PLoS ONE: Stromal PDGFRβ Expression i Prostata tumorer og godartede Prostata Tissue Forudsiger Prostata Cancer Survival

Abstrakt

Baggrund

identificering af nye prognostiske markører for prostatakræft er stærkt berettiget, da det er vanskeligt at identificere patienter, der kræver helbredende behandling. Data fra både eksperimentelle modeller og kliniske prøver har identificeret vigtige funktioner i PDGFRβ på pericytter og fibroblaster i tumoren stroma.

Metodologi /vigtigste resultater

I denne undersøgelse den prognostiske betydning af PDGFRβ i prostatakræft stroma, og i matchede ikke-malignt væv, blev evalueret med immunhistokemi. PDGFRβ ekspression blev analyseret i normale og tumor stroma fra mere end 300 patienter med prostatacancer. Høj PDGFRβ ekspression i tumorstroma var forbundet med store tumorstørrelse, fremskredent stadium, høj Gleason score og høj kardensitet. Perivaskulær PDGFRβ farvning i tumorer blev også korreleret med høj Gleason score. Korrelationer blev også observeret mellem PDGFRβ status i tumorstroma og ikke-malign stroma. Ligeledes høj PDGFRβ ekspression i tilstødende ikke-malignt væv stroma korreleret med stor tumorstørrelse, fremskredent stadium, høj Gleason score og proliferation i ikke-maligne epitel. Interessant, blev høje niveauer af PDGFRβ i stroma af tumor og ikke-maligne væv forbundet med kortere cancer specifik overlevelse i patienter med prostatacancer.

Konklusioner /Betydning

Undersøgelsen afslørede en række roman associationer mellem stromale PDGFRβ udtryk i prostata tumorer og flere vigtige kliniske karakteristika, herunder overlevelse

Henvisning:. Hägglöf C, Hammarsten P, Josefsson A, Stattin P, Paulsson J, Bergh A, et al. (2010) Stromal PDGFRβ Expression i Prostata tumorer og godartede Prostata Tissue Forudsiger Prostata Cancer Survival. PLoS ONE 5 (5): e10747. doi: 10,1371 /journal.pone.0010747

Redaktør: Per Westermark, Uppsala Universitet, Sverige

Modtaget: Marts 3, 2010; Accepteret: April 30, 2010; Udgivet: May 20, 2010

Copyright: © 2010 Hägglöf et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af ubegrænset tilskud fra en Linna tilskud til STARGET netværk fra det svenske Forskningsråd og tilskud fra svenske Cancer Society og Konung Gustaf vs Jubileumsfond. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tumor adfærd er generelt høj grad styret af karakteristika af tumor stroma. I tilfælde af prostatakræft dette er godt illustreret af en række nyere undersøgelser, der har identificeret stromale karakteristika og markører med prognostisk og respons-prsedikativ betydning.

Tumorer med den mest udtalte ændring i stroma morfologi, kendetegnet ved en større tab af glatte muskelceller og stigninger i fibroblaster, myofibroblaster og kollagenfibre (reaktivt stroma grad 3), har en dårligt resultat sammenlignet med dem med en stroma morfologisk mere ligner den i normalt prostatavæv, dvs. reaktive stroma grad 1 og 2 [1]. Nylige undersøgelser har også vist, at prostatakræft er karakteriseret ved tab af androgenreceptorer (AR) i [2] stroma. En lav frekvens af stromal AR blev koblet til forøget Gleason score, metastase, dårlig respons på kastration terapi og en ugunstig resultat. Endvidere stromale egenskaber, såsom angiogenese, akkumulering af makrofager, lymfocytter og mastceller samt ændringer i den ekstracellulære matrix har været forbundet med variationer i prostata tumor adfærd [3], [4], [5], [6], [7]. Især er det også blevet observeret, at cancer field virkninger og /eller adaptive ændringer kan ændre stroma og kirtelepitel i det omgivende ikke-malignt væv i en prognostisk signifikant måde [2], [8], [9], [10] .

