PLoS ONE: Protein kinase A aktivitet og Forankring er nødvendige for kræft i æggestokkene Cell Migration og Invasion

Abstrakt

epitelovariecancer (EOC) er den mest dødelige af de gynækologiske maligniteter, dels på grund af sin klinisk okkulte metastaser . Derfor forstå de mekanismer, der styrer EOC udbredelse og invasion kan tilvejebringe nye mål for antimetastatiske behandlinger eller nye metoder til påvisning af metastatisk sygdom. CAMP-afhængig proteinkinase (PKA) er ofte dysreguleret i EOC. Desuden PKA aktivitet og subcellulære lokalisering af A-kinase forankring proteiner (AKAP’er) er vigtige regulatorer af cytoskeletale dynamik og celle migration. Således har vi forsøgt at undersøge den rolle, PKA og AKAP funktion i både EOC cellemigrering og invasion. Brug af plasmamembranen-directed PKA biosensor, pmAKAR3 og en forbedret migration /invasion assay, viser vi, at PKA aktiveres ved forkanten migrere SKOV-3 EOC-celler og at inhibering af PKA aktivitet blokke SKOV-3 cellemigration. Endvidere viser vi, at mens PKA aktivitet i forkanten af ​​disse celler medieres af forankring af type-II regulerende PKA-underenheder (RII), inhibering af forankring af enten RI eller RII PKA-underenheder blokke cellemigrering. Vigtigt er, viser vi også – for første gang – at PKA aktivitet er opreguleret ved forkanten af ​​SKOV-3-celler under invasionen af ​​en tredimensional ekstracellulær matrix og, som det ses for migration, inhibering af enten PKA aktivitet eller AKAP -medieret PKA forankringsblokke matrix invasion. Disse data er de første til at vise, at invasionen af ​​ekstracellulær matrix ved cancerceller fremkalder aktivering af PKA inden det invasive forreste kant, og at både PKA aktivitet og forankring er nødvendige for matrix invasion. Disse observationer tyder på en rolle for PKA og AKAP aktivitet i EOC metastaser

Henvisning:. McKenzie AJ, Campbell SL, Howe AK (2011) Protein kinase A aktivitet og Forankring er nødvendige for kræft i æggestokkene Cell Migration og Invasion. PLoS ONE 6 (10): e26552. doi: 10,1371 /journal.pone.0026552

Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: Juni 16, 2011; Accepteret: September 28, 2011; Udgivet: 19 oktober 2011

Copyright: © 2011 McKenzie et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af tilskud # R01GM074204 (til AKH) fra National Institutes of Health /National Institute of General Medical Sciences (https://www.nigms.nih.gov) og fra en postdoc stipendium (til SLC) fra Vermont Cancer center og Lake Champlain Cancer Research Organization (https://www.vermontcancer.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er den femte mest almindelige årsag til kræftdødsfald hos kvinder i USA og har den højeste dødelighed af alle gynækologiske kræftformer [1]. Ca. 80% af patienterne til stede med sent stadium sygdom og mindre end 25% af disse kvinder er hærdet. EOC udgør det overvældende flertal ( 90%) af æggestokkene maligniteter og er enestående i sin klinisk okkulte formidling og metastase [2]. I modsætning til de fleste andre typer af karcinom, formidling af EOC gennem karrene og dannelse af virkelig distale metastaser er en sjælden begivenhed. EOC celler kaste fra den primære tumor på overfladen af ​​ovariet og exfoliate ind i bughulen. Den anatomiske placering af æggestokkene letter lokal spredning af EOC, som kan opstå ved direkte migration og invasion af tumorceller til og ind tilstødende organer, samt gennem transport af eksfolierede tumorceller hele den peritoneale kavitet ved normale peritoneal fluidstrøm [2] , [3]. På grund af denne unikke og listigt form for formidling, har bestræbelser på at udvikle metoder til tidlig påvisning af EOC været stort set mislykket [4], [5], [6]. Trods cytoreduktive kirurgi, kombination kemoterapeutika og strategier til bestemmelse serum biomarkører, lokale og formidlet kemoterapi celler fortsætter og i sidste ende blomstre, hvilket fører til høje tilbagefald og 25% fem år overlevelsesraten for patienter med EOC [3], [5], [7], [8], [9]. Således er en bedre forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer EOC formidling og invasion har potentiale til at få væsentlig indflydelse på forløbet af sygdommen.

