PLoS ONE: Onkogen funktion DACT1 i tyktarmskræft gennem regulering af β-catenin

Abstrakt

Wnt /β-catenin signalvejen spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​tyktarmskræft.

DACT1

er blevet identificeret som en modulator af Wnt signalering gennem dens samspil med Dishevelled (Dvl), en central formidler af både de kanoniske og noncanonical Wnt veje. Men de funktioner,

DACT1

i WNT /β-catenin signalvej fortsat uklare. Her præsenterer vi beviser for, at

DACT1

er en vigtig positiv regulator i tyktarmskræft gennem regulering af stabilitet og sublocation af β-catenin. Vi har vist, at

DACT1

fremmer kræft celledeling

in vitro

og tumorvækst

in vivo

og forbedrer vandrende og invasive potentiale kolon kræftceller. Desuden, jo højere ekspression af

DACT1

ikke kun øger de nukleare og cytoplasmiske fraktioner af β-catenin, men øger også sin membranassocieret fraktion. Overekspressionen af ​​

DACT1

fører til forøget akkumulering af phosphorylerede β-catenin i cytoplasmaet og især i kerner. Vi har vist, at

DACT1

interagerer med GSK-3β og β-catenin.

DACT1

stabiliserer p-catenin via

DACT1

inducerede effekter på GSK-3β og direkte interagerer med β-catenin proteiner. Niveauet af phosphoryleret GSK-3β på Ser9 er steget betydeligt efter den forhøjede udtryk for

DACT1

.

DACT1

medierer den subcellulære lokalisering af β-catenin via øge niveauet af phosphoryleret GSK-3β hos Ser9 at inhibere aktiviteten af ​​GSK-3β. Tilsammen vores undersøgelse identificerer

DACT1

som en vigtig positiv regulator i tyktarmskræft og foreslår en potentiel strategi for den terapeutiske kontrol af β-catenin-afhængige vej

Henvisning:. Yuan G, Wang C, Ma C, Chen N, Tian Q, Zhang T, et al. (2012) Onkogen funktion

DACT1

i tyktarmskræft gennem regulering af β-catenin. PLoS ONE 7 (3): e34004. doi: 10,1371 /journal.pone.0034004

Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 18, 2011; Accepteret: 21 februar 2012; Udgivet MT: 21. marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Yuan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation of China, nr 30770440. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Mutationer og dysreguleret udtryk af bestanddele af den antikke Wnt signalvejen er knyttet til onkogenese i flere systemer, og har været særligt involveret i initiering af tyktarmskræft [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Over 90% af tarmkræft stammer fra aktive mutationer i Wnt vej [1]. Mutationer er blevet beskrevet i adenomatøs polypose coli (

APC

) gen i tilfælde af familiær adenomatøs polypose (FAP), og denne mutation forekommer også i en høj andel af sporadiske colorektale cancere [9], [10].

APC

mutationer udgør en tidlig begivenhed i tyk- tumorigenese [11].

β-catenin (officielle symbol CTNB1) anses for at være en central aktør i den Wnt signalvejen. Selvom Wnt aktivering kan ske gennem mutationer, der påvirker phosphoryleringssteder inden exon 3 af β-catenin i et mindretal af kolorektale tumorer [12], [13], mange andre dele af Wnt signalvejen bidrage til kolorektal cancer via dysregulating aktiviteten eller lokalisering af β-catenin [14], [15].

DACT1

(Dapper1 /Dpr1) genet, placeret på kromosom 14q22.3, koder et 836 aminosyre protein med et formodet leucin lynlås (LZ) -domænet i den aminoterminale ende og en konsensus PDZ binding (PDZ-B) motiv i den carboxyterminale ende, der tillader

DACT1

protein til at interagere med Dishevelled (Dvl) PDZ-domæne [ ,,,0],16]. Bioinformatiske analyser har vist, at

DACT1

mRNA udtrykkes i amnion, føtal hjerne, øjne, hjerte, voksne hjerne medulla, mavekræft (signetring celle funktioner), RER + kolon tumor, akut lymfoblastær leukæmi, kønsceller tumor , chondrosarcoma, og parathyroidea tumorer [17]. Med udgangspunkt i den evolutionære og funktionelle bevarelse af Wnt signalering molekyler, såvel som den humane kromosomale lokalisering af DACT1,

DACT1

gen forudsiges også at være en kraftig cancerassocieret gen [17].

