PLoS ONE: Lichen sekundære metabolitter i Flavocetraria cucullata Exhibit Anti-Cancer effekter på humane cancerceller gennem induktion af apoptose og Undertrykkelse af Tumordannende Potentials

Abstrakte

Laver er symbiotiske organismer, som producerer forskellige sekundære metaboliske produkter. I den foreliggende undersøgelse testede vi den cytotoksiske aktivitet af 17 lavarter mod flere humane cancerceller og yderligere undersøgt de molekylære mekanismer bag deres anti-cancer-aktivitet. Vi fandt, at blandt 17 Laver arter,

F. cucullata

udviste den mest potente cytotoksicitet i flere humane cancerceller. Højtryksvæskekromatografi afslørede, at acetonen ekstrakt af

F. cucullata

indeholder usnic syre, salazinic syre, Squamatic syre, Baeomycesic syre, d-protolichesterinic syre, og lichesterinic syre som underkomponenter. MTT-assay viste, at cancercellelinjer var mere sårbare over for de cytotoksiske virkninger af ekstrakten end ikke-cancercellelinier. Endvidere blandt de identificerede underkomponenter, usnic syrebehandling havde en lignende cytotoksisk virkning på cancercellelinjer, men med lavere styrke end ekstrakten. Ved en dødelig dosis, behandling med ekstrakten eller med usnic syre i høj grad øget den apoptotiske cellepopulation og aktiveres specifikt den apoptotiske signalvej; Men ved hjælp af subletale doser, ekstrakt og usnic syrebehandling faldt kræftcellen motilitet og hæmmet

i

vitro

i

vivo

tumorigene potentialer . I disse celler observerede vi signifikant reducerede niveauer af epitel-mesenkymale overgang (EMT) markører og fosfor-Akt, mens fosfor-c-Jun og fosfor-ERK1 /2 niveauer kun var marginalt berørte. Samlet, anti-cancer-aktivitet af ekstraktet er mere potent end den for usnic syre alene. Tilsammen

F. cucullata

og dens delkomponent, usnic syre sammen med ekstra komponent, udøve anti-cancer effekter på humane kræftceller via induktion af apoptose og hæmning af EMT

Henvisning:. Nguyen TT, Yoon S, Yang Y, Lee HB, Oh S, Jeong MH, et al. (2014) Lichen sekundære metabolitter i

Flavocetraria cucullata

Exhibit Anti-Cancer Virkninger på humane cancerceller gennem induktion af apoptose og Undertrykkelse af Tumordannende Potentials. PLoS ONE 9 (10): e111575. doi: 10,1371 /journal.pone.0111575

Redaktør: Chengfeng Yang, Michigan State University, USA

Modtaget: 13 juli, 2014 Accepteret: September 26, 2014; Udgivet 31. oktober, 2014

Copyright: © 2014 Nguyen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Research Program Basic Science gennem National Research Foundation Korea (NRF-2013R1A1A2004677, NRF-2013R1A2A2A07067609) og af Sydkorea National Research Resource center Program (NRF-2012M3A9B8021726). Denne undersøgelse har også modtaget støtte fra en forskningsbevilling finansieret af Sunchon Research Center for Natural Medicine. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en væsentlig dødsårsag på verdensplan. Som en gruppe, kræft tegner sig for ca. 13% af alle dødsfald hvert år med de mest almindelige er lungekræft (1,37 millioner dødsfald), mavekræft (736,000 dødsfald), levercancer (695.000 dødsfald), kolorektal cancer (608.000 dødsfald), og brystkræft (458.000 dødsfald) [1]. Invasiv cancer er den hyppigste dødsårsag i den udviklede verden og den næststørste årsag til dødsfald i udviklingslandene [2], så disse grunde forskellige cancerterapier er blevet udviklet, herunder en lang række anticancermidler med kendt cytotoksiske virkninger på cancerceller.