PDGF α- og β-tyrosinkinasereceptorer udøver vigtige styrefunktioner i mesenchymale celler, såsom pericytter, fibroblaster og vaskulære glatte muskelceller under udvikling [11], [12]. Eksperimentelle studier har identificeret forskellige funktionelle effekter af stromale PDGF receptor signalering i forskellige tumor-modeller. Det er blevet påvist, at parakrin aktivering af PDGF-receptorer på fibroblaster virker som en potent signal for tumor stroma rekruttering [13], [14], [15]. Andre undersøgelser har vist, terapeutiske fordele ved at målrette stromale PDGF receptorer involverer enten direkte anti-tumorale effekter samt gavnlige virkninger på tumor narkotika optagelse [16], [17], [18], [19], [20]. Klinisk betydningen af ​​resultaterne fra forsøgsmodeller er angivet med talrige undersøgelser påviser stromale PDGF receptor udtryk i forskellige humane solide tumorer [13]. Senest disse undersøgelser er blevet suppleret med analyser afslører, at høj stromale PDGF receptor udtryk er en markør for en ugunstig resultat i brystkræftpatienter [21].

De biologiske effekter af PDGF receptorer i tumor fibroblaster og pericytter sammen med fremkomsten af ​​lægemidler med PDGF-receptor-inhiberende aktivitet, såsom imatinib, sorafenib og sunitinib, motiverer således en systemisk karakterisering af ekspressionsmønsteret for PDGF-receptorer i humane faste tumorer. Til dette formål, denne undersøgelse beskriver ekspressionen af ​​PDGFRβ i ca. 300 tilfælde af prostatakræft og matchet omgivende ikke-maligne prostata væv, og også rapporter om sammenhængen mellem PDGFRβ udtryk og molekylære, histopatologiske og kliniske karakteristika.

Resultater

Variabel PDGFRβ udtryk i normal og tumor prostata væv

for at vurdere betydningen af ​​PDGFRβ i prostatakræft, en TMA indeholdende matchet ikke-maligne og tumorvæv fra 377 patienter med prostatacancer med op til 25 års opfølgning blev analyseret ved PDGFRβ immunhistokemi.

efter aftale med tidligere undersøgelser, blev PDGFRβ udtryk overvejende fundet i fibromuskulær stroma og perivaskulære celler (figur 1 og tabel 1). I den ikke-maligne prostata 27% og 18% blev bedømt som havende positiv PDGFRβ ekspression i fibromuskulær stroma og perivaskulære celler. Perivaskulær og stroma-farvning blev ikke korreleret. I tumoren områder 34% var positive i fibroblastlignende stroma og 17% i de perivaskulære celler. Farvning i tumor stroma og omkring tumor blodkar blev korrelerede (Rs = 0,59). Betydelige forbindelser observeredes også mellem PDGFRβ status i maligne og ikke-maligne stroma (tabel 1). Salg

Sektioner farves for PDGFRβ fra ikke-maligne (A, B og C) og tumor (D, E og F) væv fra patienter med prostatacancer. A og D viser negativ farvning, B og E viser moderat stromale farvning mens C og F udgør en stærk stromale farvning. Scale bar = 200 uM.

I nogle tilfælde PDGFRβ udtryk også varieres inden prostata væv af den samme patient (figur S1).

Stromal PDGFRβ udtryk opstår overvejende αSMA-positive celler

for yderligere at karakterisere det stromale PDGFRβ udtryk, en dobbelt farvning blev udført med antistoffer mod αSMA og PDGFRβ.

Disse analyser bekræftede, at størstedelen af ​​PDGFRβ udtryk i ikke-malign fibromusclar og fibroblast-lignende tumor stroma skete i αSMA-positive celler (figur 2). Desuden Analyserne viste også tilstedeværelsen af ​​αSMA-positive celler i stroma af tumor og ikke-maligne væv, der ikke udviste nogen stromale PDGFRβ udtryk.