På grund af afhængighed af formidling EOC og metastase på cellulær migration og invasion , vores laboratorium har bestræbt sig på at forstå mekanismerne bag disse processer i EOC. Cell migration er en højt bestilt proces, der kræver en koordineret indsats mellem en lang række proteiner i forskellige subcellulære regioner [10], [11], [12]. Vi har tidligere vist, at cAMP-afhængig proteinkinase (PKA) er vigtig for cellemigrering og førende dynamik i et antal celler [13], [14], [15]. PKA er en heterotetramere kinase, der kan eksistere i to isoformer, type I og type-II, afhængigt af isoformen af ​​regulatoriske (RI og RII) underenhed forbundet med holoenzymet. PKA har talrige mål forbundet med actomyosin baseret cellebevægelse [16] og tidlige undersøgelser viste, at hyper-aktivering eller inhibering af PKA inhiberede kemotaktisk cellemigration [16], [17], [18]. Denne tilsyneladende modstridende rolle for PKA blev klaret ved påvisningen af, at der ud over den samlede aktivitet, lokalisering af PKA i subcellulær rum, medieres gennem bindingen af ​​PKA R underenheder til A kinase forankring proteiner (AKAP’er; [19], [20]) , regulerer celle migration [13], [21], [22]. Specifikt har det vist sig, at PKA-underenheder og aktivitet er begge beriget med protrusive strukturer på forkanten af ​​migrerende celler [13], [21], [22]. Desuden bred hæmning af type-I og type-II forankring (

dvs

forankring gennem RI eller RII underenheder) generelt [13], [21], eller specifik hæmning af individuelle forankring proteiner (

f.eks

AKAP-Lbc [22]), hæmmer migration. Disse og andre rapporter (revideret i [23], [24]), etablere vigtigheden af ​​lokalisere PKA aktivitet til forskellige subcellulære steder under normale celle vandrende processer.

understreger den potentielle betydning af PKA i ovariecancer patogenese er observationerne, at PKA aktivitet og underenhedsekspression ofte dysreguleret i EOC. Ekspression af PKA katalytiske subunit [25] og lovgivningsmæssige RI underenhed [26], [27], [28] korrelerer med fremskredent stadium og /eller mere aggressiv EOC. Desuden mRNA niveauer af AKAP3 (

aka

AKAP110 eller fibrøst kappe protein på 90 kDa (FSP90)) i ovarietumorer positivt korrelere med sygdom scenen og dårlig prognose [29], [30], mens to andre AKAP’er – AKAP1 (

aka

AKAP149) og AKAP13 (

aka

AKAP-LBC) – også synes at være opreguleret i mucinøse EOC (A. Howe, upublicerede observationer fra Oncomine). På trods af disse observationer, den funktionelle betydning PKA og AKAP signalering i metastatiske EOC celler er ikke blevet godt undersøgt.

I betragtning af betydningen af ​​PKA og AKAP funktion for celle migration og deres dysregulation i EOC, undersøgte vi den rumlige regulering af PKA-aktivitet i migrere EOC celler og beslutsom, om PKA aktivitet og forankring er nødvendige for EOC celle migration. Her rapporterer vi, at PKA aktivitet er opreguleret i forkanten af ​​EOC celler ikke kun i migration, men også i løbet af ekstracellulær matrix invasion, så godt. Endvidere inhibering af PKA-aktivitet og AKAP funktionsblokke EOC cellemigration og invasion. Disse observationer demonstrerer, for første gang, det er vigtigt at PKA forankring for matrix invasion og etablere vigtigheden af ​​rumligt reguleret PKA aktivitet i migration og invasion – og dermed måske metastase – af EOC celler

Materialer og metoder.