DACT1

er blevet rapporteret til at blive nedreguleret i hepatocellulært carcinom [18]. En nylig rapport identificeret en sammenhæng mellem

DACT1

udtryk i lungekræft og dårlig histologisk kvalitet, stor tumorstørrelse, omfanget af tumor invasion, og lymfeknude metastaser [19].

Selv om nogle undersøgelser har vist associationer mellem

DACT1

ekspression og cancer, funktionen af ​​

DACT1

i WNT /β-catenin-signalvejen er stadig uklar. En mulig mekanisme er, at Dpr stabiliserer GSK-3β og axin i APC-komplekset som vist ved co-immunopræcipitationsundersøgelser [16]. En anden mulighed er, at Dpr konkurrerer med Fz for binding til PDZ-domænet i Dvl, blokerer derved signaltransduktion via Dvl og dermed hæmmer Dvl-medieret stabilisering af β-catenin [20]. Yau et al. rapporterede, at human Dpr1 blev nedreguleret i hepatocellulært carcinom og denne nedregulering blev korreleret med den cytoplasmatiske akkumulering af β-catenin [18]. Men i denne rapport, har vi fundet, at

DACT1

er overudtrykt i tyktarmskræft, og det virker til at forbedre cellulær proliferation, migration og invasion i tyktarmskræft cellelinjer. Vi har vist, at

DACT1

interagerer med GSK-3β og β-catenin. Vi har endvidere vist, at

DACT1

stabiliserer p-catenin via

DACT1

inducerede effekter på GSK-3β og direkte interagerer med β-catenin. Vi har også påvist

DACT1

hæmmer aktiviteten af ​​GSK-3β via øge niveauet af phosphoryleret GSK-3β hos Ser9, som ændrer subcellulære lokalisering af β-catenin. Det fremmer især β-catenin niveauer plasmamembranen og i kernen.

Resultater

DACT1

er overudtrykt i human coloncarcinom

For at identificere de potentielle roller

DACT1

i udviklingen og progressionen af ​​colon karcinom, brugte vi kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) til at vurdere niveauet af genekspression. Vi sammenlignede ekspression i seks cancervæv til dem i seks parrede prøver af normal kontrol tyktarmsslimhinde. Resultaterne viste, at niveauet af

DACT1

mRNA blev signifikant forhøjet i alle seks prøver af coloncancer (figur 1A). Genekspressionen data blev yderligere bekræftet ved Western blotting, der blev udført med anvendelse af opløselige cellelysater fremstillet ud fra kirurgiske kolektomi prøver. Resultaterne bekræftede, at høje niveauer af

DACT1

protein er til stede i colon cancer (figur 1B).

(A)

DACT1

mRNA niveauer blev analyseret ved brug af kvantitativ real-time RT-PCR-analyse. Prøver af colon adenocarcinom (T, hvide søjler) og normalt udseende kontrol slimhinde (N, sorte søjler) blev analyseret i seks tilfælde af tyktarmskræft. (B) Angivelse af

DACT1

protein i human colon adenocarcinom (T) og normalt udseende kontrol mucosa (N) i seks tilfælde, som bestemt ved Western immunoblotting-analyse. Udtrykket af GAPDH blev anvendt som lastning kontrol.

DACT1

forbedrer celleproliferation

in vitro

og kolon tumorigenese

in vivo

for at forstå funktionen af ​​

DACT1

i tyktarmskræft, udforskede vi effekten af ​​ektopisk

DACT1

udtryk på cellulær vækst in vitro i cellelinjer med forskellige niveauer af endogen

DACT1

udtryk. Efter transfektion med et

DACT1

cDNA ekspressionskonstrukt, SW480 colon cancerceller, som udtrykker meget lave endogene niveauer af

DACT1

, viste en signifikant stigning i cellulær proliferation (figur 2A). Omvendt cellulær proliferation faldt når endogene