Dobbelt farvninger af prostata væv med PDGFRβ (grøn) og αSMA (rød) i ikke-malignt væv (A og B) og tumorvæv (C og D). Scale bar = 100 uM.

Disse resultater bekræfter således eksistensen af ​​delmængder af stromale αSMA-positive celler, som adskiller med hensyn til PDGFRβ udtryk.

Stromal og perivaskulær PDGFRβ farvning i prostata tumorer er korreleret med prognostiske markører

Analyser blev udført for at undersøge mulige sammenhænge mellem PDGFRβ udtryk i tumorer og kliniske parametre eller histologiske karakteristika af tumorer.

Tilstedeværelse af PDGFRβ farvning i fibroblast- lignende tumor stroma var signifikant positivt korreleret med stor tumorstørrelse, fremskredent stadium, høj Gleason score og høj kardensitet (tabel 1). Hos patienter med en Gleason score 4-6 eller Gleason score 7 tumor, kun omkring 20% ​​af tumorerne viste stroma PDGFRβ farvning, men det var betydeligt mere almindelig i tilfælde med Gleason score 8-10 tumorer (figur 3 A).

PDGFRβ farvning i tumor stroma var mere almindelig i tilfælde med Gleason score 8-10 tumorer i forhold til patienter med en Gleason score 4-6 eller Gleason score 7 (a). Tilstedeværelse af PDGFRβ immunfarvning var mere almindelig i den normale prostata væv stroma, når en Gleason score 8-10 tumor var til stede i prostata forhold til, hvis tumoren havde Gleason score 4-6 (B).

perivaskulær PDGFRβ udtryk i tumoren området blev også positivt korreleret med fremskredent stadium, tumor fartøj tæthed og høj Gleason score (data ikke vist).

Sammen disse resultater viser tidligere un-anerkendte associationer mellem stromale og perivaskulær PDGFRβ udtryk i prostatatumorer og egenskaber i tilknytning til en mere aggressiv cancer fænotype.

Stromal PDGFRβ farvning i den tilstødende ikke-malignt væv er korreleret med prognostiske markører Salg

PDGFRβ ekspression i tilstødende ikke-malignt væv blev også analyseret med hensyn til sammenslutninger med tumor egenskaber (tabel 1).

High PDGFRβ i ikke-maligne, blev fibromuskulær stroma korreleret med stor tumorstørrelse, fremskredent stadium, epitelcelleproliferation og høj Gleason score (tabel 1). Det var betydeligt mere almindeligt at finde PDGFRβ ekspression i normale prostatavæv stroma når en Gleason score 8-10 tumor var til stede andre steder i organet forhold til, hvis tumoren var Gleason score 4-6 (Figur 3 B).

Perivaskulær PDGFRβ ekspression i det omgivende ikke-malignt væv blev også positivt korreleret med epitelcelleproliferation (data ikke vist).

Disse analyser således foreslå hidtil ukendte relationer mellem prostatakræft egenskaber og fænotypen af ​​stroma af ikke-malign prostata væv støder op til prostatatumorer.

Stromal PDGFRβ ekspression i tumorer og i den ikke-malign prostata væv omkring tumorer forudser cancer specifik overlevelse

resultaterne fra analyserne af PDGFRβ ekspression var endelig kombineret med overlevelsesdata for at undersøge mulig prognostisk betydning.

cut-offs for tumor stromale PDGFRβ og ikke-maligne stromale PDGFRβ i analyserne var indstillet til den tredje kvartil, svarende til 1,0 og 0,5 for tumor og ikke -malignant stromale PDGFRβ farvning, dvs. høj PDGFRβ immunoreaktivitet var ≥1.0 for tumor og ≥0.5 for ikke-maligne stroma.

Kaplan-Meier analyse viste, at de vagtsomme venter patienter med den højeste kvartil af PDGFRβ udtryk i tumor stroma havde en signifikant kortere kræft specifik overlevelse i forhold til resten (15-års sandsynlighed for hændelse overlevelse (P-EFS) var 67 ± 5% og 34 ± 9% i de to grupper) (Figur 4 a).