Reagenser og cellekultur

SKOV-3 og COS-7-celler blev opnået fra American Type Culture Collection og opretholdt i antibiotika-fri Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS). Hio-80 celler en generøs gave fra Dr. Andrew Godwin (Institut for Molekylær Oncology, Fox Chase Cancer Center) og blev opretholdt i en 01:01 blanding af antibiotika-fri Medium 199: MCDB-105 suppleret med 4% FBS og 0,2 U /ml porcin insulin. Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2. DMSO, cytochalasin D og trypanblåt blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). GM6001 blev opnået fra Millipore (Billercia, MA). Phenolrødt-fri Matrigel og human fibronektin blev erhvervet fra BD Biosciences (Bedford, MA). Farmakologisk inhibering af PKA-aktivitet blev opnået ved anvendelse H89 eller MPKI (Biomol). H89 er en isoquinolon der konkurrerer med ATP for binding til PKA; trods udbredt anvendelse og betydelig styrke, udviser kun beskedne specificitet for PKA [31]. MPKI, en højt specifik PKA-inhibitor, er et myristoylerede, celle-permeable peptid omfattende de inhiberende pseudo-substrat region (aminosyrer 14-27) af det endogene proteinkinase A Inhibitor protein (PKI) [14]. Farmakologisk inhibering af PKA forankring blev opnået under anvendelse StHt31 (Promega), en stearated peptid omfattende PKA R-underenhed bindende domæne fra Ht31 (

aka

AKAP-LBC); således, StHt31 fungerer som en celle-permeable kompetitiv inhibitor af interaktionen mellem endogene AKAP’er og både RII og, ved noget højere koncentrationer, RI PKA-underenheder [32], [33]. Genetiske inhibitorer af PKA-aktivitet og af type-I eller type II PKA forankring er beskrevet nedenfor.

Plasmider og transfektion

Plasmidet kodende mCherry-fusioneret til PKA-inhibitoren protein PKI (se ovenfor ) er blevet beskrevet tidligere [14], mens plasmider kodende GFP fusioneret til type i-eller type-II-forankring hæmmere (RI forankring forstyrrelse (RIAD [34]) og superAKAP

-i silico

(sAKAP

er

; [32], henholdsvis), såvel som deres tilsvarende forvrænget (

scr

) negative kontroller, blev frembragt under anvendelse af 5 ‘phosphorylerede oligonukleotider (Invitrogen), der er opført i tabel S1 Specifikt. komplementære oligoer blev udglødet, genererer 5 ‘

Sal

i og 3′

BamH

i klæbrige ender, så ligeret direkte ind

Sal

i /

BamH

i-fordøjet pEGFP-C1 (Clontech). mCherry versioner af RIAD og sAKAP

er

blev genereret ved at erstatte

Nhe

I-

BamH

jeg fragment, som koder EGFP i respektive plasmider med

Nhe

I-

BamH

jeg fragment fra pmCherry-C1. Til transfektion og forbigående ekspression af proteiner blev celler transficeret under anvendelse Fugene6 (Roche) ifølge producentens protokol. Kort beskrevet blev 6 pi Fugene6 tilsat til 100 pi serum og antibiotikum DMEM, kortvarigt hvirvlet og inkuberet ved stuetemperatur i 5 min. I alt 1,5 ug DNA blev sat til blandingen, kortvarigt hvirvlet og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter. Blandingen blev derefter tilsat dråbevis til en 35 mm skål indeholdende celler ved 80-90% konfluens, fik lov at henstå ved stuetemperatur i 2-3 min, derefter returneres til inkubatoren. Alle forsøg blev udført mellem 24-48 timer efter transfektion.

Immunofluorescens

Til visualisering af actin, fibronektin, paxillin, og PKA RIa og RIIα underenheder, cellerne blev fikseret i 3,7% formaldehyd i PBS i 10 minutter, permeabiliseret i 10 minutter i PBS indeholdende 0,25% triton x 100, blokeret med PBS indeholdende 3% BSA enten i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C og derefter inkuberet med anti-fibronectin (1:400, BD Transduktion) , anti-paxillin (1:500, BD transduktion), anti-PKA RIa eller RIIα (Genetex 1:200 og BD Transduktion 1:200 henholdsvis) primære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask 3 x 5 min med PBS blev cellerne inkuberet med Alexa-594 koblet æsel-anti-muse-sekundært antistof (Invitrogen, 1:400) og Alexa-488 konjugeret phalloidin (Invitrogen, 1:100) i 1 time ved stuetemperatur. Dækglas blev monteret på mikroskopobjektglas (Fisher) under anvendelse af et lille volumen PermaFluor mountant (Thermo Scientific). Epifluorescens billeder blev taget til fange, selvom 10, 20, 40, og 60X Plan Apo mål på et Nikon Eclipse TE-2000E omvendt mikroskop ved hjælp af de relevante fluoroforen-specifikke filtre (Chroma Technology Corp, Rockingham, VT) og en CoolSnap HQ kamera (Photometrics, Tucson , AZ) kontrolleret af elementer (Nikon) software.

