PLoS ONE: Mesenchymale stromacellers primet med Paclitaxel Giv en nye metode for Cancer Therapy

Abstrakt

Baggrund

Mesenkymale stromale celler kan repræsentere en ideel kandidat til at levere anti-cancer medicin. I en tidligere undersøgelse påviste vi, at eksponering af mus knoglemarv afledte stromaceller til doxorubicin førte dem at erhverve antiproliferativ potentiale i retning samdyrket hæmatopoietiske stamceller (HSC’er). Vi dermed hypotese om frisk isolerede human knoglemarv mesenchymstamceller (hMSC’er) og modne murine stromale celler (SR4987 linje) primet

in vitro

med kræftlægemidler og derefter lokaliseret nær kræftceller, kunne hæmme proliferation.

Metoder og vigtigste resultater

Paclitaxel (PTX) blev anvendt til prime kultur af hMSC’er og SR4987. Inkorporering af PTX til hMSC’er blev undersøgt ved anvendelse af FICT-mærket-PTX og analyseret ved FACS og konfokal mikroskopi. Frigivelse af PTX i dyrkningsmedium af PTX primet hMSC’er (hMSCsPTX) blev undersøgt ved HPLC. Dyrkning af endotelceller (EC’er) og aorta ring assay blev anvendt til at teste den antiangiogene aktivitet af hMSCsPTX og PTX primet SR4987 (SR4987PTX), mens anti-tumor-aktivitet blev testet

in vitro

på proliferationen af ​​forskellige tumor celle linjer og in vivo ved co-transplantation hMSCsPTX og SR4987PTX med kræftceller i mus. Trods et tab af celler som følge kemo-induceret apoptose, både hMSC’er og SR4987 var i stand til hurtigt at optage PTX og kunne langsomt frigive PTX i dyrkningsmediet på en tidsafhængig måde. PTX primede celler erhvervet en potent anti-tumor og anti-angiogene aktivitet

in vitro Hoteller, som var dosisafhængig, og påviselige ved hjælp af deres konditioneret medium eller ved co-kultur assay. Endelig hMSCsPTX og SR4987PTX co-injiceret med humane cancerceller (DU145 og U87MG) og musemelanomceller (B16) i immundefekte og i syngene mus betydeligt forsinket tumor tager og reduceret tumorvækst.

Konklusioner

Disse data viser for første gang, at uden nogen genetisk manipulation, kan mesenkymale stromaceller optagelse og efterfølgende frigivelse langsomt PTX. Dette kan føre til potentielle nye værktøjer til at øge effekten af ​​kræftbehandling

Henvisning:. Pessina A, Bonomi A, Coccè V, Invernici G, Navone S, Cavicchini L, et al. (2011) Mesenchymale stromacellers grundet med paclitaxel Giv en nye metode for Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (12): e28321. doi: 10,1371 /journal.pone.0028321

Redaktør: Marc Tjwa, University of Frankfurt – University Hospital Frankfurt, Tyskland

Modtaget: April 15, 2011; Accepteret: 5. november 2011; Udgivet: December 20, 2011

Copyright: © 2011 Pessina et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist støttet af AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) Projekt AIRC IG-9062, National Italian Grant PUR 2008 og Fondazione Banca del Monte di Lombardia. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det vigtigste mål i cancer kemoterapi er at lokalisere det stof effekt i tumoren mikromiljø for at dræbe så mange kræftceller som muligt og samtidig producere den laveste sikkerhedsstillelse toksicitet. For at gøre dette, et betydeligt antal tekniske metoder, fra brugen af ​​giftige immunkonjugater til at målrette tumor specifikke antigener [1] til den sofistikerede brug af nanopartikler [2] eller manipulerede stamceller [3] til levering narkotika, er blevet undersøgt og offentliggjort i de sidste 20 år. Da mesenkymstamceller (MSC’er) nemt at tilpasse til dyrkningsbetingelser er nødvendige for

in vitro

manipulation og hjem til patologiske væv, når injiceres

in vivo

, disse celler synes at repræsentere det bedste valg til at levere anti -tumor agenter [4], [5]. Transgene procedurer er blevet anvendt til at inducere MSC’er til at udskille terapeutiske cytokiner eller vækst og inhiberende faktorer [6], [7]. De seneste data har vist, at manipuleret MSC producerer anti-tumor faktorer, der har kapacitet til at dræbe kræftceller både

in vitro

in vivo

[3], [8] – [12]. Selv om der er lovende resultater på dyr, genmanipulation af MSC i klinisk anvendelse i mennesker har nogle risici [13].