Patienter opdeles i to grupper afhængigt af stromal ekspression af PDGFRβ i tumor (A) og ikke-malign prostata væv omkring tumorer (B). Solid line, høj PDGFRβ i tumor stroma (≥1.0); stiplet linie, lav PDGFRβ i tumor stroma ( 1,0; A). Solid linje, høj PDGFRβ i ikke-maligne stroma (≥0.5); stiplet linje, lav PDGFRβ i ikke-maligne stroma ( 0,5; B).

Interessant nok blev høj ekspression af PDGFRβ i stroma af tilstødende normal prostata væv også forbundet med en betydeligt reduceret overlevelse i patienter, der forvaltes af vågent venter (15-års P-EFS blev 68 ± 5% og 41 ± 9% i de to grupper) (Figur 4 B).

High tumor og ikke-malign stroma PDGFRβ immunfarvning var forbundet med en øget relativ risiko for prostatakræft-specifik død i en univariate Cox regressionsanalyse (tabel 2). I multivariat Cox regressionsanalyse herunder den kendte prognostiske markør GS og lokal tumor stadie, høj stromale PDGFRβ i tumor og ikke-maligne væv var ikke en uafhængig prognostisk markør (data ikke vist).

Diskussion

den nuværende analyser afdækket en række nye associationer mellem tumor stroma PDGFRβ status og histopatologiske karakteristika, herunder positive korrelationer med Gleason score, tumor scenen og tumorstørrelse (tabel 1). Disse resultater er minder om den nyligt beskrevne situation i brystkræft, hvor stromale PDGFRβ udtryk var positivt korreleret med høj kvalitet [21]. Disse resultater rejser spørgsmålet om den underliggende mekanisme (r). Som nu er det ikke muligt at konkludere, om foreningerne er forårsaget af en epitelial-induceret stromale fænotype eller af en stroma-induceret epitelial fænotype.

Analyserne af denne undersøgelse viste også signifikante associationer mellem kliniske karakteristika, herunder overlevelse, og det stromale PDGFRβ ekspression i ikke-malign foreliggende væv (tabel 1). Denne observation af prognostisk signifikante egenskaber af det ikke-malignt væv øger en række lignende observationer, som tilsammen har ført til forslag om udtrykket “tumor indikerende ikke-malignt væv” (nuance), hvilket indebærer, at analyser af ikke-malign prostata væv kan udbytte prognostisk information [2], [10]. Andre nylige undersøgelser har præsenteret lignende fund følgende analyser af f.eks Pakt, pEGFR og AR [2], [10], [22]. Fra et praktisk synspunkt er det vigtigt, da mange diagnostiske biopsier kun prøve ikke-maligne væv.

Den underliggende biologi af variationerne i stromale PDGFRβ udtryk bør være bedre afklaret. Fra den foreliggende analyser er det uklart, om ændringer i ikke-malignt væv er sekundære til tilstedeværelsen af ​​nær-ved malignt væv som foreslået i dyremodeller [8], eller hvis det snarere afspejler et tumor-tolerant miljø, som kausalt bidrager til dannelse af flere maligne tumorer.

analyserne herunder dobbelt farvning med αSMA og PDGFRβ antistoffer viste, at PDGFRβ ekspression forekom i αSMA -positive celler (figur 2). Det blev dog også bemærket, at disse celler, i tumorer scoret som havende en PDGFRβ-positiv stroma, forekom sammen med αSMA -positiv /PDGFRβ-negative celler. Disse fund således klart eksemplificerer den molekylære heterogenitet blandt cellerne i ikke-maligne fibromusclar stroma og fibroblast-lignende tumor stroma. Lignende resultater er blevet foretaget i eksperimentelle tumorer [23]. Som også foreslået af andre [24], bør resultaterne stimulere til en forbedret klassificering af disse delmængder og fortsatte analyser af deres funktionelle betydning.