DACT1

udtryk blev stille ved stabil transfektion med siRNA vektorer, der målrettet

DACT1

i HCT116, LoVo og HT29 tyktarmskræft cellelinjer, som har meget højere endogene niveauer af

DACT1

(figur 2B-D). For at bekræfte disse resultater, endogene

DACT1

udtryk blev stille ved stabil transfektion med en anden siRNA vektorer (

DACT1

siRNA1), der målrettet forskellige regioner af

DACT1

i HCT116 celler og de samme resultater blev observeret (figur S1A-B)

(A) Venstre:. overekspression af

DACT1

i stabilt transficerede SW480-celler. Til højre: vækstkurve proliferation assay i

DACT1

transficerede SW480-celler (gennemsnit ± SEM, n = 3, * p 0,05 versus tomme vektor-transficerede celler). (B, C, D) Venstre:

DACT1

udtryk i vildtype, kontrol siRNA-transficeret, og

DACT1

siRNA-transficeret HCT116, LoVo og HT29-celler. Højre: vækstkurve assays i

DACT1

siRNA-transficerede HCT116, LoVo og HT29-celler (middel ± SEM, n = 3, * p 0,05 versus vildtypeceller). (E) Gennemsnitlig tumorvolumen vurderes ugentligt efter injektionen af ​​dyr med kontrol siRNA-eller

DACT1

siRNA-transficerede HCT116 celler (middel ± SEM, n = 3, * p 0,05). (F) Repræsentative billeder otte uger efter injektion af mus kolon kræftceller med kontrol siRNA eller

DACT1

siRNA-transficerede HCT116 celler.

For at undersøge effekten af ​​undertrykkelse af

DACT1

på kolon tumorvækst in vivo, HCT116 celler, der stabilt udtrykte en kontrol siRNA eller

DACT1

siRNA blev anvendt. Celler (5 x 10

6) blev injiceret i det subkutane væv af den nøgne mus (n = 8 dyr pr gruppe). Tumorer blev målt ugentligt med en skydelære, og deres mængder blev beregnet efter følgende formel: π /6 × længde × bredde

2 [21]. Alle dyrene injiceret med HCT116 celler som udtrykte kontrol siRNA udviklede tumorer ved 14 dage efter injektion, mens kun 75% (6/8) af det

DACT1

siRNA dyr udviklede tumorer. Fifty-seks dage efter injektionen, tumorer af kontrol siRNA dyr var signifikant større (figur 2F). Det gennemsnitlige tumorvolumen var 2,068.78 ± 561,57 mm

3 i mus injiceret med HCT116 celler som udtrykte kontrol siRNA, sammenlignet med det gennemsnitlige tumorvolumen i mus injiceret med HCT116 celler, der udtrykte

DACT1

siRNA (503,46 ± 178,90 mm

3) (Figur 2E). Disse data viser den vigtige rolle,

DACT1

at fremme væksten af ​​tyktarmskræft celler.

DACT1

forbedrer migration og manglende forankring af tyktarmskræft celler

Anchorage-uafhængig spredning er kendetegnende for onkogen transformation og anses for at være befordrende for spredning af kræftceller væk fra deres oprindelige sted. Med denne viden, vi undersøgte kapacitet

DACT1

at drive forankringsuafhængig vækst tyktarmskræft celler ved blød agar koloni dannelse analyser. Overekspressionen af ​​

DACT1

forbedret forankringsuafhængig proliferation af SW480-celler (figur 3A). Nedregulering af

DACT1

reducerede forankringsuafhængig potentiale HCT116, LoVo og HT29-celler (figur 3B-D og S1c). Desuden observerede vi, at

DACT1

overekspression forbedret vandrende potentiale SW480 celler ved transwell assays (figur 3E og I). Omvendt blev det vandrende potentiale celler faldt når endogene

DACT1

udtryk blev stille ved stabil transfektion med siRNA vektorer, der målrettet

DACT1

i HCT116, LoVo og HT29-celler (Figur 3F-I). Efter disse resultater konkluderer vi, at

DACT1

forbedrer forankring uafhængighed i tyktarmskræft celler og deres vandrende potentiale.

