræft metastaser.

(A) Identifikation af JAG1 i en invasion model af lunge kræftceller. JAG1 er opreguleret i stærkt invasive lungecancerceller. Venstre, blev JAG1 mRNA-niveau vurderet ved oligonukleotid microarray analyse. Middle, JAG1 mRNA-niveau blev målt ved kvantitativ reel-tid RT-PCR. Forsøgene blev udført in triplo og data blev repræsenteret som middelværdi ± SD. Højre blev JAG1 proteinekspression evalueret ved Western blot. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (B) JAG1 fremmer celle migration og invasionsevne

in vitro

. Venstre, blev JAG1 stabilt overudtrykt i CL1-0 celler. JAG1 mRNA blev målt ved kvantitativ reel-tid RT-PCR i tre eksemplarer. Data blev repræsenteret som middelværdi ± SD. Midterste og højre, blev migration og invasion evne CL1-0 celler med konstitutiv JAG1 udtryk og mock kontrol celler evalueret af migration assay og matrigel invasion assay. Data præsenteret som gennemsnit ± SD af tre eksperimenter. *:

s

0,05 sammenlignet med mock gruppe. (C) Knockdown af JAG1 hæmmer celle migration og invasionsevne

in vitro

. Venstre, JAG1 mRNA blev slået ned af siRNA’er i CL1-5 celler analyseret af real-time kvantitativ RT-PCR i tre eksemplarer. To forskellige siRNA’er (siJAG1-1 og siJAG1-2) blev brugt til at lukke munden på JAG1. NC, negativ kontrol. Midterste og højre, migration og invasion evne JAG1-dæmpende transfektanter blev analyseret ved migration og matrigel invasion assays. De viste data som middelværdi ± SD; *:

s

0,05 sammenlignet med den negative kontrol.

JAG1 fremmer NSCLC malignitet

For at bekræfte, om onkogene natur JAG1 er et universelt fænomen, vi udførte transwell migration og invasion analyser i to andre cellelinier. Dette fænomen blev sammenfattet i andre ikke-småcellet lungekræft-cellelinjer. Vi fandt, at forbigående håndhævet udtryk for JAG1 forfremmet trækkende og invasive evner

in vitro

ikke kun i CL1-0 men også i A549 og H226-celler (Fig 2A). For at bekræfte, om JAG1 funktioner i fremme metastaser

in vivo

blev CL1-0 celler transficeret med JAG1 udtrykker eller tom vektor og blev intravenøst ​​indført i NOD SCID mus ved halen injektion for at vurdere deres metastase evner. Efter ti uger efter injektion blev alle musene aflivet, og den metastatiske tumor foci i lungerne blev undersøgt og talt. Mus injiceret med JAG1 transfektanter (n = 13) udviklet mere pulmonale metastase knuder end mock transfektanter (n = 10) (fig 2B, venstre og midterste). Metastatiske læsioner i tilfældigt udvalgte lunge snit blev farvet med hematoxylin og eosin til histologisk bekræfte tumorknuder (Fig 2B, højre). Disse resultater bekræftede endvidere, at JAG1 spiller en afgørende rolle i modulerende kræft metastaser.

(A) JAG1 fremmer celle migration og invasionsevne

in vitro

. Venstre, blev JAG1 forbigående overudtrykt i A549 og H226 celler. JAG1 mRNA blev målt ved kvantitativ reel-tid RT-PCR og normaliseret til TBP i tre eksemplarer. Midterste og højre, migration evne og invasivitet af celler med forbigående JAG1 overekspression og kontrol celler blev evalueret ved migration og matrigel invasion assays. *:

s

0,05 sammenlignet med mock. Data blev repræsenteret som middelværdi ± SD i triplikat. (B) JAG1 fremmer metastaser

in vivo

. Venstre, antal knuder i SCID-mus. De Mock CL1-0 celler og JAG1-overekspression cellelinier blev podet i alvorlig kombineret immundefekt (SCID) mus ved injektion i halevenen. Efter 10 uger blev musene aflivet. Antal tumorer afledt af mock og JAG1 transfektanter blev målt under dissektion mikroskop. Data blev repræsenteret som middelværdi ± SD (n = 10 i mock kontrolgruppe og n = 13 i JAG1 transfektant gruppe). *:

s

0,05, sammenlignet med mock kontrol. Højre, udseende af lungerne fra mus injiceret med CL1-0 mock og JAG1 transfektanter og repræsentanten H

p

= 0,05).