Laver er symbiotiske organismer, som regel består af en svampe partner (mycobiont) og en eller flere fotosyntetiske partnere (photobiont), der er oftest enten en grøn alge eller en cyanobakterie [3] . Selv den dobbelte karakter af de fleste laver er nu almindeligt anerkendt, er det mindre almindeligt kendt, at nogle laver er symbioser involverer tre (trepartsaftaler laver) eller flere partnere. Generelt findes der laver som diskret thalli og implicit behandles som individer i mange undersøgelser, selvom de kan være et symbiotisk enhed involverer arter fra tre riger. Fra et genetisk og evolutionært perspektiv, kan laver ikke betragtes som individer, men snarere som kompositter, og det har store konsekvenser for mange områder af undersøgelse som udvikling og reproduktion.

Mange lichen sekundære produkter er ubehagelig og kan tjene som defensive forbindelser mod planteædere samt nedbrydere. Af denne grund er disse sekundære produkter, der ofte anvendes af den farmaceutiske industri som antibakterielle og antivirale forbindelser [4], [5]. Desuden har lav og deres sekundære metabolitter længe været undersøgt for anti-cancer terapi [6] – [15]. I den foreliggende undersøgelse, vi testede den cytotoksiske aktivitet af 17 lavarter indsamlet fra de rumænske Karpaterne mod flere humane cancerceller og yderligere undersøgt de molekylære mekanismer bag deres anti-cancer aktivitet for at identificere potentielle forbindelser til nye anti-cancer.

Materialer og Metoder

Udarbejdelse af lichen ekstrakter

thalli af

F. cucullata

blev indsamlet fra Rumænien i 2011 under ekskursion i Nationalparken Calimani og Natural Park Bucegi arrangeret af Dr. Crişan på Babes-Bolyai Universitet, Cluj-Napoca, Rumænien. Tilladelsen til at indsamle lichen prøver fra de steder blev udstedt af administrationen af ​​nationalparken Calimani og administration naturparken Bucegi, med godkendelse af kommissionen for Natural Monumenter (rumænsk Academy). De feltstudier ikke indebar nogen truede eller beskyttede arter. De dubletter blev deponeret i den koreanske Lichen Research Institute (KoLRI), Sunchon National University, Korea. Fint tørret formalet thalli af lav (150 g) blev ekstraheret under anvendelse af acetone i et Soxhlet ekstraktor. Ekstrakterne blev filtreret og derefter opkoncentreret under reduceret tryk i en rotationsfordamper. De tørre ekstrakter blev opbevaret ved -25 ° C indtil yderligere anvendelse. Ekstrakterne blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) for alle forsøg.

Højtryksvæskekromatografi (HPLC) analyse af lichen materialer

Tørre lichen ekstrakter blev genopløst i 2 ml acetone og derefter underkastet HPLC (SHIMADZU, LC-20A). HPLC-analyser blev udført på YMC-Pack ODS-A (150 × 3,9 mm I.D.) omvendt-fase-søjle fuldstændigt endeafsluttet C18 materiale (partikelstørrelse, 5 um, porestørrelse, 12 nm). Eluering blev udført ved en strømningshastighed på 1 ml /min under følgende betingelser: kolonne temp, 40 ° C; opløsningsmiddelsystem, methanol: vand: phosphorsyre (80:20:1, vol /vol /vol) før efterfølgende injektion. Analysen blev overvåget af en fotodiode array detektor (SPD-M20A) med en række 190-800 nm under hele HPLC løb. Observerede toppe blev scannet mellem 190 og 400 nm. Prøven injektion volumen var 10 uL. De standarder, der anvendes blev fremstillet af følgende kilder: salazinic syre (t

R = 2,27 ± 0,2 min) isoleret fra lav

Lobaria pulmonaria,

usnic syre (t

R = 11,3 ± 0,3 min) fra

Usnea longissima

protolichesterinic syre (t

R = 22,3 ± 0,2 min) og lichesterinic acid (t

R = 26,5 ± 0,2 min) fra lichen

Cetraria islandica

.