sårheling migration assay

dækglas blev steriliseret ved konsekutiv iblødsætning i 30 minutters intervaller i stigende koncentrationer (70, 95, 100%) EtOH. Dækglassene blev fjernet fra EtOH og lufttørret i vævskultur hætte. Når tørret blev de sterile dækglas overtrukket i 20 ug /ml humant fibronectin fortyndet i sterilt PBS enten natten over ved 4 ° C eller 2 timer ved 37 ° C. En konfluent monolag af celler blev podet på ECM konjugerede dækglas og får lov at adhærere natten over. Et sår blev foretaget i monolaget ved at skrabe en steril p200 pipettespids tværs cellerne, og dækglassene blev vasket en gang med sterilt PBS for at fjerne eventuelle cellerester. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en 10x Plan Apo målsætning om Nikon Eclipse TE-2000E omvendt mikroskop som beskrevet ovenfor.

trypanblåteksklusion Assay

For at vurdere levedygtigheden celle, en 01:01 blanding af trypan blue (0,4%, Sigma) og serumfrit medium indeholdende 1% BSA blev tilsat til cellerne og inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter umiddelbart efter enten fjerne doughnut eller skabe såret i monolaget. Billeder blev taget af periferien af ​​den krans og langs hele margen af ​​såret ved anvendelse af en 10X Plan Apo målsætning på Nikon Eclipse TE-2000E som tidligere beskrevet.

Fremstilling af silikonepakninger

Fyrre g Sylgard 184 silikone elastomer (Ellsworth Lim) og 4 g Sylgard 184 elastomer hærder blev strengt blandet indtil uklar med bobler. Den uklare blanding blev hældt i en steril 10 cm vævskulturskål til en dybde på 2-4 mm i højden. Bobler blev fjernet ved at anbringe skålen i en 850 ml Desi-Vac beholder (Fisher) og evakuere kammeret 60 gange og tillade kammeret at henstå i 10 min. Dette trin blev gentaget to gange, eller indtil blandingen var fri for bobler. Blandingen af ​​silicone fik lov til at hærde ved stuetemperatur i 48 timer eller i en time på en 84 ° C varm plade, indtil fuldt polymeriseret. Den silikone skabelon blev forsigtigt fjernet fra fadet og anbringes på en ren tør overflade egnet til skæring. At fremstille doughnut-formede pakning, blev en 6 mm biopsitang anvendes til at generere en silikone cylinder, og en 2 mm biopsitang blev anvendt til at lave et mindre hul i midten af ​​6 mm cylinder. Silikone “donuts” blev derefter vasket i Liquinox (fortyndet 1:10 i nanopure vand) i 15 min, skyllet 10 gange med nanorent vand, vaskes med 70% EtOH i 15 min, derefter lagret i frisk 70% EtOH indtil brug.