I en tidligere undersøgelse, demonstrerede vi, at museknoglemarvs (BM) afledt stromacelle (SR4987 cellelinie) dyrket i nærvær af doxorubicin (DXR), en potent anti-cancer-forbindelse, var i stand til optagelse betydelige mængder af lægemidlet uden at vise tydelige tegn på toksicitet. I modsætning hertil hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) fra BM var meget følsomme over for DXR. Interessant, observerede vi en signifikant inhibering af HSC’er-induceret kolonidannelse enheder (CFU), hvis co-dyrket med SR4987 først primet med DXR. Vi konkluderede, at murine stromale celler kan virke som et reservoir for DXR at efterfølgende kan frigive nogle DXR metabolitter eller endda DXR i sin oprindelige form, hvilket fører til HSC’er-induceret CFU inhibering [14]. Derfor vi hypotese, at, også

in vivo

, BM stromale celler kan spille en dobbelt rolle i at kontrollere lægemiddeltoksicitet, afhængig af deres evne til at optagelse og frigivelse kemoterapeutiske stoffer [14]. I betragtning af disse egenskaber, vi her undersøge, om humane MSC’er (hMSC’er) frisklavede fra BM og mus SR4987, efter priming med anticancer og anti-angiogene stof paclitaxel (PTX), kan erhverve evnen til at dræbe tumorceller (TCS) i deres nærhed .

Paclitaxel er et stærkt lipofilt lægemiddel (afledt af

Taxus brevifolia

), meget aktiv på mange faste tumorer og også i stand til at inhibere endotelcelleproliferation. Paclitaxel påvirker cytoskelet ved at fremme mikrotubulus-polymerisation, der inducerer mitosestandsning af cellen [15], [16].

Vi viser for første gang, at i en tidsafhængig kinetik, hMSC’er og muse SR4987 primet med PTX (MSCsPTX, SR4987PTX) frigivelse af lægemidlet i en mængde, nok til at påvirke tumor spredning, til at dræbe endotelceller (ECS)

in vitro

og vigtigst, for at reducere tumorvækst

in vivo

. Vores resultater er den første demonstration, der, via en simpel

in vitro

procedure, kan hMSC’er og mus stromale celler fyldt med anti-cancer medicin og brugt

in vivo

at frigive dem i en tumor mikromiljø.

Resultater

Karakterisering af MSC, P-glycoprotein (P-gp) udtryk og følsomhed over for PTX

cellerne anvendt i denne undersøgelse var tre forskellige friske præparater af hMSC’er og muse stromacellelinje SR4987 [17]. Dyrkede hMSC’er blev analyseret for at bekræfte ekspressionen af ​​MSC-markører såvel som deres multipotente differentiering kapacitet. De var positive for CD44 +, CD73 +, CD90 +, CD105 +, og HLA-I og negativt for CD14-, CD31-, CD34-, CD45-, CD80- og HLA-II. Når dyrket under differentiere betingelser, erhvervede de osteo-adipo og chondroblaster markører (fig. S1). Dernæst vurderes følsomheden af ​​hMSC’er og SR4987 til PTX, i en 24 h cytotoksicitet test og i en anti-proliferation assay ved 7 dage (fig. 1A, B). SR4987 og hMSC’er var følsomme over for anti-proliferative aktivitet af PTX, ifølge en dosisafhængig kinetik med et IC

50 værdi på 25,6 ± 11.08 ng /ml og 4,07 ± 1,75 ng /ml. Derimod både SR4987 og hMSC’er var stærkt resistent over for PTX direkte cytotoksicitet, med meget lidt celledød selv ved koncentrationer højere end 10.000 ng /ml (fig. 1A, B). Inhiberingen af ​​hMSC’er og SR4987 proliferation med PTX blev bekræftet ved at udføre cellecyklusanalyse, der viser signifikant akkumulering af celler i S, og i en mindre grad, G2 /M-fasen. Levedygtighed både hMSC’er og SR4987 celler blev ikke påvirket væsentligt og celler fritliggende, vaskes og subkultur i fravær af stoffet gav en celle monolag med en celle levedygtighed i området for kontrol og en cellecyklus mønster gendannet efter 72 timer (fig. S2 ). Disse data er blevet bekræftet af de procentsatser for apoptotiske /nekrotiske celler tælles i de forskellige eksperimentelle betingelser ved Annexin assay (tabel S1). Behandlingen gør producere nogle tab af celler på grund af kemo-induceret apoptose, selv om den eneste betydelige stigning i apoptose (P 0,05) blev påvist i SR4987 celler (ved 24 timers behandling med PTX), der udvundet efter narkotika udskiftning (24 + 24 h). Disse data er i overensstemmelse med de rapporter fra andre forfattere på følsomheden af ​​stromale celler til Paclitaxel [18], [19].