Cell kultur

Den menneskelige kræftceller HT29 (tyktarmskræft), AGS (mavekræft), A549 (lungekræft), og CWR22Rv-1 (prostatakræft) blev opretholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Gen Depot, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gen Depot, USA) og 1% penicillin og streptomycin (RPMI komplet medium) (Gen Depot, USA). HaCaT (human keratinocyt), NIH 3T3 (muse embryonale fibroblastceller), HEK293T (human embryonisk nyre) -celler, blev RIE (rotte intestinal epithelial) celler, og Madin-Darby hunde nyre (MDCK) celler opretholdt i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM ) (Gen Depot, USA) suppleret med 10% FBS og 1% penicillin og streptomycin. Celler blev dyrket i 5% CO

2 i en fugtig atmosfære ved 37 ° C. Cellelinier blev indkøbt fra den koreanske cellelinie Bank (https://cellbank.snu.ac.kr), Korea.

MTT assay

Lichen ekstrakter blev opløst i DMSO (Sigma-Aldrich , St. Louis, USA) og serielt fortyndet med DMEM eller RPMI 1640 at opnå koncentrationer af 6,125, 12,5, 25, 50, 100 ug /ml. Celler (2 x 10

4 celler /brønd) blev podet på en plade med 96 brønde, dyrket natten over, og derefter behandlet med acetone ekstrakt eller vigtigste forbindelser med

F. cucullata

ved koncentrationer på 100 pg /ml eller pM til 10 ug /ml eller pM i 48 timer. Når behandlingen er afsluttet, blev kulturer suppleret med MTT. Efter inkubering med MTT ved 37 ° C blev celler lyseret med lysepuffer indeholdende 50% DMSO og 20% ​​SDS, og absorbansen blev målt ved 570 nm under anvendelse af en mikropladelæser (VERSAmax, Molecular Devices, Minnesota, USA). Procentdelen af ​​levedygtige celler blev beregnet ud fra følgende formel: Procent cellernes levedygtighed = (optisk densitet (OD) af eksperimentet prøver /OD af kontrol) × 100. IC

50 værdier blev beregnet ved hjælp af statistiske Package for Social Science (SPSS) software.

Fluorescens mikroskopi af apoptotisk morfologi

Celler blev dyrket på kammer slides med en tæthed på 4 × 10

5 celler /brønd og lov til at vedhæfte natten, efterfulgt af behandling med

F. cucullata

acetone ekstrakt eller usnic syre i 24 timer eller 48 timer. Celler blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og inkuberet med Annexin V FITC mærkning opløsningen i 15 minutter. Derefter blev cellerne vasket to gange i PBS og analyseret ved anvendelse af et Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co, Ltd, Kawasaki, Japan) fluorescensmikroskop. Salg

Celler blev dyrket som beskrevet ovenfor. Efter 24 timer eller 48 timers behandling med

F. cucullata

acetone ekstrakt eller usnic syre blev celler vasket med PBS tre gange og fikseret i 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur, derefter inkuberet i 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) i 30 minutter . Efterfølgende blev prøverne farvet med Hoechst 33257 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ved stuetemperatur efter vask tre gange i fikseringsopløsning i PBS. Cellerne blev vasket to gange i PBS og monteret på en glasplade. Glassene blev analyseret ved hjælp af et Nikon Eclipse 400 (Nikon Instech Co., Ltd., Kawasaki, Japan) fluorescerende mikroskop og evalueret som procentdelen af ​​celler med kondenserede eller fragmenterede kerner fra et samlet antal på 300 celler.

flowcytometri assay for cellecyklus

efter 24 timers inkubation, ubehandlet og acetone udledning af de eller usnic syrebehandlet MDCK, HEK293T, HT29, AGS, A549, og CWR22Rv-1 celler blev trypsiniseret. Derefter blev en RNase-inhibitor tilsat og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev prøverne centrifugeret for at fjerne supernatanten, og pellet celler blev fortyndet i 100 pi propidiumiodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) og inkuberet i yderligere 30 minutter ved 4 ° C. Flowcytometri blev udført med en FACS Caliber (BD Biosciences, San Diego, USA).

sårheling assay

AGS og A549-celler blev udpladet med en tæthed på 2,5 x 10

5 celler /brønd på 6-brønds vævskulturplader (Corning, New York, USA) og dyrket natten over til konfluens. Monolag celler blev ridset med en pipettespids for at skabe et sår. Cellerne blev derefter vasket to gange med serumfrit RPMI 1640 til fjernelse af flydende celler og inkuberet i medium med 5 ug /ml