De associationer mellem høj stromale PDGFRβ udtryk og kortere overlevelse viser, at denne receptor er kausalt knyttet til det kliniske forløb af sygdommen og dermed også antyder målretning af PDGF-receptorer til terapeutiske formål. Nogle mindre undersøgelser er blevet rapporteret, hvor imatinib er blevet anvendt i prostatacancer uden nogen tydelige effekter [25], [26]. Resultaterne fra denne undersøgelse, der viser store variationer i stromale PDGFRβ udtryk, tyder på, at fremtidige studier, der evaluerer denne fremgangsmåde vil kræve strengere procedurer for patientens valg. I denne sammenhæng kan det også bemærkes, at epiteliale PDGFRβ ekspression blev kun sjældent påvises i denne undersøgelse (data ikke vist). Endvidere blev der ikke observeret associationer mellem dette udtryk og kliniske eller histopatologiske karakteristika.

En række emner for fremtidige undersøgelser er foreslået af de nuværende resultater. Eksperimentelle undersøgelser med co-kulturer af epitel og stromaceller bør bidrage til at klarlægge, om stroma-epitel foreninger har deres fremherskende mekanistiske grundlag i det stromale eller epitelial rum. Et andet interessant emne for fremtidige undersøgelser vil være at undersøge, hvorvidt det stromale og epiteliale fænotyper er knyttet til individuelle risikoen for prostatacancer gener. Endelig fortsatte analyser skal forstå, hvis de tumorassocierede variationer i ikke-malignt væv er en årsag eller en konsekvens af tumordannelse. kan være påkrævet for at afklare dette spørgsmål Omhyggelig væv analyser i prospektive studier.

Materialer og metoder

Patienter og væv microarray

Vævsprøver blev indsamlet fra patienter, som gennemgik transuretral prostata (TURP) på hospitalet i Västerås, Sverige, mellem 1975 og 1991. Histologisk analyse viste tilstedeværelse af prostatakræft. Median alder ved TURP var 74 år (spændvidde 51-95 år). Oplysninger om fraværet eller tilstedeværelsen af ​​benign prostata hyperplasi var ikke tilgængelig. Vævsprøver blev formalinfikseret og paraffinindlejret efterfulgt af nedklassificeringen ifølge Gleason systemet. Prøverne blev anvendt til at konstruere et væv micro array (TMA) under anvendelse af en Beecher Instrument (Sun Prairie, WI, USA). TMA: s indeholdt 5-8 prøver af tumorvæv repræsenterer både den primære og sekundære Gleason kvalitet og 4 prøver af ikke-malignt væv fra hver patient. Patienterne havde ikke modtaget nogen anti-cancer terapi før TURP. Radionuclid knoglescanning blev udført kort tid efter diagnosen til påvisning af metastaser. Der var 377 patienter inkluderet i studiet, hvoraf 293 patienter blev fulgt med vågent venter efter TURP. Ved symptomer fra metastaser patienter fik palliativ behandling med androgen ablation og i et par tilfælde strålebehandling eller østrogenbehandling, ifølge terapi traditioner i Sverige i løbet af denne tid. Også, blev 84 patienter, der var behandlet med palliativ behandling umiddelbart efter diagnose analyseret. Den mediane samlede overlevelse for patientgruppen fulgte med vagtsomme venter blev 5,6 år. Halvfems-to af TURP prøver blev gradueret som Gleason score (GS) 4-5, 107 patienter som GS 6, 63 patienter havde GS 7, og 115 patienter GS 8-10. 3 patienter (4,1%) med GS 6, 4 patienter (8,2%) med GS 7 og 33 patienter (33,7%) med GS 8-10 havde knoglemetastaser ved diagnose. I august 2003 36 patienter (9,5%) var stadig i live, 131 patienter (34,7%) var døde af prostatakræft og 210 patienter (55,7%) var døde af andre årsager. Materialet blev indsamlet efter svenske regler på et tidspunkt, hvor informeret samtykke ikke var påkrævet. Forskningen etiske komité på Umeå Universitetshospital (Regional Etisk Review Board i Umeå), godkendt af undersøgelsen og frafaldes behovet for samtykke.