Forskellige koncentrationer af PTX (0,1-10,000 ng /ml) blev sat til kultur af hMSC’er (fig. 1A) og muse SR4987 (fig. 1B). Den cytotoksiske aktivitet blev vurderet ved 24 timer af behandlingen; virkningen på proliferation ved 7 dag i kultur ved en MTT assay. Optisk densitet målt i kulturer af MSC, der ikke modtog PTX blev anset som 100% proliferation. Bemærk, at koncentrationen af ​​PTX op til 10.000 ng /ml påvirkede ikke hverken hMSC’er eller levedygtighed SR4987 celle. De små borde indsætte i A og B angiver IC

50 og IC

90 fremkaldt af PTX på hMSC’er og SR4987 hhv. Både de konditionerede medier (CM) fra PTX primet celler (hMSCsPTX-CM og SR4987PTX-CM) frembragte en dosisafhængig vækstinhibering af MOLT-4 beskrevet (fig. 1C) som procent af det der produceres af CM fra ubehandlede celler (hMSC’er-CM og SR4987-CM). Bemærk, at ved 1:16 fortynding af både hMSCsPTX-CM og SR4987PTX-CM producerede 100% vækstinhibering lig med dem, der opnås med 3,13 ng /ml PTX. Denne biologiske assay blev anvendt til at estimere PEC frigivet ved en enkelt PTX behandlet hMSC og dens akkumulering i dyrkningsmediet i den tid (D). Histogrammet viser PEC udgivet af hMSCPTX på forskellige tidspunkter af kultur. Kurven viser PEC ophobning i hMSCsPTX-CM. Bemærk, at hver hMSCPTX frigiver omkring 1 pg af PEC i 24 timer og nåede en maksimal akkumulering af omkring 1,7 pg efter 144 timer. Værdi er middelværdien ± standardafvigelse (SD) af fem uafhængige forsøg.

Både hMSC’er og SR4987 celler udtrykte P-gp, der blev ned-moduleret ved behandling med PTX og med verapamil (VP). Tilstedeværelsen af ​​VP øget SR4987 følsomhed over for anti-spredning aktivitet PTX, mens det ikke var effektive på hMSC’er (Fig. S3).

PTX-optagelse og frigivelse af hMSC’er

Baseret på tidligere undersøgelser [14], sub-sammenflydende kultur (3 × 10

5) af adhærente hMSC’er blev eksponeret i 24 timer til 2.000 ng /ml PTX (nok til helt at blokere celleproliferation, men ikke i stand til at påvirke cellernes levedygtighed). Efter adskillige vaske og trypsinisering, hMSCsPTX blev yderligere dyrket i 24 timer, og deres konditioneret medium (CM) blev testet på Molt-4, en leukæmicellelinje meget følsomme over for PTX (IC

50 på 1,48 ± 1,06 ng /ml) [ ,,,0],20]. CM fra begge kulturer af hMSCPTX (hMSCsPTX-CM) frembragte en stærk dosisafhængig antiproliferativ virkning på MOLT-4, svarende til dem, der opnås med ren PTX i doser fra 0,39 til 50 ng /ml (Fig. 1C). Derimod CM fra kontrolceller (hMSC’er-CM) var ikke effektive. Sammenligne den inhibitoriske aktivitet af ren PTX og CM på Molt-4, vi beregnet PTX ækvivalent koncentration (PEC) i CM anvendt til at estimere PEC frigives af en enkelt celle (PEC pg /celle). Den samlede PEC internaliseret af hMSCsPTX i 24 timer, vurderet ved at teste hMSCsPTX cellelysater, var 2,67 ± 0,8 pg /celle, hvilket antyder, at hMSC’er i 24 timer kunne inkorporere ca. 8% af PTX oprindelig var til rådighed (33,3 pg /celle). Resultater på lysater af hMSC’er fikseret i formalin før PTX priming indikerede en uspecifik binding af PTX, svarende til 0,11 ± 0,01 af PEC pg /celle (ca. 4% af den samlede PEC stede i lysatet af levende celler).