(A og B) JAG1 mRNA-ekspression i tumorvæv og normalt dele af lungekræft. JAG1 mRNA i tumorer og tilgrænsende normalt væv i NSCLC (A) og undertype pladecarcinom patienter (B) blev vurderet ved kvantitativ reel-tid RT-PCR og normaliseret til TBP. (C) JAG1 mRNA-niveau og samlet overlevelse af undertype planocellulære karcinom patienter. Alle statistiske tests var to sider, og

s

. 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

HSPA2 er en roman nedstrøms effektor af JAG1 i NSCLC

Endelig har vi udnyttet Affymetrix oligonukleotidet microarray analyse for at identificere de 10 differentielt udtrykte gener i JAG1-transficeret CL1-0 celler sammenlignet med mock transfektant (S2 og S3 Tables). Især har vi ikke observere nogen væsentlig forskel på Notch1 og Notch2 og dens downstream gener (ASCL1, HES1, HEY1, og SLUG) mRNA-niveau, undtagen spor niveauer forskel på Notch3 og Notch4 RNA-niveau i NSCLC-celler (S4 og S5 Tables). For at identificere hidtil ukendte potentielle JAG1 downstream molekyler, vi først udført RT-PCR for at validere gener med betydelige ekspressionssystemer ændringer analyseret af microarray resultat enten i JAG1 transfektanter eller JAG1 tavshed CL1-0, CL1-5, A549 og H226 cellelinier (S3 Tabel). Blandt alle gener, HSPA2 udstillet konsekvent og forventede tendens blandt disse 10 gener, når manipulere JAG1. HSPA2, hvis cellulære funktioner i lungekræft er uklare, blev højere udtryk (1,4 fold i A549 celler og 1,2 fold i H226 celler) i JAG1 transfektanter sammenlignet med kontrol-celler (Fig 4A). Omvendt blev mRNA-ekspression af HSPA2 reduceret i JAG1 knockdown celler (Fig 4B). Desuden overekspression af V5-HSPA2 i CL1-0 øget cellemigrering og invasion evner (Fig 4C og 4D). For at udelukke cellelinje effekt, vi yderligere bekræftet dette fænomen i flere cellelinier. Blandt screenet seks lunge cancer cellelinjer, valgte vi de mest to lavt JAG1 mRNA niveau cellelinjer, H1299 og H838, for eksogene udtrykker JAG1 og højst to højt JAG1 mRNA niveau cellelinjer, HOP62 og H322M, for JAG1 lyddæmpning (S2 Fig) . I H1299 og H838 cellelinjer, blev mRNA-ekspression af HSPA2 induceret af JAG1 (S3 Fig). I HOP62 og H322M cellelinjer, blev mRNA ekspressionen af ​​HSPA2 reduceret, når JAG1 blev stille (S4 Fig). Vi også undersøgt, om denne JAG1 /HSPA2 akse var uafhængig af HAK signalering. Canonical proteolytisk status intracellulære domæne af HAK (NiCd) familien, herunder NICD1, NICD2, NICD3, og NICD4 blev analyseret i JAG1 manipuleret cellelinjer (Fig 5). Desuden blev det transkriptionelle niveau af DLL1 og andre hak nedstrøms molekyler, herunder CBF1, slug, snail1, SMAD3, HES1, HES3, HES5, HEY1, HEY2, og MYOD1 også behandlet. Resultaterne viste, at alle NICDs og mRNA-niveau af downstream-molekyler (undtagen HES1) havde ingen signifikant ændring i JAG1 overudtrykt CL1-0 celler (Fig 5A). De tilsvarende resultater kan observeres i JAG1 overudtrykt H1299 (Fig 5B og S5 Fig) og H838 (Fig 5B og S6 Fig) cellelinjer eller JAG1 tavshed HOP62 og H322M cellelinjer (Fig 5C) sammenlignet med kontrolforsøg. Kun HES5 mRNA blev påvirket af JAG1 i H1299 cellelinje. DAPT, en gamma-sekretase hæmmer til at blokere HAK signalering, var også ude af stand til at fjerne HSPA2 transkriptionel opregulering af JAG1 (S7 Fig). Dette understøttes den sandsynlige HAK-uafhængig regulering i det mindste i disse cellelinjer. Endelig vil vi gerne teste, om JAG1 blev colocalized med HSPA2 og fluorescerende immunhistokemi farvning blev udført i lungekræftpatienter ‘vævssnit. Den angivne JAG1 og HSPA2 resultat blev heterogent udtrykt i tumor dele og delvist colocalized (S8 Fig). Disse resultater antydede, at HSPA2 var en nedstrøms gen af ​​JAG1 og det også reguleret tumorcellemigration og invasion.