F. cucullata

ekstrakt eller 10 uM usnic syre. Fotografier af celler blev udtaget ved 0, 24, 48, og 72 timer efter sårdannelse at måle bredden af ​​såret. Afstanden migreret af cellerne blev beregnet som forskellen mellem kanterne af såret på tidspunkt 1 og på tidspunkt 2. For hver cellelinje, blev et gennemsnit på otte sår assays udtages til bestemmelse af gennemsnittet af migration ved en given koncentration af acetone ekstrakt eller usnic syre. Forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Invasion assay

Tumorcelleinvasion blev analyseret under anvendelse af et transwell kammer (Corning Coster, Corning, NY, USA) assay med en topchamber af 8 um pore- størrelse polycarbonatmembran coatet med 1% gelatine. AGS og A549-celler blev udpladet ved 2,5 x 10

5 celler /brønd i dyrkningsmedium indeholdende 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i det øvre rum af kammeret. Det nedre rum fyldtes med dyrkningsmedium indeholdende 0,2% BSA og 1 ug /ml fibronectin som kemo-tiltrækningsstof. Celler blev dyrket i fravær eller nærvær af 5 ug /mL acetone ekstrakt eller 10 uM usnic syre i 24 timer. De øvre kamre blev fikseret og farvet med Diff Quick kit (Sysmex, Kobe, Japan). De invaderede celler blev analyseret under et lysmikroskop i fem tilfældigt valgte felter. Hvert eksperiment blev udført tre gange. Resultaterne udtrykkes som det gennemsnitlige antal celler migrerer per høj-power felt. Salg

klongenicitetsassayet Salg

A549 og AGS celler blev vasket, trypsiniseret og resuspenderet i RPMI 1640. Celler (500 celler /brønd) blev podet på plader med 6 brønde i 2,5 ml RPMI 1640-medium per brønd og blev inkuberet i vedhæftet fil. Efter 48 timers behandling blev mediet indeholdende acetone ekstrakt eller usnic syre erstattes med frisk medium i 12 dage. Kolonier blev fikseret i 4% paraformaldehyd, farvet med 0,5% krystalviolet og talt under et stereomikroskop. Udpladningseffektiviteten (PE) af ubehandlede celler og overlevelsen fraktion (SF) af behandlede celler blev derefter bestemt (n = 3) [16].

blød agar koloni-dannelse assay

AGS (1 × 10

4) og A549 (1 × 10

4) celler blev suspenderet i 1,5 ml blød agar (0,35% agarose i RPMI komplet medium), udpladet på 1,5 ml størknet agar (0,6% agarose i RPMI komplet medium) i 6-brønds plader og dyrket i 3 uger. Celler blev fodret to gange om ugen med celledyrkningsmedier indeholdende acetone ekstrakt (1 ug /ml eller 5 ug /mL), usnic syre (5 uM eller 10 uM), lichesterinic acid (10 uM) eller DMSO (0,01%) . Pixel intensitet koloni område blev målt ved IMT iSolution software (IMT i-Solution Inc., Northampton, NJ, USA) i tilfældigt udvalgte mikroskopfelter i hver plade. For at måle procent område koloni, pixel mængde koloni område var normaliseret til pixel × pixel firkant. Dataene repræsenterer gennemsnittet af tre eksperimenter.

Påvisning af proteiner i cellelysater Salg

Celler behandlet med forskellige koncentrationer af acetone ekstrakt eller underkomponenter i 48 timer blev høstet og analyseret ved Western-blot som beskrevet tidligere [17]. De anvendte antistoffer blev indkøbt fra cellesignalering Technology (PARP, caspase-3, Bax, Bcl_xL, α-tubulin), og BD Biosciences (E-cadherin). Alle resultater er repræsentative fra mindst tre uafhængige forsøg. For at analysere niveauet af phosphoproteiner blev bead-baserede multiplex assay (Bio-Plex phosphoprotein assay, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) udført ifølge producentens anvisninger [18], [19]. Kort fortalt dette assay måles multiple phosphoprotein signaler fra en enkelt lysat [20].