derefter beregnede vi den tidsafhængige frigørelse af PEC ved hMSCsPTX ved at erstatte og opsamling deres CM på forskellige tidsintervaller. Påviselig aktivitet af PEC var til stede efter 2 h inkubation af hMSCsPTX nå en PEC af 1 pg /celle i de første 24 timer af kultur, og en maksimal koncentration på ca. 1,7-2,0 pg /celle ved 144 h (fig. 1d). Da disse værdier ikke steg med længere inkubation, vi anslået, at omkring 25-30% af den totale PEC findes i cellelysatet blev tilbageholdt af cellerne og aldrig frigivet. Internaliseringen af ​​PTX til hMSC’er blev undersøgt ved konfokal mikroskopi under anvendelse af fluorescerende PTX (PTX-F) (fig. 2A). PTX-F lokalisering i hMSC’er blev analyseret over tid. Efter 1 time af priming, internalisering af PTX-F af hMSC’er var mærkbar. Farvningen var intens og beriget inde vesikler ved udgangen af ​​priming (24 h). Efter 24 timer observerede vi, at fordelingen af ​​PTX-F forblev begrænset til vesikler, hvoraf mange var tæt på cellemembranen, hvilket antyder en mulig sekretion. At vurdere, om PTX-F blev beriget i vesikler afledt af Golgi-apparatet, blev co-lokalisering analyse udført i hMSC’er farvet med den specifikke markør BODIPY® TR ceramid. Som det ses i de hvide pletter i figur 2A maske, observerede vi en høj grad af co-lokalisering mellem PTX-F og BODIPY® TR ceramid, hvilket betyder, at PTX-F blev internaliseret inde Golgi-afledte vesikler. Således PTX-F akkumuleres i vesikler i stedet for at akkumulere i mikrotubuli [15], som mange andre xenobiotika do [21], og dets niveauet falder i hMSC’er efter kinetikken vist ved FACS-analyse (fig. 2A og fig. S4).

internaliseringen af ​​PTX-F blev analyseret ved konfokal mikroskopi (A) med levende hMSC’er primede 1 (1) eller 24 (24) h med PTX-F (grøn) og fyldt med Golgi markør BOPIPY®TR ceramid (rød). Celler blev også observeret 24 timer efter vask trin (24 + 24). PTX-F akkumuleres i celler og co-lokaliserer med Golgi-apparatet eller Golgi-afledte vesikler. Mask panel fremhæver co-lokalisering mellem PTX-F og BODIPY®TR ceramid viser hvide pletter, der indikerer de pixels, hvori både de fluorescerende signaler er påviselige .. Hvide linjer repræsenterer cellegrænsen og pilene angiver vesikler tæt på cellemembranen. Scale bar: 20 pm. Frigivelsen af ​​PTX i hMSCsPTX-CM på 24 timer blev analyseret ved HPLC. Elueringsprofilen (B) blev sammenlignet med den for ren PTX på 1.000 ng /ml (C). Figuren rapporterer et kromatogram profil på en typisk eksperiment, hvor hMSCsPTX-CM godtgør en top, som klart identificeret PTX og der blev kvantificeret på en PTX standardkurve som 68,1 ng /ml. Figur 2D rapporterer profilet af hMSC’er-CM dyrket i fravær af PTX. Toppen mærket som I.S. er den interne standard Cephalomannin tilføjet til alle prøver for korrekt kvantificering af PTX.

Tilstedeværelsen af ​​PTX i hMSCsPTX-CM blev bekræftet ved HPLC-analyse. De HPLC-kromatogrammer opnået fra hMSCsPTX-CM og fra et standard prøve af PTX i PBS (1,000 ng /ml) (fig. 2B, C) viser, at et toppunkt på identisk retentionstid for PTX blev elueret fra hMSCsPTX-CM. HPLC-analyse afslørede tilstedeværelsen af ​​andre ikke-specifikke toppe (2,5-4 minutter) sandsynligvis på grund af forbindelser, produceret af celler og ikke korreleret med tilstedeværelsen af ​​PTX, fordi også til stede i kromatogrammet af kontrolmedium hMSC’er-CM (fig. 2D). Tilstedeværelsen af ​​det vigtigste PTX metabolit, 6 alpha-hydroxy-paclitaxel, normalt eluerede ved 5,5 minutter, og af andre PTX metabolitter kan udelukkes [22].

En lignende PTX priming teknik blev anvendt til musen SR4987 der viste en lignende kinetik for inkorporering og frigivelse af PTX med en højere tendens til lægemiddelfrigivelse i de første 24 timer inkubation (data ikke vist).