doughnut Migration /invasion Assay

Sterile dækglas blev overtrukket med 20 pg /ml fibronectin som beskrevet ovenfor. Rene, sterile silikone donuts fik lov til at lufttørre før anbringelse på de overtrukne dækglas. En ændring i brydning i donut-dækglas interfacet kan ses som den donut klæber ved konform kontakt. Subsammenflydende celler blev serumudsultet natten før assayet. Cellerne blev trypsinbehandlet og resuspenderet i et passende serumfrit medium indeholdende 1% BSA og talt ved anvendelse af et hæmocytometer. Celler blev udpladet ved konfluens (6000 celler /donut for SKOV-3, COS-7, og HIO-80) i et 10 pi volumen under anvendelse af en steril gel-loading spidsen ind i midten af ​​doughnut-formede pakning til at indeholde dem inden for et begrænset område. Antallet af celler, der kræves for at danne et konfluent monolag afhænger af den valgte ECM, diameteren af ​​den indre brønd i krans, og spredning cellernes evne, og således skal bestemmes empirisk for hver cellelinje. Sterilt PBS blev tilsat omkring pakningen for at forhindre fordampning af det lille volumen af ​​medier. Efter at klæbe natten over blev PBS aspireret, og donuts blev forsigtigt fjernet under anvendelse af en steril pincet. Kernerne blev farvet ved anvendelse af Hoescht 33342 nuklear farvning (Invitrogen, 1:2000 i medier) i 15 minutter ved 37 ° C. Farvningen medier blev fjernet og erstattet med enten komplette medier eller medier indeholdende farmakologiske midler som beskrevet i figurteksterne. For invasion assays blev Hoescht-farvede monolag overlagt med phenol-rød fri Matrigel og inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C for at tillade polymerisering. De indlejrede celler blev derefter suppleret med komplette eller behandlede medier som i migration assay. Indledende billeder blev erhvervet gennem en 2X PlanApo målsætning på et Nikon Eclipse TE-2000E omvendt mikroskop som beskrevet ovenfor. Celler blev enten behandlet med 10 ng /ml EGF eller høj serum (10%) at stimulere migration. Yderligere billeder blev erhvervet efter de angivne tider og indledende og afsluttende statslige billedfiler par blev analyseret ved hjælp af standardindstillingerne for en brugerdefineret skriftlig ImageJ makro (DonutQuant tilgængelige som tekst S1). Kort fortalt makro centre og tærskler både indledende og afsluttende statslige billeder så fjerner langt outlier celler,

dvs.

celler uden for de cirkulære monolag, der er for langt til at kunne tilskrives migration (

f.eks

celler der har løsnet og flød langs et andet område af skålen). En maske af den centrerede, indledende billede er derefter oprettet og overlejret på den endelige tilstand image og alle kernerne uden for grænsen af ​​den oprindelige billedmaske tælles som migrerede celler.

FRET Imaging

SKOV-3 celler, der udtrykker PKA aktivitet biosensor, pmAKAR3 [35], [36] blev skyllet og holdt i Leibovitz L-15 medium for FRET billeddannelse. Celler blev afbildet på et Nikon Eclipse TE-2000E mikroskop med en 60 × /1.4 NA Plan Apo olieimmersionsobjektiv linse og afkølet CCD-kamera. CFP, YFP og FRET billeder blev erhvervet 10 timer efter begyndelsen af ​​assayet. Købet blev sat med 700 ms eksponering og 2 × 2 udsmidningen for alle tre opkøb. Billeder i hver kanal blev underkastet baggrundssubtraktion, og forhold mellem gul-til-cyan farve blev beregnet under anvendelse af FRET Analyzer ImageJ plugin. Pseudofarve billeder blev dannet ved anvendelse af ImageJ ‘Ratio «opslagstabel. Billeder var baggrund-korrigeret ved hjælp af “Træk baggrund” funktionen i ImageJ, med en rullende kugle radius på 500.