QRT-PCR-analyse

Totalt RNA (1 ug) fra hver gruppe af behandlede celler blev omdannet til cDNA under anvendelse af en M-MLV revers transkriptase-kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og SYBR green (Enzynomics, Seoul, Korea). De anvendte primere til real-time PCR, var E-cadherin (fremad) 5′-cagaaagttttccaccaaag-3 ‘og (revers) 5′-aaatgtgagcaattctgctt-3′; N-cadherin (frem) 5’-ctcctatgagtggaacaggaacg-3 ‘og (tilbage) 5′-ttggatcaatgtcataatcaagtgctgta-3′; Snail (frem) 5’-gaggcggtggcagactag-3 ‘og (tilbage) 5′-gacacatcggtcagaccag-3′; Twist (frem) 5’-cgggagtccgcagtctta-3 ‘og (tilbage) 5′-tgaatcttgctcagcttgtc-3′; GAPDH (frem) 5’-atcaccatcttccaggagcga-3 ‘og (tilbage) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3’. QRT-PCR-reaktion og analyse blev udført ved hjælp af CFX (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

In vivo tumorgenicitet assay

Den eksperimentelle protokol blev godkendt af Chonnam National University Medical School Forskning Institutional Animal Care Brug udvalget. Vedligeholdelse af dyr og alle in vivo eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de vejledende principper i pasning og anvendelse af dyr (DHEW publikation, NIH 80-23). A549-celler blev fremstillet i RPMI 1640-medium (1 x 10

6 celler /mus) og suspenderede celler blev forbehandlet med en tiendedel af dødelige koncentration af

F. cucullata

acetoneekstrakt, usnic syre, lichesterinic syre eller DMSO (Vehicle) lige før injektion. Celler blev injiceret subkutant i flanken region nøgne Balb /c mus og tumor blev målt efter to uger.

Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev analyseret tredobbelt (n = 3). Data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS-version 17. Behandling virkninger blev bestemt under anvendelse af envejs ANOVA post-hoc analyse. En p-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant mindre andet er angivet

Resultater

Flavocetraria cucullata

acetone ekstrakt har kraftige cytotoksiske virkninger på cancerceller

Til. identificere cytotoksiske stof fra rumænske laver, vi målte IC

50 værdier af acetone ekstrakter fra 17 lichen arter på HT29 (kolorektal cancer celler) og AGS (gastrisk kræftceller) celler. Blandt de lavarter,

F. cucullata

udøvede de mest potente cytotoksiske virkninger på både HT29 (IC

50 = 10,9 mg /ml) og AGS (IC

50 = 11,6 mg /ml) i forhold til andre lavarter (IC

50 værdier lå omkring 25-100 ug /ml, tabel S1 i File S1). For at kontrollere, om cytotoksicitet

F. cucullata

ekstrakt var specifikke for kræftceller, vi gennemførte yderligere tests om yderligere kræftceller herunder A549 (lungekræft celler) og CWR22Rv-1 (prostata kræftceller) celler og på ikke-cancerceller, herunder MDCK (Madin-Darby hunde nyre ) og RIE (rotte intestinal epitelcelle), NIH 3T3 (mus embryonisk fibroblast), HaCaT (human keratinocyt) celler. Resultaterne viste, at

F. cucullata

acetone ekstrakt specifikt påvirkede levedygtigheden af ​​kræftceller, mens ikke-kræftceller ikke blev alvorligt beskadiget (fig. 1A).

(A) Procent levedygtighed celler behandlet med acetone ekstrakt af

F. cucullata

. Cellerne blev behandlet med

F. cucullata

ekstrakt i en koncentration i området 10-50 pg /ml i 48 timer, og cellelevedygtighed blev målt ved en MTT assay. (B) højtryksvæskekromatografi kromatogrammer af

F. cucullata

ekstrakt. Identiteten af ​​hver delkomponent er noteret på den tilsvarende top. (C-D) Den procentvise levedygtighed af celler behandlet med enten usnic syre (C) eller lichesterinic acid (D). Celler blev behandlet med den angivne delkomponent af

F. cucullata

i en koncentration i området fra 12.5-50 uM i 48 timer, og cellelevedygtighed blev målt ved en MTT assay. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. (Standard fejl af middelværdien), n = 3.