HMSCsPTX og SR4987PTX hæmme spredning af forskellige former for TC

in vitro

for at evaluere

in vitro

anti-tumor potentiale hMSCsPTX og mus SR4987PTX, vi så undersøgt effekten af ​​hMSCsPTX-CM på to humane cellelinjer (DU145, T98G ) og SR4987PTX-CM på muse B16 melanom cellelinie. Som vist i fig. 3, tilsætning af hMSCsPTX-CM ved 1:04 til 1:08 fortynding induceret op til 80% af vækstinhibering på alle tumorcellelinier (fig. 3A). På 1:02 fortynding svarende til tilsætning af ca. 25 ng /ml ren PTX blev 100% af tumorvækst inhibering opnået (fig. 3B). Ved at kombinere disse data med dem fra den kinetik frigivelse (fig. 1D), kunne vi anslår, at der i 24 timer, 3 × 10

5 hMSCsPTX kan frigive omkring 50-60 ng /ml PEC, som er koncentrationer 3-5 gange IC

90 værdier af PTX for kræftcellerne undersøgt. Tilsætningen af ​​kontrol hMSC’er-CM påvirkede ikke TC’er proliferation (data ikke vist). Kapaciteten af ​​hMSCsPTX at inhibere forskellige TC’er proliferation blev bekræftet ved co-dyrkning assay, hvori hMSCsPTX og TC’er blev blandet i forskellige forhold (fra 01:01 til 1:100). Tilstedeværelsen af ​​hMSCsPTX inhiberede proliferation af alle testede tumorcellelinier, ifølge deres forholdsmæssige tilstedeværelse (fig. 3C, D, E). Dette tillod os at beregne en arbitrær værdi udtrykt som et forhold mellem hMSCsPTX og TC, der producerede IC

50. IC

50 værdier var 01:47 til MOLT-4, 1:05 for T98G og DU145 og kun 1:2-3 for B16 tumorceller. Tilsætningen af ​​kontrol hMSC’er indvirker ikke væsentligt TC’er proliferation, selv om en lav signifikant vækstinhibering (p 0,02) blev observeret ved 1:01 ratio for alle de testede tumorcellelinier

I (A) er vist. kinetikken af ​​vækstinhibering fremkaldt af seriefortyndinger af hMSCsPTX-CM på T98G, DU145 og SR4987PTX-CM på B16, som blev sammenlignet med aktiviteten af ​​forskellige koncentrationer af PTX på samme TC (B). CM tilsætning producerede en stærk anti-proliferativ virkning på alle testede på en dosisafhængig måde TC’er: 1:16 og 1:4 fortyndinger IC

50 og IC

90 vækstinhibering på alle TC linjer henholdsvis svarende til den PTX-koncentrationer nødvendige for at opnå IC

50 og IC

90 om de forskellige tumorceller som rapporteret i lille tabel insert i (B). Inhibering af TC’er proliferation blev også opnået ved en direkte samdyrkning assay. Primet hMSCsPTX blandet, i forskellige forhold (1:100-1:10-1:1 MSC’er /TCS), med MOLT-4 (C), T98G (D), DU145 (E) viste dosisafhængig kapacitet til at blokere TC’er proliferation evalueret i en MTT-test efter 7 dage udtrykt som procent af OD målt for TC’er dyrket i kontrol medium alene (CTR) eller i nærvær af ikke primede hMSC’er. SR4987PTX opførte sig som hMSCsPTX. Men selv ikke primet SR4987 per se viste nogle antiproliferativ kapacitet på B16 melanom på 01:01 ratio (F). Histogrammerne rapporterer gennemsnittet ± SD af tre eksperimenter med den statistiske signifikans som følger:

* (p 0,05)

,

** (p 0,01) vs

tumorcellevækst (CTRL) .

mus SR4987PTX arbejdede som hMSCsPTX i optagelse og frigivelse af lægemidlet, som testes af MTT assay på CM (fig. 1A). Men i co-kultur assay, SR4987 celler “per se” produceret en hæmning af B16 melanom celler (p 0,05)., Der ikke adskiller sig fra, at der produceres af SR4987PTX (. Figur 3F)

hMSCSPTX og mus SR4987PTX vise potent

in vitro

antiangiogen aktivitet

Fordi PTX betragtes som en inhibitor af angiogenese [16], [23], vi således undersøgt, om hMSCsPTX og SR4987PTX kunne påvirke angiogenese

in vitro

(fig. 4). Den antiangiogene aktivitet af rent PTX blev oprindeligt testet på HUVEC’er og mikrovaskulære EC’er (HMECs) proliferation. PTX i doser på op til 10 ng /ml var yderst cytotoksisk for både HUVEC’er og HMECs. PTX produceret omkring 50% af EC’er væksthæmning (IC