(A) Blød agar assay i

DACT1

transficerede SW480-celler efter 14 dages inkubation. (B, C, D) blød agar-assay i siRNA-transficerede HCT116, LoVo og HT29-celler efter 14 dages inkubation. (E) Repræsentative billeder er vist for overekspression af

DACT1

i stabilt transfekterede SW480 celler. Celler blev podet i en transwell kammer og får lov til at migrere hen over kammeret mod cellespecifik konditioneret medium i 24 timer. Mikrofotografier af farvede migrerende celler blev taget under lysfelt belysning (20 ×). (F, G, H) Repræsentative billeder er vist for

DACT1

siRNA-transficerede HCT116, LoVo og HT29-celler. Celler blev podet i en transwell kammer og får lov til at migrere hen over kammeret mod cellespecifik konditioneret medium i 24 timer. Mikrofotografier af farvede migrerende celler blev taget under lysfelt belysning (20 ×). (I) Kvantificering af migration assay. Resultater blev opnået fra tre separate forsøg hver udført tredobbelt. Migration blev bestemt ved at tælle celler i seks tilfældige mikroskopiske felter per brønd (gennemsnit ± SEM, * p 0,05 versus kontrolgruppen celler).

DACT1

forbedrer invasion af tyktarmskræft celler

in vitro

eller

in vivo

den farligste træk ved malignitet er den invasive og metastatiske potentiale af tumorceller. For at teste, om celle invasion var påvirket af

DACT1

blev virkningerne af

DACT1

på celle invasion gennem Matrigel undersøgt. Overekspression af

DACT1

forbedret invasionen af ​​SW480-celler (figur 4A og E). Nedregulering af

DACT1

reducerede invasive potentiale HCT116, LoVo og HT29-celler gennem Matrigel (figur 4B-E). For at undersøge effekten af ​​

DACT1

lyddæmpning på invasionen af ​​tyktarmskræft celler in vivo, vi inficerede HCT116 celler, der udtrykte en kontrol siRNA eller

DACT1

siRNA. Derefter blev 5 × 10

6 celler injiceret i det subkutane væv af hver nøgen mus (n = 8 dyr pr gruppe). Fifty-seks dage senere, havde tumorer i seks ud af otte kontrol siRNA-transficerede nøgne mus invaderet i muskulaturen, mens kun to af tumorer i

DACT1

siRNA-transficerede dyr havde invaderet i muskulaturen. Disse data yderligere viser, at

DACT1

påvirkede den invasive potentiale for tyktarmskræft celler in vitro og in vivo.

(A) Repræsentative billeder er vist for overekspression af

DACT1

transficerede SW480-celler. Celler blev podet i en invasiv kammer og fik lov at invadere kammeret mod cellespecifik konditioneret medium i 24 timer. Mikrofotografier af farvede invaderende celler blev taget under lysfelt belysning (20 ×). (B, C, D) Repræsentative billeder er vist for

DACT1

siRNA-transficeret HCT116, LoVo og HT29-celler. Celler blev podet i en invasion kammer og fik lov at invadere kammeret mod cellespecifik konditioneret medium i 24 timer. Mikrofotografier af de farvede invaderende celler blev taget under lysfelt belysning (20 ×). (E) Kvantificering af migrationen assay. Resultater blev opnået fra tre separate forsøg hver udført tredobbelt. Invasion blev bestemt ved at tælle celler i seks tilfældige mikroskopiske felter per brønd (gennemsnit ± SEM, * p 0,05 versus kontrolgruppen celler)

DACT1

regulerer cellecyklus selvom stigende. β-catenin-niveauer

for at belyse den mekanisme, som forårsagede de ovenstående resultater yderligere, testede vi proteinniveauer af β-catenin og Wnt /β-catenin målgener, cyclin D1 [8] og c-myc [22]. Vort eksperiment viste, at overekspression af

DACT1

resulterede i en signifikant forøgelse af den samlede niveauer af β-catenin, cyclin D1 og c-myc i SW480-celler (figur 5A). Omvendt

DACT1

siRNA, der formidlede undertrykkelse af endogene

DACT1

udtryk, faldt de samlede niveauer af β-catenin, cyklin D1 og c-myc niveauer i HCT116, LoVo og HT29-celler ( Figur 5B).