At identificere underkomponenterne i

F. cucullata

, HPLC blev udført på acetone ekstrakt af

F. cucullata

; de resulterende chromatogrammer og massespektrometrisk analyse af hver top er vist i figur 1B og tabel S2 i File S1. Som vist i figur 1B, salazinic syre (Tr = 2,268 min), squamatic syre (Tr = 2,855), baeomycesic syre (Tr = 4,646), usnic syre (Tr = 11,327), d-protolichesterinic syre (Tr = 22,315), og lichesterinic syre (Tr = 26,595), blev påvist i acetone ekstrakt af

F. cucullata

. Blandt underkomponenterne, usnic syre havde den højeste top (% intensitet = 91,49 ± 0,0025), mens d-protolichesterinic syre og lichesterinic syre viste lavere toppe (% intensitet = 2,27 ± 0,1, 2,22 ± 0,1, henholdsvis) (tabel S2 i File S1 ). Efter at have identificeret de lichen underkomponenter, to vigtigste metabolitter, usnic syre (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) og lichesterinic syre (isoleret fra

F. Cucullata

ekstrakt, som deler deres kemiske struktur med d-protolichesterinic syre undtagen en umættet carbon-binding) blev anvendt til yderligere eksperimenter. For at afgøre, hvilken underkomponent var ansvarlig for cytotoksicitet af lav, målte vi cytotoksicitet usnic syre og lichesterinic syre og fandt, at usnic syre viste lignende cytotoksiske virkninger i ikke-cancer og kræftceller, mens lichesterinic syre udviste ingen tilsyneladende cytotoksisk virkning på nogen af ​​de testede celler (fig. 1C og 1D). I tabel S3 i File S1, er IC

50 værdier acetone ekstrakt, usnic syre, og lichesterinic syre i forskellige celler præsenteres. Interessant betragtning molekylvægten (MV = 344) og% intensitet usnic syre i acetone ekstrakt af

F. cucullata

, IC

50 værdier af usnic syre i HEK293T, HT29 og A549 celler sandsynligvis højere end beregnet usnic syre koncentration i ekstraktet. Disse resultater tyder på, at uidentificerede delkomponenter af

F. cucullata

udtrække sandsynligvis forstærke cytotoksicitet usnic syre. Men det er værd at bemærke, at IC

50 værdier af usnic syre, især i ikke-kræftceller, såsom MDCK, RIE, NIH 3T3, og HaCaT celler, var meget lavere end for usnic syre koncentration i

F. cucullata

ekstrakt, hvilket antyder, at der kan være en resistent mekanisme, der ligger cytotoksiciteten af ​​usnic syre i celler eller denne anden underkomponent (er) kan mindske cytotoksiciteten af ​​usnic syre til cellerne. Taget sammen tyder disse resultater på, at acetone ekstrakt af

F. cucullata

har selektiv cytotoksicitet til kræftceller og at usnic syre kan virke som en stor effektor af disse virkninger.

Lethal koncentrationer

af Flavocetraria cucullata

usnic syre inducere apoptose af cancerceller

for at afgøre, om cytotoksicitet

F. cucullata

usnic syre skyldtes induktionen af ​​apoptose, celler behandlet med en letal koncentration på

F. cucullata

blev observeret (50 ug /ml) eller usnic syre (100 uM) blev farvet med Hoechst 33258 og deres cellekernemorfologi. Som vist i figur 2A, blev kondenseret cellekernemorfologi set i AGS celler behandlet med enten

F. cucullata

ekstrakt eller usnic syre. I figur 2B er vist kvantificering af celleantal i forskellige cellelinier. Interessant, induktion af cellekernekondensation blev øget markant i behandlede kræftceller, men blev ikke set i den ikke-cancer cellelinje MDCK, tyder på, at

F. cucullata

usnic syre er selektivt cytotoksisk for kræftceller gennem induktion af apoptose.