50) på 4,6 ng /ml (Fig. 4A). Virkningen af ​​hMSCsPTX-CM på HUVEC’er og HMECs var yderst cytotoksisk ved 1:2 og 1:4 fortyndinger (fig. 4B, C). Ved 01:08 hæmmede hMSCsPTX-CM både HUVEC’er og HMECs spredning, men mindre end 5 ng /ml ren PTX. Lignende resultater blev opnået ved co-dyrkning assay (fig. 4D, E, F). Ratio 01:01 og 01:05 i hMSCsPTX /EC’er produceret en stærk cytotoksisk virkning på både HUVEC’er og HMECs, mens 1:10, blev der ikke cytotoksicitet men signifikant EC’er væksthæmning observeret (fig. 4D, E). Interessant, på forholdet 1:05, hMSCsPTX indledt dræbe HMECs løbet af de første 24 timer af co-kultur; efter 72 timers inkubation meget få HMECs overlevede (Fig. 4F). Kontrol hMSC’er-CM påvirkede ikke EC’er spredning.

PTX hæmmer EC’er proliferation (A). HUVEC’er og HMECs (2 × 10

5) blev dyrket i 72 h i tilstedeværelse af forskellige koncentrationer af PTX. IC

50 var omkring 4,69 ng /ml PTX og ved 10 ng /ml PTX blokeret både HUVEC’er og HMECs proliferation, som ved højere doser var cytotoksisk betydeligt. Tilsvarende tilsætningen af ​​hMSCsPTX-CM spænder inhibere HUVEC’er (B) og HMECs (C) proliferation. På 1:02 fortynding, hMSCsPTX-CM var cytotoksisk, mens ved højere 1:4 og 1:8 fortyndinger betydeligt hæmme EC’er proliferation. Inhibering af EC’er proliferation blev opnået ved co-kultur-assay. HMSCsPTX co-dyrket ved 01:01 og 01:05 ratio (MSC’er /EC’er) var cytotoksisk for både HUVEC’er (D) og HMECs (E). På 1:10 fortsatte hMSCsPTX at inhibere EC’er proliferation. Ubehandlede kontrol hMSC’er påvirkede ikke EC’er. I (F) fotografier af kulturen i hMSCsPTX blandet 1:05 med HMECs. Celler fikseret og farvet med forskellige tidsintervaller er vist. hMSCsPTX dræbe HMECs så tidligt som 24 timer efter såning. Hvide pile angiver øerne HMECs stadig til stede i kulturen. Bemærk, at efter 72 timer de fleste af de HMECs seedede blev dræbt og kun hMSCsPTX forblive i kultur (20 × forstørrelse). Barer i figurerne er de middelværdier ± SD af tre separate forsøg gennemført in triplo.

* p 0,05

,

** p 0,01 vs

ubehandlede hMSC’er

Den anti-angiogene potentiale hMSCsPTX blev også undersøgt ved hjælp af rotte aorta. ring assay [24]. Som vist i fig. 5A, tilsætning af 1:02 og 1:04 fortynding af hMSCsPTX-CM stærkt reduceret enten spontan eller VEGFa-induceret spiring af neocapillaries fra aortaringe. Fortynding 01:08 af hMSCsPTX-CM, der hæmmer EC’er proliferation påvirkede ikke aorta ring kapillærer dannelse (fig. 5A). HMSCsPTX-CM var også i stand til at inducere kapillær regression hvis hvormed aortaringe efter 7 dages dyrkning. Under mikroskopisk undersøgelse blev flere zoner af fartøjets nekrose observeret (fig. 5B). Tilsætningen af ​​hMSC’er-CM indvirker ikke væsentligt kapillær-dannelse (fig. 5A). Lignende resultater med SR4987PTX opnåedes (fig. S5).

I (A) og (B) rotteaorta ring assay blev anvendt til at teste hMSCsPTX-CM mikrokar vækstinhibering. I (A) hMSCsPTX-CM ved forskellige fortyndinger tilføjet til rotte aorta ringe i nærvær eller i fravær af VEGFa inducerede en stor reduktion i kapillær udvækst i forhold til CTRL medium og hMSC’er-CM. VEGFa 20 ng /ml blev anvendt som positive kontroller (

** p 0,01 vs

hMSC’er-CM). I (B) fotografier viser hMSCsPTX-CM (ved 1:02 fortynding), som inducerede kapillær regression som demonstreret ved tilstedeværelsen af ​​fartøjets brud og nekrotiske områder (pile) (forstørrelser 20 ×). I (C), (D) og (E) virkningerne af hMSCsPTX

in vivo

på tumor tager (C), på DU145 (D) og B16 (E) vækst, er vist. Omkring 0,4 × 10

6 hMSCsPTX og styrer ubehandlede hMSC’er blev blandet (ved forholdet 1:05 hMSC’er /TC /) med 2 × 10