Resultater

PKA aktivitet er forøget på forkant af tilfældigt migrere SKOV-3 celler

Tidligere arbejde havde vist diskret aktivering af PKA i vandrende forkant af mange [13], [21], [22], men ikke alle [37] celletyper. For at bestemme om PKA blev aktiveret ved forkanten migrere EOC celler blev SKOV-3 humane EOC-celler transficeret med pmAKAR3, et plasmamembran-directed FRET biosensor for PKA-aktivitet [21], [36] og derefter udpladet på FN-belagte dækglas, stimuleret med 10 ng /ml EGF for 4-6 timer (for at fremme tilfældig, kemokinetisk migration), og overvåges af live-cell imaging. PKA-aktivitet (som angivet ved forhøjede FRET-forhold) blev faktisk diskret og dynamisk forhøjet inden forkanten migrere SKOV-3-celler (figur 1 og Movie S1). Dette antydede, at lokale stigninger i PKA-aktivitet spiller en rolle i reguleringen forkant dynamik, og dermed migrationen af ​​aktivt migrerende EOC celler. Denne hypotese blev støttet af tidligt, sonderende forsøg, hvor SKOV-3 celler var underlagt sårheling eller ridse migration assays i fravær eller tilstedeværelse af udbredte hæmmere af PKA-aktivitet (H89 og MPKI, se materialer og metoder)) og forankring (StHt31; se Materialer og fremgangsmåder). Undersøgelse af cellemorfologi kort efter starten af ​​disse assays viste signifikante virkninger af disse inhibitorer på forkant morfologi og migration (figur S1). Konkret ubehandlede celler migreret ind sårede områder effektivt og med bred, ruffling lamellipodia (figur S1A og D). I modsætning hertil celler, hvori PKA-aktivitet blev inhiberet med den ikke-selektive PKA-inhibitor H89 eller den meget selektiv inhibitor MPKI ikke migrere effektivt og knapt trådte sårrummet, udviser forkant strukturer blottet for flæser men fyldt med fokale adhæsioner – fremkalde et klæbemiddel, spredning fænotype mere end en af ​​migration (figur S1B og D). Celler, hvor PKA forankring blev afbrudt af StHt31 indtastet sårrummet i et større omfang end H89- eller MPKI-behandlede celler, men i modsætning kontrolceller, udviste multiple, uregelmæssigt fordelte ruffling kanter per celle (fig S1c og D). Tilsammen udgør disse resultater understøttes yderligere den hypotese, at EOC cellemigration kan kræve PKA aktivitet og forankring og berettiget yderligere undersøgelser bruger mere sofistikerede metoder og specifikke reagenser.

SKOV-3 celler blev transficeret med pmAKAR3, belagte på fibronectincoatede retter natten over, stimuleret med 10 ng /ml EGF i 4-6 timer og derefter afbildet af FRET mikroskopi. Billeder blev taget til fange hver 30 sek, derefter pseudocolored ifølge FRET ratio (farveskala vist i ramme 0 ‘): denne montage skildrer frames 2 min fra hinanden. For hele sekvens, se video S1. Scale bar = 5 um.

EOC cellemigration reguleres af aktivitet og forankring af PKA

sårheling migration analyser, mens billig og let at implementere, lider flere begrænsninger, ikke mindst som er dødelig skade til celler langs assayet foran og fjernelse af den underliggende ekstracellulære matrix (ECM). Således kan en eksperimentel tilstand, der resulterer i ineffektiv migration i dette assay afspejler, for eksempel til øget følsomhed over for bystander beskadigelse eller svigt producere

de novo

matrix, hvorpå der kan migrere. Derfor, for at fremme og bedre udforske kravet om PKA aktivitet og forankring specifikt til EOC cellemigrering, udviklede vi en forbedret version af en tidligere beskrevet migration assay [38], som let og nøjagtigt måler antallet af celler migrerer i en radial måde ud fra en defineret cirkulær monolag (figur 2; se materialer og fremgangsmåder for detaljer). Vores analyse – opfandt “doughnut-analysen”, efter doughnut-formede silikone pakninger bruges til at etablere monolag – er pålidelig, billig, let at implementere, der gælder for næsten enhver celletype, og skalerbar at opnå relativt høje gennemløb og statistisk signifikans ved hjælp et lille antal celler (~6000), i forhold til andre sammenlignelige «release ‘assays (

f.eks

sår-helende analyser). Derudover, i modsætning sårhelende assays, vores tilgang reducerer både ribbe af ECM protein dækker migration overflade (figur S2) og dødsfald for celler på assayet periferien (Fig S3). For at øge anvendeligheden og nem implementering af analysen, udviklede vi et ImageJ makro ( ‘DonutQuant “, se tekst S1) til hurtigt og automatisk kvantificere migration. Kort fortalt makroen fratrækker en indledende, ‘tid = 0’ billede (taget umiddelbart efter donut fjernelse) fra en senere eller endelige billede og tæller kerner uden for ‘tid = 0’ område (Figur 2C og D). Forsøg med cytochalasin D for at inhibere actin dynamik (Figur 2C og D) samt mitomycin C inhibere cellecyklussens progression (data ikke vist) har bekræftet, at assay måler migration og ikke blot forskydning af monolaget ved celledeling. Vi har anvendt dette assay til måling af migration i en lang række celletyper (herunder CHO-K1, COS 7, HIO-80, HUVEC, MCF7, MCF10A, MDA-MB-231, MDCK, NIH3T3, REF52, og SKOV-3) med sammenlignelig lethed og virkning (A. McKenzie, S. Campbell, A. Howe, upublicerede observationer).