(A) Hoechst 33258 farvning af AGS (human mavekræft cellelinje) celler behandlet med

F. cucullata

ekstrakt eller dets underkomponenter, usnic syre og lichesterinic syre. Pile viser celler viser kondenseret eller fragmenterede cellekernemorfologi. Repræsentative billeder vises fra tre uafhængige forsøg. (B) Quantificational analyse af kondenseret eller fragmenteret nukleare morfologi i forskellige celler behandlet med

F. cucullata

ekstrakt eller dets underkomponenter. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi), n = 3. ** p 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel sammenlignet med dimethylsulfoxid-behandlede gruppe.

For at bekræfte dette, vi farves cellerne med FITC-Annexin V til påvisning af phosphatidylserin på den ydre plasmamembran, som er karakteristisk finde i celler, der undergår apoptose. Som vist i figur 3A, cancerceller behandlet med enten

F. cucullata

ekstrakt eller usnic syre viste FITC positivitet. At bestemme procentdelen af ​​apoptotiske celler, flow-cytometri af celler farvet med propidiumiodid blev udført. Som vist i figur 3B og 3C, øget populationen af ​​celler i sub G1-fasen efter 24 timers behandling i cancerceller. Denne kvantificering analyse viste, at induktion af apoptose af

F. cucullata

ekstrakt var dosisafhængig undtagen i MDCK-celler, med betydelige stigninger i AGS, HT29, og A549-celler (fig. 3B). Som vist i figur 3C, effektiviteten af ​​usnic syre med at øge antallet af apoptotiske celler var signifikant lavere end den for

F. cucullata

ekstrakt. Disse resultater igen antyder, at uidentificerede underkomponent (r) af

F. cucullata

kan forstærke virkningen af ​​usnic syre selvom usnic syre spiller en vigtig rolle i induktion af apoptose i forskellige cancerceller.

(A) FITC-Annexin V-farvning af celler behandlet med

F. cucullata

ekstrakt eller usnic syre. Pile viser celler viser FITC positivitet. (B-C) Flowcytometrisk analyse af celle-cyklus distributioner efter

F. cucullata

ekstrakt (B) eller usnic acid (C) behandling og grafisk gengivelse af resultaterne. Repræsentative billeder eller resultater er vist fra tre uafhængige forsøg.

For yderligere at bekræfte ændringer i niveauet af apoptotiske proteiner, udførte vi western blot analyse for poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), caspase- 3, Bax og Bcl-xL. Som vist i figur 4A og 4D, ekstrakt og usnic syrebehandling øgede niveauer af spaltet PARP og spaltes caspase-3 i CWR22Rv-1, AGS, HT29, og A549-celler. Desuden er niveauet af pro-apoptotisk protein, Bax, blev signifikant forøget i disse behandlede celler, men ikke i MDCK og HEK293T celler (fig. 4B og 4E). Derimod er niveauet af anti-apoptotisk protein, Bd-XL, var signifikant nedsat kun i behandlede cancerceller (fig. 4C og 4F). Konsekvent,

F. cucullata

var mere effektiv til at inducere apoptose end usnic syre og var mere effektivt i cancerceller end ikke-cancercelle. Taget sammen demonstrerer resultaterne at letale koncentrationer af acetone ekstrakt af

F. cucullata

og underkomponent af usnic syre inducere apoptose af cancerceller.

(A og D) Western blot-analyse af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og caspase-3 i celler behandlet med

F. cucullata

(A) eller usnic acid (D). Pilespidser angiver spaltede fragmenter af hvert protein. (B-C og E-F) Quantificational analyse af Bax (B og E) og Bd-XL (C og F) protein ekspressionsniveauer i celler behandlet med F. cucullata eller usnic syre hhv. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel i forhold til dimethylsulfoxid-behandlede gruppe.