(A og B) JAG1 blev transient overudtrykt i A549 og H226 (A) eller knockdown af JAG1 siRNAs i CL1 -5 (B). HSPA2 mRNA blev målt ved kvantitativ reel-tid RT-PCR og normaliseret til TBP. (C) Migration evne CL1-0 celler med transiente HSPA2 overekspression og kontrolceller blev evalueret ved migration assay. *,

s

0,05 sammenlignet med mock kontrol. Data blev repræsenteret som middelværdi ± SD (n = 3 pr gruppe). (D) invasivitet af CL1-0 celler med forbigående HSPA2 overekspression og kontrol celler som evalueres af matrigel invasion assay. *,

s

0,05 sammenlignet med mock kontrol. Data blev repræsenteret som gennemsnit ± SD (n = 3 pr gruppe).

Cell blev forbigående overudtrykt JAG1 af ekspressionsplasmid eller tavshed JAG1 af siRNA strategi efterfulgt af immunoblottedes med NICD1, NICD2, NICD3, og NICD4 antistoffer eller real-time kvantitativ PCR for Notch downstream molekyler mRNA-niveau analyse. (A) JAG1 overudtrykt i CL1-0 celler efterfulgt af Western blot-analyse for NICDs proteolytisk status eller real-time kvantitativ PCR for Notch downstream molekyler mRNA-niveau analyse. (B) JAG1 overudtrykt i H1299 og H838 cellelinjer, efterfulgt af Western blot-analyse for NICDs proteolytisk status. (C) JAG1 stumme i HOP62 og H322M cellelinjer, efterfulgt af Western blot-analyse for NICDs proteolytisk status. DAPT er en gamma-sekretase hæmmer og anvendes til NOTCH signalering kontrol. UD, ubestemt grund målbart ekspressionsniveau; *,

s

0,05 sammenlignet med mock kontrol. Data blev repræsenteret som gennemsnit ± SD (n = 3 pr gruppe).

Diskussion

Fund af onkogener /tumorsuppressorgener og karakterisering af de underliggende molekylære mekanismer ikke blot afklare komplicerede karakter af tumorigenese og kræft progression, men også give et grundlag for at udvikle bedre strategier i kræft diagnose, prognose, forudsigelse og terapi i fremtiden. Vores resultater demonstrerede den onkogene rolle JAG1 i lungekræft, fremme cancer invasion og metastase. Kliniske data viste, at JAG1 mRNA-ekspression er forbundet med dårlig overlevelse hos patienter med subtype pladecarcinom af NSCLC. I en tidligere undersøgelse, ekspressionen af ​​JAG1 i lungevæv på idiopatisk lungefibrose, som disponerer til lungekræft, blev opreguleret. Desuden proteinet ekspression af JAG1 af squamous metaplastiske læsioner er positiv i 83% tilfælde analyseret ved immunhistokemisk farvning [19]. Derfor kan JAG1 udtryk i lungekræft, herunder pladecarcinom, have høj effekt af kliniske implikationer.

Notch signalveje er normalt anses for at være ligand-induceret [10], og de receptorer og ligander er meget co -expressed i kræft [15, 20]. Ifølge vores microarray data, havde overekspression af JAG1 ikke signifikant tænde Notch signalvej (undtagen NOTCH3 med 1,67-gange ændring) i CL1-0 celler (S4 Table). Resultatet af real-time kvantitativ RT-PCR validering gav også lignende konklusioner (S5 tabel). Den tvetydige udtryk for NOTCHs og downstream molekyler i JAG1 transficeret CL1-0 kan skyldes den heterogene cellepopulation. Desuden HES1 var lidt opreguleret i JAG1 overudtrykt CL1-0 celler (Fig 5A og S5 tabel). Således kan vi ikke udelukke inddragelse af HAK signalering især NOTCH3 signalering i CL1-0. Notch-ligander er rapporteret at have iboende ligand signaleringsaktivitet uafhængig af notch receptorer. Efter post-translationelle modifikationer, proteolytisk behandling, endocytose og membran menneskehandel, ville Notch ligander være multifunktionelle [21]. Disse indebar, at JAG1 i dele af NSCLC kan fremkalde noncanonical signalveje. I denne undersøgelse, vi fuldt ud analyseret HAK signalering i JAG1 overudtrykt lungekræft-cellelinjer ved at undersøge den proteolytiske status NICD og nedstrøms molekyler af HAK signalering. Kun HES5 havde fundet til at blive reduceret i JAG1 overudtrykt H1299 cellelinje (S5 Fig). Hvorvidt dette havde betydning i tumormetastase er stadig behov for at blive undersøgt. Tilsammen vores resultater indikerede, at JAG1 er også i stand til at mediere celle migration, invasion og metastase af NSCLC gennem et Notch-uafhængige vej