I dette materiale har vi allerede analyseret faktorer af potentiel prognostisk betydning såsom Gleason score, tumor volumen, tumor stadie, tumorcelleproliferation og vaskulær tæthed og de opnåede data blev nu forbundet med de nuværende PDGFRβ resultater [2], [27].

PDGFRβ immunhistokemi

PDGFRβ immunohistokemi blev udført som beskrevet i Nupponen

et al

2008 [28]. Anti PDGFRβ (kanin monoklonale, # 3169, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) blev anvendt i en koncentration på 2 pg /ml. Den farvningsintensitet blev scoret separat i stroma og omkring skibe som negativ (0), svagt (1), moderat (2) eller stærk (3). Den PDGFRβ farvning score er de medianværdier på fem til otte scorede prøver af tumorvæv eller fire scorede prøver af nonmalignant væv. For korrelationsanalyse prøverne blev scoret som positive for PDGFRβ hvis farvning blev påvist i det mindste en af ​​TMA kerner.

Immunofluorescens

Immunofluorescerende farvninger af TMA’erne blev udført som ovenfor (i immunhistokemi sektion), indtil inkubering med anti PDGFRβ antistof. Snit blev derefter vasket i PBS med 0,1% Tween-20 (PBT) 3 × 5 min. Dette blev efterfulgt af en 1 h inkubation med det andet primære antistof, monoklonalt muse αSMA (M0851, klon 1A4, Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) fortyndet 1:100 i 20% gedeserum i PBT. Efter vask i PBT i 3 × 5 minutter blev objektglas inkuberet med biotinyleret gede-anti-muse-antistof (E0432, Dako Cytomations 1:500) i 45 minutter ved stuetemperatur. Dette blev efterfulgt af yderligere 3 × 5 min vask i PBT. Objektglassene blev derefter inkuberet med Alexa-Flour 488 gede-anti-kanin sekundært antistof (A11008, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) fortyndet 1:100 i PBT i 45 minutter ved stuetemperatur. Efter vask; objektglassene blev inkuberet i 45 minutter med Cy3-Streptavidin-konjugat (Sigma-Aldrich) fortyndet 1:500 i PBT i 45 minutter ved stuetemperatur. Efter vask blev objektglassene tørret og monteret med Vectashield mounting medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

Statistik

bivariate korrelationer blev beregnet med Pearsons korrelation test. Korrelationer mellem kategoriske variable og kontinuerlige variabler blev analyseret under anvendelse af Spearman rang korrelation test. Der blev indsamlet data på tidspunktet for prostatakræft diagnose.

Patienter inkluderet i overlevelse analyser med Kaplan-Meier og Cox regression blev fulgt med vagtsomme venter. Varigheden af ​​begivenhed overlevelse (EFS) er defineret som tiden fra TURP indtil datoen for prostatakræft død, død anden årsag, eller indtil datoen for sidste opfølgning. Begivenhed i overlevelse analyse blev defineret som prostatakræft død, hvilket viser kræftspecifikke overlevelse. Forskelle i resultat blev testet med log-rank test. Den prognostiske betydning af PDGFRβ immunreaktivitet blev evalueret med Cox regressionsanalyse alene og kombineret med GS og lokal tumor stadie. Sandsynlighed for begivenheden overlevelse (P-EFS) præsenteres ± standardafvigelse (SE). Niveauet af statistisk signifikans blev defineret som

P

0,05 (to-sidet). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 17.0.0 software til OS X (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Støtte oplysninger

figur S1.

PDGFRβ ekspression lejlighedsvis varierer inden for prostata væv fra den samme patient. Heterogene PDGFRβ farvningsmønstre blev observeret i mange tumorer. A og B viser forskellige dele af samme prostatacancer. Scale bar = 200 uM

doi:. 10,1371 /journal.pone.0010747.s001

(7.24 MB EPS)

Tak

Medlemmer af laboratorium A.O. er anerkendt til produktive og støttende kommentarer gennem hele projektet.