(A) en skematisk fremstilling af donut migration assay, hvor celler podes ved konfluens på en ekstracellulær matrix overtrukne dækglas inden en doughnut-formet silikone pakning. Efter at cellerne stabilt har klæbet, er pakningen fjernes, hvilket tillader cellerne at migrere radialt. Billeder af monolaget indfanges umiddelbart efter doughnut fjernelse og på ethvert tidspunkt derefter, der er egnet til at tillade migration af en given cellelinje. En tilpasset ImageJ makro anvender den oprindelige billede som en subtraktiv maske for at bestemme antallet af migrerede celler i det endelige billede taget ved afslutningen af ​​assayet. Detaljer fremgår af materialer og metoder. (B) Et billede af fem doughnut pakninger på en enkelt 25 mm dækglas; dette tillader facile opsætning af gentagne assays til at øge throughput og generere statistisk signifikante data. (C) COS-7-celler var genstand for donut migration assay i nærværelse af 2 uM cytochalasin D (cytoD) eller DMSO som en vehikelkontrol. Repræsentative billeder taget ved begyndelsen (0 h) og enden (20 timer) af assayet, såvel som maskeret (endelig minus indledende) billeder skildrer migrerede celler er vist. (D) Antallet af migrerede COS-7 celler blev beregnet ved hjælp af ImageJ makro som beskrevet i materialer og metoder. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.E. fem donuts pr dækglas med tre separate dækglas pr behandling. (* = P 0,001).

anvendelse af dette assay undersøgte vi virkningerne af inhibering PKA eller AKAP funktionen på EOC cellemigration ved transfektion SKOV-3-celler med plasmider kodende fluorescerende proteiner (EGFP, mCherry ) fusioneret til peptid inhibitorer af PKA aktivitet eller forankring (se Materialer og fremgangsmåder). Konkret brugte vi det fluorescerende protein mCherry fusioneret til PKA-hæmmer protein PKI (mCherry-PKI) til at hæmme PKA-aktivitet [14], og EGFP fusioneret til RI forankring disruptor (RIAD) [34] og superAKAP

er

(sAKAP

er

) [32] peptider til specifikt forstyrre type I og type-II PKA forankring hhv. Plasmider kodende mCherry alene eller EGFP fusioneret til krypterede RIAD eller sAKAP

er Salg sekvenser blev anvendt som negative kontroller. Disse genetisk indkodede reagenser tillader udsøgt specificitet i inhiberingen af ​​PKA-aktivitet [14] eller inhibering af forankring gennem både RI og RII underenheder [32], [34], samtidig med at påvisning og overvågning af behandlede celler gennem fluorescens mikroskopi. Skelne mellem type-I og type-II forankring er hensigtsmæssig og nødvendig, som type-I og type-II PKA aktivitet kan regulere forskellige signalveje [19], [20] og, mens begge typer af PKA har været impliceret i migration i andre systemer [13], [21] – [23], [39], hverken er blevet vurderet i forbindelse med æggestokkene migration kræft

efter transfektion, cellerne blev udsat for doughnut migration assay og efter. 24 timer, antallet af transficerede celler, som vandrede, samt det samlede antal transficerede celler og det samlede antal af migrerede (transficeret og ikke-transficerede) celler blev kvantificeret (figur 3). Erhvervelse af disse tre tal tillader ekspressionen af ​​migration som procentdelen af ​​migrerede, transficerede celler over det samlede migrerede celler ( ‘MX /TM “) eller, for at kontrollere for forskelle i transfektionseffektivitet mellem plasmider, procentdelen af ​​migreret, transficerede celler frem det samlede antal transficerede celler ( ‘MX /TX’). Under anvendelse af denne metode blev SKOV-3 migration signifikant svækket, når enten PKA-aktivitet (figur 3A og B) eller forankring (figur 3C) blev inhiberet under anvendelse af de genetiske reagenser beskrevet ovenfor. Interessant migration blev inhiberet næsten ligeligt af afbrydelse af forankring gennem enten RI eller RII underenheder (figur 3C), i overensstemmelse med tidligere rapporter om oprettelse vigtigheden af ​​både type-I og type-II PKA forankring i migration af andre celletyper [13] , [21], [22], [39]. Sammenfattende disse data fastslår nødvendigheden af ​​PKA-aktivitet og forankring for migration af EOC celler.