6 DU145 eller B16 og derefter injiceret subkutant (s) i mus. Tumorvolumener blev beregnet ved at måle tumordiametre taget hver anden dag med en kaliber. Den co-injektion af hMSCsPTX med DU145 eller B16, produceret en væsentlig forsinkelse af tumor udseende (C) samt en stor reduktion af DU145 (D) og B16 (E) tumor volumen, mens co-injektion med ubehandlede hMSC’er ikke gjorde påvirke enten DU145 eller B16 volumener, heller ikke gjorde injektion af TC’er blandet 5 minutter før injektion med 2.000 ng /ml af PTX (se tabel 1). Indsatsen i (D) og (E) er billedet af tumorer i kontrol, hMSCsPTX og hMSC’er behandlede mus på tidspunktet for aflivning.

* p 0,05 og ** p. 0,01 vs

TC alene eller

vs

hMSC’er behandlede mus

hMSCsPTX og mus SR4987PTX hæmme tumorvækst

in vivo

In vitro

data viste, at både hMSCsPTX og SR4987PTX var stærkt hæmmende for TC’er og endda cytotoksisk for EC’er. For at se, om de kan påvirke tumorvækst

in vivo

, hMSCsPTX og kontrol hMSC’er blev co-injiceret på forholdet 1:05 med enten human DU145 eller mus B16 melanom kræftceller i immunsvækkede mus. Kontrolgrupper blev også injiceret med TC’er alene eller TC’er blandet, 1-2 minutter før injektion med 2.000 ng /ml fri PTX. I tabel 1 og i figur 5 er resultaterne samlet. HMSCsPTX blandet enten med DU145 eller B16 melanom produceret en betydelig forsinkelse i tumor tager (fig. 5C) og reduceret både DU145 (fig. 5D) og B16 tumorvækst (fig. 5E). Den anti-tumor effekt på DU145 induceret af hMSCsPTX var mere potent end på B16. Imidlertid blev tumorvægte af DU145 og B16 signifikant reduceret med hMSCsPTX behandling; 25% af mus behandlet med DU145 og hMSCsPTX var også tumorfri (tabel 1). Interessant nok co-injektion af DU145 og B16-celler med en høj koncentration af frit PTX forsinkede ikke tumor tager eller påvirker vækst (tabel 1), som tyder på, at tidsafhængig frigivelse af PTX af hMSCsPTX er nødvendig for at påvirke kræftceller proliferation. Dette kan også forekomme

in vivo

.

Lignende resultater blev opnået ved hjælp af musen SR4987 på B16 melanom (tabel 1). SR4987PTX co-injiceret med B16 (ved forholdet 1:05) i C57B16 mus, som er syngene for SR4987 [14], væsentligt forsinket tumor tager og reduceret B16 vækst, selv om co-injektion med kontrol SR4987 “per se” produceret nogle hæmmende aktivitet på B16 vækst (fig. S6).

effekter af mus SR4987PTX på subkutane xenotransplantater af glioblastom U87MG celler

Forsøg med RFP + U87MG glioblastom celler og GFP + SR4987 er designet med henblik på at spore de to celle fraktioner og til at undersøge deres samspil

in vivo

. Kontrol mus, også podede enten med U87MG celler eller med U87MG celler og SR4987, viste, at ekspressionen af ​​RFP og GFP ikke ændrede tumorgenicitet og overlevelse af disse celler i

in vivo

tilstand. Samlet set SR4987PTX celler havde en inhibitorisk virkning på væksten af ​​glioblastom xenotransplantater (fig. S7A-B). Ved 2, 4, og 6-ugers tidspunkter, RFP + U87MG /GFP + SR4987PTX xenografter var betydeligt mindre end de RFP + U87MG xenografter (

s

0,01,

s

0,05 og

s

0,001 henholdsvis; Students

t

-test). På samme tidspunkter, RFP + U87MG /GFP + SR4987-PTX xenografter var betydeligt mindre end RFP + U87MG /GFP + SR4987 xenografter samt (

s

0,02,

s

0,05, og

s

0,001 henholdsvis; Students

t

-test). Fluorescensmikroskopi viste, at i forbindelse med tumoren, GFP + SR4987PTX celler arrangeret sig i tråde og kolonner for at danne net, indesluttede RFP + U87MG celler (Fig. S7c). Omvendt blev GFP + SR4987 der ikke var blevet primet med PTX blandet med U87MG celler uden nogen tilbøjelighed til at organisere sig i sekundære strukturer (fig. S7c). Histologisk undersøgelse afslørede, at xenotransplantaterne indeholder SR4987 celler, uanset deres PTX priming, udviklede ikke foci af nekrose, som typisk ses i U87MG xenotransplantater på det 4 og 6 uger overlevelsestid (fig. S7D). Både størrelsen og histologiske udseende U87MG og U87MG /SR4987 xenografter ikke adskiller sig væsentligt fra de xenografter genereret ved injektion af virus transducerede RFP + U87MG celler og RFP + U87MG /GFP + SR4987, henholdsvis (data ikke vist).