(A) Repræsentative Western blots af tomme vektor-transficerede og

DACT1

transficerede SW480-celler. Overekspression af

DACT1

resulterer i opregulering af β-catenin og T-celle faktor (TCF) målgener, cyclin D1 og c-myc. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Repræsentative Western blots af HCT116 og LoVo og HT29-celler, der udtrykker kontrol siRNA eller

DACT1

siRNA. Silencing af

DACT1

udtryk i HCT116 og LoVo og HT29-celler faldt niveauer af total β-catenin, cyklin D1 og c-myc. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (C) Effekten af ​​

DACT1

overekspression på cellecyklus profil SW480 celler. Tre dage efter serum sult blev celler analyseret for deres cellecyklus profil ved FACS. Procentdelen af ​​celler i G1, G2 og S faser er vist. (D, E, F) Effekten af ​​

DACT1

siRNA transfektion på cellecyklus profil HCT116, LoVo og HT29-celler. Tre dage efter serum sult blev celler analyseret for deres cellecyklus profil ved FACS. Procentdelen af ​​celler i G1, vises G2 og S faser.

I betragtning af at cyklin D1 og c-myc er relateret til cellecyklus regulering undersøgte vi effekten af ​​

DACT1

overekspression og lyddæmpning på cellecyklus regulering i tyktarmen kræftceller. I disse eksperimenter blev alle cellerne synkroniseret ved G0 /G1 faserne ved serumudsultning. Celle cyklus profilering ved FACS indikerede, at overekspression af

DACT1

i SW480-celler blev forbundet med en stigning i andelen af ​​celler i G0 /G1 faser (figur 5C). Konsekvent, silencing af

DACT1

ekspression med siRNA resulterede i et øget antal celler i S + G2 /M-faser i HCT116, LoVo og HT29 cellelinjer (figur 5D-F). Disse resultater antyder, at S + G2 /M akkumulering af celler efter

DACT1

nedregulering er specifikt forbundet med tabet af

DACT1

protein. Kollektivt, disse resultater, at

DACT1

fremmer spredning af tyktarmskræft celler ved at lette overgangen fra G1 til S-fasen af ​​cellecyklus.

Udover cyklin D1, CDK4 er et andet centralt faktor, der letter G1 /S overgang. Vi bemærkede, at overekspression af

DACT1

i SW480 celler forøget ekspression af CDK4, mens CDK4 niveauer blev væsentligt reduceret i HCT116, LoVo og HT29-celler, der udtrykte

DACT1

siRNA (figur S2). Tilsammen viser disse resultater klart, at

DACT1

stimulerer celleproliferation og tumorvækst ved at fremme indførelsen af ​​celler i cellecyklus ved at øge niveauet af β-catenin.

DACT 1

forbedrer vandrende og invasive potentiale kolon kræftceller gennem skiftende den subcellulære placering af β-catenin

for at afsløre de midler, som

DACT1

øger β-catenin /TCF-reguleret genekspression, den præcise placering af β-catenin blev observeret under et laser konfokalt mikroskop (LSCM) ved immunofluorescens. Resultaterne viste, at højere ekspression af

DACT1

ikke kun øget de nukleare og cytoplasmiske fraktioner af β-catenin, men også øget sin membranassocieret fraktion. Den ændring i niveauet af β-catenin membranassocieret fraktion var det mest signifikante fund (figur 6A-D og S1D)

(A) mikrofotografier af tom vektor og

DACT1

. – overekspression SW480-celler immunofarvede med et anti-β-catenin antistof (rød). (B, C, D) mikrofotografier af kontrol siRNA og

DACT1

siRNA i HCT116, LoVo og HT29-celler immunofarvede med et anti-β-catenin antistof (rød). (E) Repræsentative blots af β-catenin-niveauer i membranen (MEM), nuklear (Nuc), og cytoplasmatisk (Cyto) fraktioner og de samlede lysater (Lys) i SW480-celler. Laminin B (nuklear ekspression) og GAPDH (cytoplasmatisk ekspression) blev anvendt som indlæsning kontroller. “+” Repræsenterer overekspression