(A) SKOV-3 celler blev transficeret med enten tomme mCherry plasmid eller mCherry-PKI, derefter underkastet donut migration assays. Repræsentant tærsklingsbehandlet billeder af de migrerede celler (Migreret, med kerner pseudocolored grøn), den samlede befolkning i transfekterede celler (transficerede), og en overlejring af disse to billeder vises. Mellemværker skildrer udvidelser af de områder, der er angivet af pladser i de øverste paneler. Således er de samlede migrerede celler ( “TM”) afbildet i grøn, er de totale transficerede celler (TX) afbildet i rød, og de gule kerner skildrer transficerede celler, som migrerede, dvs. migrerede og transficerede celler (MX ‘) . (B) For celler transficeret med enten tomme mCherry (MCH) eller mCherry-PKI (PKI), den gennemsnitlige procent (± S.E.) af migrerede transficerede celler over den samlede antal af migrerede celler ( ‘MX /TM «) blev beregnet. At normalisere for transfektionseffektivitet, gennemsnitlig procent (± S.E.) af migrerede transficerede celler over den samlede antal transficerede celler ( ‘MX /TX’) blev også beregnet. (* = P 0,05) (C) SKOV-3 celler blev transficeret med plasmider kodende EGFP fusioneret til inhibitorer af type-I (RIAD) eller type-II (SAIS) PKA forankring eller deres respektive scrambled kontrol (RIAD scr, Sais scr), derefter underkastet donut migration assays og analyse som beskrevet i (A og B). (** = P 0,001)

Type-II PKA er ansvarlig for førende PKA aktivitet under migration

Da PKA aktivitet blev beriget i forkanten af ​​migrere Skov- 3-celler og at inhibering af PKA-aktivitet og forankring gennem både RI og RII forkrøblede migration, søgte vi at bestemme, om forkanten PKA-aktivitet blev medieret gennem enten type i eller type II-forankring. For at vurdere virkningen af ​​RI- eller RII-AKAP forankring forstyrrelser på lokaliseringen af ​​PKA aktivitet under EOC migration, SKOV-3 celler blev co-transficeret med pmAKAR3 og plasmider udtrykker genetiske inhibitorer af type-I og type-II R-subunit forankring (RIAD og sAKAP

er

henholdsvis) fusioneret til mCherry. Den mCherry fluorescensspektre ikke overlapper med de enten YFP eller CFP og dermed tillade disse fluorescens-mærkede forankringsorganer stoffer, der skal anvendes i forbindelse med FRET mikroskopi. Når transficerede blev cellerne underkastet donut migration assay i 10 timer, hvor efter cellerne blev afbildet via FRET mikroskopi som beskrevet ovenfor. Celler, der udtrykker både forankring disruptor og PKA reporter transficeret plasmider blev afbildet og den fælles fiskeripolitik, YFP, FRET, og mCherry billeder blev erhvervet. For at kvantificere procentdelen af ​​celler, der udviser forkant PKA-aktivitet, det gennemsnitlige FRET ratio på forkanten (FRET

LE; målt 5-25 um fra forsiden af ​​cellen) blev målt i forhold til FRET-forhold i cytoplasmaet (FRET

cyto; målt 25-50 um fra forsiden af ​​cellen (fig 4E)). Ratio værdier blev arkiveret lodret i høj (FRET

LE /FRET

cyto ≥1.5), moderat (FRET

LE /FRET

cyto mellem 1,2 og 1,5), og ingen (FRET

LE /FRET

cyto 1,2) forkant PKA aktivitet.