Flere undersøgelser har rapporteret, at JAG1 medierer multiple signalveje såsom. AP-1 , MAPK, EGFR, NF-κβ, og IL-6 i forskellige tumorceller [22-26]. Vores microarray data viste, at JAG1 modulerer adskillige gener såsom adhæsionsmolekyle med Ig-lignende domæne 2 (Amigo2), Inhibin, Beta E (INHBE), Heat Shock 70 kDa protein 2 (HSPA2), Sperm protein associeret med The Nucleus, X-Linked , Familie Medlem (SPANX), og G-protein-koblede receptorer, klasse C, Gruppe 5, medlem B (GPRC5B). HSPA2 har vist sig at overudtrykke i mange cancertyper. Desuden patienter med højere HSPA2 udtryk havde kortere samlet overlevelse sammenlignet med lavere HSPA2 patienter [27-30]. Disse er i overensstemmelse med vores

in vitro

data, som HSPA2 spiller en onkogen rolle i NSCLC cellelinjer. Vigtigere er det, vi forudsat en roman skildring af mekanismen for HSPA2 signalering.

Selvom den underliggende mekanisme HSPA2 i cancer metastaser blev mindre dokumenteret, sin kritiske rolle i tumorvækst og metastatisk potentiale var blevet antaget. Baseret på sit engagement for dannelse af aktiv CDC2 /cyclin B1 kompleks og udtryk i tumorer, kan det regulere kræft celle egenskaber af malignitet såsom migration og invasion [31-34]. For nylig HSPA2 blev rapporteret, at det blev udtrykt i SCC frem for adenocarcinom og korreleret med dårlig samlet overlevelse, støtter vores konklusion i SCC [29]. Det var muligt at HSPA2 korreleret til ringe overlevelse i SCC grund af den anti-apoptose effekt via dens downstream faktorer, såsom linse epitel-afledt vækstfaktor (LEDGF) [35]. For nylig blev varmechockproteinet 70 også rapporteret at interagere med NICD1 og bidrage til NOTCH signalering [36]. I denne undersøgelse fremhævede vi rollen som JAG1 inducerede ikke-kanoniske Notch signalering i NSCLC. Selvom JAG1 og HSPA2 blev kun delvist colocalized i patienternes tumor biopsi (S8 Fig), kunne reguleringen af ​​HSPA2 ved JAG1 være en vigtig finde for lungekræft celle malignitet. Hvorvidt JAG1 kan interagere med andre receptorer end NOTCHs og fremkalde HSPA2 transkriptionel opregulering skal undersøges nærmere. Muligheden for HSPA2, et varmechokprotein, at være kan der forventes et potentielt terapeutisk mål. Sammenfattende vores resultater er de første til at danne det grundlag, at JAG1 fungerer som en prognostisk biomarkør og JAG1 /HSPA2 akse bidrager til lungekræft malignitet.

Støtte Information

S1 Fig. JAG1 udtryk og NSCLC patienternes overlevelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s001

(PDF)

S2 Fig. Endogen JAG1 mRNA-ekspression i seks lunge cancer cellelinjer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s002

(PDF)

S3 Fig. HSPA2 mRNA-ekspression opreguleres af JAG1 mRNA overekspression

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s003

(PDF)

S4 Fig. HSPA2 mRNA-ekspression nedreguleres af JAG1 mRNA lyddæmpning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s004

(PDF)

S5 Fig. mRNA udtryk for HAK downstream molekyler i JAG1 overudtrykt H1299 celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s005

(PDF)

S6 Fig. mRNA udtryk for HAK downstream molekyler i JAG1 overudtrykt H838 celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s006

(PDF)

S7 Fig. Opregulering af HSPA2 af JAG1 var uafhængig af HAK signalering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s007

(PDF)

S8 Fig. Fluorescerende immunhistokemisk farvning for JAG1 og HSPA2

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s008

(PDF)

S1 tabel. Primer sekvenser af målgener anvendes i SYBR Green realtid kvantitativ RT-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150355.s009

(PDF)

S2 tabel.