DACT1

. “-” Er tom vektor. (F) Repræsentative blots af β-catenin-niveauer i membranen (MEM), nuklear (Nuc), og cytoplasmatisk (Cyto) fraktioner og de samlede lysater (Lys) i HCT116-celler. Laminin B (nuklear ekspression) og GAPDH (cytoplasmatisk ekspression) blev anvendt som indlæsning kontroller. “+” Repræsenterer kontrol siRNA. “-“. Er

DACT1

siRNA

For at bekræfte disse interessante resultater, ekstrakter fra kontrol /

DACT1

-overexpressing SW480-celler og kontrol /

DACT1

-silenced HCT116-celler blev separeret i membranen, cytoplasmisk, og nukleare fraktioner. Derefter blev den relative forekomst af β-catenin i disse fraktioner analyseret ved Western blotting (figur 6E og F). Tidligere rapporter har vist en vigtig rolle for β-catenin i celleadhæsion som en del af et proteinkompleks der omfatter E-cadherin [23]. E-cadherinekspression mønster i kolon kræftceller var uændret ved

DACT1

dæmpning eller overekspression (Figur S3). Disse data antyder, at forøgede niveauer af

DACT1

påvirke β-catenin-niveauer og β-catenin /TCF-afhængig transkription med aktiveringen af ​​Wnt signalvejen. De foreslår også den mulighed, at

DACT1

øger vandrende og invasive potentiale tyktarmskræft celler via β-catenin-medieret stabilisering af adherens krydset.

Sammenhæng mellem

DACT1

og membran-associeret β-catenin udtryk

in vitro

in vivo

Ud fra resultaterne af de ovennævnte eksperimenter, fandt vi, at

DACT1

WAS højt udtrykt i humane coloncancerformer og at det fremmet cellevækst, migrering og invasion potentiale coloncancerceller gennem dets virkninger på β-catenin signalering. Baseret på disse resultater, vi hypotese, at

DACT1

ekspressionsniveauerne af membran-associeret β-catenin ville være positivt korreleret i colon cancer cellelinjer og primære tyktarmskræft. Som vist i figur 7A og B, niveauerne af

DACT1

og β-catenin i colon cancer cellelinier blev korreleret. De højeste niveauer af β-catenin på cellemembranen blev observeret i HCT116 celler med høje niveauer af endogen

DACT1

. Intermediære niveauer af β-catenin på cellemembranen og

DACT1

proteiner blev fundet i HT29-celler. Både membran-associeret β-catenin og

DACT1

blev minimalt udtrykt i SW480 celler.

(A) Semikvantitativ RT-PCR-analyse af

DACT1

udtryk i HCT116, HT29 og SW480-celler. GAPDH blev anvendt som kontrol. (B) Immunofluorescensanalyse af

DACT1

β-catenin udtryk i HCT116, HT29 og SW480 celler. Original forstørrelse, 40 ×. (C, D) HE-farvning af prøver af normal human colon mucosa (N) og adenocarcinom (T) væv ved et anti-β-catenin antistof. Original forstørrelse, 40 ×. (E, F) immunofluorescens (IF) farvning af prøver af normal human colon mucosa (N) og adenocarcinom (T) væv ved et anti-β-catenin antistof. Original forstørrelse, 40 ×. (G, H) Immunohistokemisk (IHC) farvning af prøver af normal human colon mucosa (N) og adenocarcinom (T) væv ved et anti-β-catenin antistof. Original forstørrelse, 40 ×.

For at undersøge forholdet mellem

DACT1

membran-associeret β-catenin udtryk i tyktarmskræft videre, blev immunohistokemiske og immunofluorescens analyser udført af β-catenin i human kolon normale og adenocarcinom væv (de seks ovennævnte tilfælde). Vi observerede fokal farvning af membran-associeret β-catenin i alle seks tumorer (100%; Figur 7C-H). Disse resultater korrelerer godt med de tidligere resultater med hensyn til p-catenin ekspression i colon cancercellelinier. Disse resultater bekræfter, at forhøjede niveauer af membran-associeret β-catenin kan være afhængig af den forhøjede ekspression af

DACT1

.