diskussion

musen stromacellelinje SR4987 primet første

in vitro

med DXR og derefter co-dyrket med HSCS resulterer i en stærk hæmning af CFU formationer [14]. Noterer denne egenskab, vi spekulerede på, om hMSC’er og SR4987 primet med en anti-cancer medicin kunne erhverve anti-tumor aktivitet og dermed bruges til kræftbehandling.

For at validere denne hypotese, både mus SR4987 og hMSC’er blev primet med PTX, fordi det vist både stærke anti-tumor [15], [25] og antiangiogene aktiviteter [16], [23]. Når frigivet af primede celler, kunne PTX påvirke både tumor og ECS ​​spredning

Indledende forsøg viste, at PTX var i stand til at hæmme hMSC’er og SR4987 spredning, men var ikke cytotoksisk.; op til 10.000 ng /ml ikke påvirkede cellernes levedygtighed. Denne koncentration PTX var ca. 500 gange højere end nødvendig for at producere en IC

50 på MOLT-4, en human leukæmi cellelinje meget følsomme over for PTX aktivitet [20], som vi brugte til overvågning af hMSCsPTX-CM og SR4987PTX-CM aktivitet. Baseret på en tidligere undersøgelse [14], vi således fastsat en standard-protokol til prime hMSC’er og SR4987 med PTX, bestående af behandling 3 × 10

5 vedhæftende celler med 2.000 ng /ml PTX til 24 timer i kultur. Sammenfattende fandt vi, at: a) hMSC’er var i stand til hurtigt at optage PTX som bekræftet ved hjælp af PTX-F; b) hMSCsPTX kan langsomt frigive PTX, i det mindste delvis, i dyrkningsmediet på en tidsafhængig måde, som bekræftet ved HPLC-analyse; c) formalinfikseret hMSC’er og var ikke effektive til optagelse PTX; d) begge hMSCsPTX og SR4987PTX erhvervet en potent anti-tumor og anti-angiogene aktivitet

in vitro Hoteller, som var dosisafhængig, og påviselige ved hjælp af deres CM eller co-kultur assay; e) hMSCsPTX co-injicerede i immundefekte mus med menneskelige DU145 og SR4987PTX co-injiceret med U87MG eller mus B16 melanom, væsentligt forsinket tumor tager og reduceret tumorvækst. I B16 melanom-model observerede vi, at muse stromale SR4987 celler er i stand “per se” at inhibere tumorcelleproliferation på et niveau svarende til SR4987PTX. Dette resultat synes at være i overensstemmelse med de modstridende data rapporteret fra litteraturen, at foreslå både kapacitet mesenkymale celler og stromale celler til at favorisere eller hæmme tumor progression [26]. Især B16 tumor model repræsenterer en tilstand, hvor murine stromale celler antitumoraktivitet er blevet påvist [27]. I denne tilstand kan det være, at PTX indlæst SR4987 celler øge deres basale antitumor effekt uden en signifikant målbar effekt.

Uafhængigt af dette fund, kan vi konkludere, at vores resultater, tilsammen kraftigt støtte vores indledende hypotese foreslår selv hMSC’er som en bærer for kemoterapeutiske lægemidler hos mennesker. Det er vores opfattelse, vores resultater afslører vigtige nye indsigter i funktionelle egenskaber pattedyr MSC. Fra et toksikologisk synspunkt, vores resultater støtter idéen om, at pattedyr, i det mindste inden for BM stroma rum, indeholder celler, der kan spille en dobbelt rolle i kontrollen lægemiddeltoksicitet. Disse celler kan reducere eller forbedre lægemiddeltoksicitet, afhængig af deres kapacitet “til at adsorbere” og efterfølgende at frigive et lægemiddel selv, som vist her for PTX, i sin oprindelige form. Denne begivenhed

in vivo

mangler at blive afklaret. Data fra cancerpatienter, der får meget høje doser af kemoterapi synes at understøtte denne hypotese [28].