Sub-dødelige koncentrationer af

Flavocetraria cucullata

usnic syre hæmmer tumorgenicitet og motilitet af kræftceller

for yderligere at undersøge anti-cancer aktivitet af

F. cucullata

udtrække og usnic syre, vi brugte en tiendedel af de dødelige koncentrationer af disse forbindelser, som ikke viser cytotoksicitet (sub-dødelig koncentration) og testet den

i

vitro

tumorigenicitet og motilitet af A549 og AGS celler. En klonogene assay af disse celler ved subletale koncentrationer af ekstraktet (5 ug /ml) eller usnic acid (10 uM) viste et signifikant fald i antallet af kolonier, hvilket indikerer, at celleproliferation blev inhiberet ved disse koncentrationer (fig. 5A og 5B). Interessant behandling med 10 ug /ml ekstrakt eller 15 uM usnic syre fuldstændigt inhiberede dannelsen af ​​kolonier i begge celletyper (data ikke vist). Derimod lichesterinic syre viste ingen inhibitorisk virkning på celleproliferation. En blød agar koloni-dannelse assay blev udført for at teste, om subletale koncentrationer af

F. cucullata

usnic syre hæmmede forankringsuafhængig vækst af A549 og AGS celler. Som vist i figur 5C og 5D, kolonidannelse af A549 og AGS-celler på blød agar blev signifikant reduceret ved behandling med

F. cucullata

ekstrakt eller usnic syre i en dosisafhængig måde, mens lichesterinic syre ikke påvirkede forankringsuafhængig vækst. Disse resultater viser, at både

F. cucullata

udtrække og usnic syre har anti-tumorigen aktivitet ved subletale koncentrationer. En sårhelende assay og invasion assay blev yderligere udført for at teste, om

F. cucullata

usnic syre påvirker migration og invasion, henholdsvis af kræftceller ved subletale koncentrationer. I figur 6A-C,

F

.

cucullata

ekstrakt og usnic syrebehandling hæmmede signifikant migration af A549 og AGS celler. Som vist i figur 6D-E, den

F. cucullata

udtrække og usnic syre hæmmede også invasionen af ​​A549 og AGS celler, mens påvistes ingen sådan hæmning af invasion i lichesterinic syre-behandlede cancerceller. Resultaterne viser tydeligt, at

F. cucullata

usnic syre hæmmer kræft celle motilitet og mindske tumorgenicitet af kræftceller ved subletale koncentrationer.

(A-B) Klonogen assay af A549 og AGS celler behandlet med

F. cucullata

ekstrakt, usnic syre eller lichesterinic syre (A) og quantificational analyse af koloni nummer i hver gruppe (B). (C-D) Blød agar koloni-dannelse assay af A549 og AGS celler behandlet med

F. cucullata

ekstrakt, usnic syre eller lichesterinic syre (C) og quantificational analyse af procent koloni område i hver gruppe (D). Repræsentative billeder vises fra tre uafhængige forsøg. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi), n = 3. * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel sammenlignet med dimethylsulfoxid-behandlede gruppe.

(A-C) Migration assay af A549 (A) og AGS (B) celler behandlet med

F. cucullata

ekstrakt eller usnic syre og quantificational analyse af sår længde i hver gruppe (C). (D-E) Invasion assay af A549 og AGS celler behandlet med

F. cucullata

ekstrakt, usnic syre eller lichesterinic syre (D), og quantificational analyse af invaderede celletal i hver gruppe (E). Repræsentative billeder vises fra tre uafhængige forsøg. Data repræsenterer middelværdier ± S.E.M. (Standardfejl på middelværdi), n = 3. ** p 0,01; *** P 0,001; NS, ingen signifikant forskel ved sammenligning med dimethylsulfoxid-behandlede gruppe i hver celle linjer. @@ P 0,01; @@@ P 0,001 sammenlignet med den angivne gruppe

Som

F.. cucullata

usnic syre blev fundet til sænke kræftcellen motilitet og tumorgenicitet, så undersøgte vi, om epitel-mesenkymale overgang (EMT) spiller en rolle i at mediere disse effekter. Udtrykket niveau af E-cadherin blev analyseret i A549 celler behandlet med en sub-dødelige koncentration af

F. cucullata

, usnic syre, eller lichesterinic syre. Dataene viste, at acetone ekstrakt af

F. cucullata

usnic syre signifikant øget protein niveau af E-cadherin (fig. 7A). Konsekvent blev ekspressionen niveauet af E-cadherin-mRNA steg også i disse celler, mens mRNA-niveauer af N-cadherin, Twist, og sneglen blev reduceret i disse celler.