DACT1

interagerer med β-catenin og komponenterne af β-catenin ødelæggelse kompleks til at stabilisere β-catenin

Vi var interesserede i at klarlægge den mekanisme, som forhøjede niveauer af

DACT1

medført øget β-catenin udtryk. I mangel af Wnt-ligander, er cytoplasmiske niveauer af β-catenin reguleret af ødelæggelsen kompleks, der indeholder axin, APC, og glycogensynthasekinase-3β (GSK-3β), hvor β-catenin phosphoryleres af GSK-3β hos flere serin og threoninrester i dets N-terminus. Phosphoryleret β-catenin derefter ubiquitinerede, der fører til dens hurtige proteasomalaktivitet nedbrydning [4], [24], [25], [26], [27], [28]. For at bestemme om

DACT1

øger β-catenin-niveauer ved at påvirke β-catenin stabilitet, HCT116 celler (med eller uden

DACT1

lyddæmpning) blev inkuberet med 10 pg /ml cycloheximid (CHX) for at forhindre nye β-catenin-syntese. Derefter blev β-catenin-niveauer målt ved Western blotting for at afspejle graden af ​​β-catenin proteinnedbrydning. Silencing af

DACT1

ekspression signifikant forøgede β-catenin nedbrydningshastighed, hvilket resulterer i en tydelig reduktion i niveauerne af resterende β-catenin (figur 8A). Denne virkning af

DACT1

på β-catenin stabilitet blev bekræftet af en immunofluorescens assay. Vi fandt, at β-catenin blev nedbrudt hurtigere i HCT116 celler, der udtrykte

DACT1

siRNA end i HCT116 celler, der udtrykker kontrol

DACT1

siRNA (figur 8B).

(A ) Western blot-assays i HCT116-celler blev udført for at bestemme β-catenin stabilitet. (B) immunofluorescensassays i HCT116-celler blev udført for at bestemme β-catenin stabilitet. (C) Cellelysater fra SW480-celler transficeret med GFP-

DACT1

blev underkastet immunpræcipitering (IP) med anti-axin, anti-GSK-3p, eller anti-β-catenin antistoffer. Immunkomplekser blev opløst ved SDS-PAGE og underkastet Western blot-analyser med et anti-GFP-antistof. Blotting med et anti-GAPDH-antistof udviste lige belastning. (D) Subcellulær co-lokalisering af endogene

DACT1

β-catenin,

DACT1

og GSK-3β i HT29-celler. (E) Cellelysater fra HT29-celler blev udsat for immunpræcipitering (IP) med en anti-

DACT1

antistof. Immunkomplekser blev opløst ved SDS-PAGE og underkastet Western blot-analyser med anti-GSK-3β, eller anti-β-catenin antistoffer. Blotting med et anti-GAPDH antistof viste lige belastning.

For at sikre den mekanisme, som

DACT1

påvirkninger β-catenin stabilitet, vi undersøgte, om

DACT1

interagerer med komponenterne af multiproteinkompleks der regulerer β-catenin stabilitet. Vores co-immunopræcipitering analyse viste colokalisering af

DACT1

og GSK-3β,

DACT1

Axin i SW480 celler stabilt transficeret med et GFP-mærket

DACT1

konstruere (figur 8C ). Desuden

DACT1

gjorde interagere med β-catenin i SW480 celler, overudtrykt

DACT1

(figur 8C). Vi derefter undersøgte colokalisering af

DACT1

med GSK-3β, og

DACT1

med β-catenin i vildtype HT29-celler (uden APC eller β-catenin mutationer) (Figur 8D-E) . Disse konsistente resultater angivet som

DACT1

interfererer med GSK-3β-afhængig phosphorylering af β-catenin af ødelæggelsen kompleks, og

DACT1

påvirker β-catenin stabilitet ved at interagere med β-catenin.

DACT1

påvirker subcellulære lokaliseret β-catenin gennem inhibering af GSK-3β aktivitet

β-catenin er kendt at akkumulere i kernen [29] og dets niveauer er spekuleret at stige på membranen lamellipodia, membran adherensovergange og membran flæser [30], [31] som reaktion på Wnt signalering eller lægemiddel-medieret inhibering af GSK-3β aktivitet. Desuden er baseret på vores resultater, vi spekuleret på, at

DACT1

hæmmer GSK-3β. Nogle faktorer, der inhiberer GSK-3β via phosphorylering af Ser9 er blevet rapporteret [32], [33]. Vi observerede protein ekspressionsniveauer af GSK-3β med phosphoryleret Ser9 i HCT116-celler (med eller uden

DACT1

silencing). Resultaterne viste, at niveauerne af phosphoryleret GSK-3β hos Ser9 blev signifikant forøget i HCT116-celler, som udtrykte kontrol siRNA (figur 9A og B). For at bekræfte at

DACT1

reguleret lokaliseringen mønster af β-catenin gennem inhibering af GSK-3β, testede vi virkningen af ​​GSK-3β-inhibering på HCT116 celler, der udtrykte enten kontrollen siRNA eller

DACT1

siRNA. Vi observerede en tydelig og signifikant forøgelse i celler, som viste membranassocieret β-catenin-farvning efter de blev behandlet med 40 mM LIC1 i 1 time (figur 9C og D). Vi yderligere testet ekspressionen af ​​aktiveret β-catenin i SW480-celler. Resultaterne viste forøget akkumulering af phosphorylerede β-catenin i cytoplasmaet og især i kerner af SW480-celler, som overudtrykte

DACT1

(figur 9E og F). Alle disse resultater støtter den konklusion, at

DACT1

påvirker subcellulære lokalisering af β-catenin gennem hæmning af GSK-3β aktivitet.

(A) mikrofotografier af kontrol siRNA og

DACT1

siRNA udtrykkende HCT116 celler immunofarvede med et anti-phospho-GSK-3β (Ser9) antistof (rød). Silencing af

DACT1

i HCT116 celler nedsætter niveauer af phospho-GSK-3β (Ser9). (B) Repræsentative Western blots af HCT116 celler, der udtrykker kontrol siRNA og

DACT1

siRNA. Silencing af

DACT1

i HCT116 celler nedsætter niveauer af phospho-GSK-3β (Ser9). GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (C) HCT116 celler, der udtrykker kontrol siRNA og

DACT1

siRNA blev behandlet i 1 time med GSK-3p hæmmende lægemidler (40 mM LiCI). Celler blev farvet og analyseret ved mikroskopi for at detektere ekspressionen af ​​β-catenin. LiCI behandling af HCT116 celler øger niveauerne af β-catenin på plasmamembranen. (D) Repræsentative Western blots af LiCl-behandlede HCT116 celler, som udtrykker enten kontrol siRNA eller

DACT1

siRNA. LiCI behandling af HCT116 celler øger niveauerne af β-catenin på plasmamembranen. KDEL blev anvendt som en loading kontrol. 1: HCT116 celler, der udtrykker kontrol siRNA, der var blevet behandlet med 40 mM LiCI i 1 time. 2: HCT116 celler, der udtrykker kontrol siRNA, der ikke var blevet behandlet med LiCI. 3: HCT116 celler, der udtrykker

DACT1

siRNA, der blev behandlet med 40 mM LiCI i 1 time; 4: HCT116 celler, der udtrykker

DACT1

siRNA, der ikke var blevet behandlet med LiCl. (E) mikrofotografier af kontrol siRNA og

DACT1

siRNA udtrykkende HCT116 celler immunofarvede med et anti-phospho-GSK-3β (Ser9) antistof (rød). Silencing af

DACT1

i HCT116 celler nedsætter niveauer af phospho-GSK-3β (Ser9). (F) Repræsentative Western blots af HCT116 celler, der udtrykker kontrol siRNA og

DACT1

siRNA. Silencing af

DACT1

i HCT116 celler nedsætter niveauer af phospho-GSK-3β (Ser9). GAPDH blev anvendt som en belastning kontrol.

Diskussion

Øget udtryk for

DACT1

har onkogene funktioner i tyktarmskræft

Vores undersøgelser har vist, at

DACT1

er overudtrykt i humane colon adenokarcinomer. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere observation, at

DACT1

blev opreguleret i invasive brysttumorer [34].