PLoS ONE: A Novel Krav om Janus kinaser som mediatorer af Drug Resistance induceret af fibroblast vækstfaktor-2 i Human Cancer Cells

Abstrakt

Udviklingen af ​​resistens over for kemoterapi er en væsentlig årsag til kræft dødsfald . Belyse de mekanismer af lægemiddel resistens bør således føre til nye terapeutiske strategier. Fibroblastvækstfaktor (FGF) -2 signalering inducerer samling af et multi-protein-kompleks, der giver tumorceller med den molekylære maskineri nødvendig for medikamentresistens. Dette kompleks, som involverer proteinkinase C (PKC) ε, v-raf musesarcoma viral onkogen homolog B1 (B-RAF) og p70 S6 kinase β (S6K2), forbedrer den selektive oversættelse af anti-apoptotiske proteiner, såsom B-celle leukæmi /lymfom-2 (BCL-2) og inhibitorer af apoptose protein (IAP) familiemedlemmer og disse er i stand til at beskytte flere cancer celletyper fra kemoterapi-induceret celledød. Janus kinaser (Jaks) er mest kendt for deres kritiske roller i mediere cytokin signalering og immunreaktioner. Her viser vi, at Jaks har nye funktioner, der understøtter deres betragtning som nye mål i terapier til formål at reducere resistens. Som et eksempel viser vi, at Janus kinase Tyk2 phosphoryleres nedstrøms for FGF-2 signalering og er nødvendige til fuldstændig phosphorylering af ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) 1/2. Desuden Tyk2 er nødvendig for induktionen af ​​centrale anti-apoptotiske proteiner, såsom Bcl-2 og myeloid-celle-leukæmi-sekvens (MCL) 1, og for fremme af celleoverlevelse ved FGF-2. Silencing JAK1, JAK2 eller Tyk2 anvendelse af RNA interferens (RNAi) inhiberer FGF2-medieret proliferation og resulterer i sensibilisering af tumorceller over for kemoterapi-induceret drab. Disse effekter er uafhængige af aktivering af signal transducer og aktivator af transkription (STAT) 1, STAT3 og STAT5A /B, de normale mål for JAK signalering. I stedet Tyk2 forbinder med de andre kinaser tidligere impliceret i FGF-2-medieret lægemiddelresistens. I lyset af disse resultater hypotese vi, at Tyk2 og andre Jaks er vigtige modulatorer af FGF-2-drevne celle overlevelse og at hæmmere af disse kinaser sandsynligvis vil forbedre effektiviteten af ​​andre kræftbehandlinger

Henvisning:. Carmo CR, Lyons-Lewis J, Seckl MJ, Costa-Pereira AP (2011) A Novel Krav om Janus kinaser som mediatorer af Drug Resistance induceret af fibroblast vækstfaktor-2 i humane cancerceller. PLoS ONE 6 (5): e19861. doi: 10,1371 /journal.pone.0019861

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: 8. februar 2011; Accepteret: April 5, 2011; Udgivet: May 20, 2011

Copyright: © 2011 Carmo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Kræftbehandling og Research Trust finansieret dette arbejde. MJS og JLL understøttes også af en Department of Health finansierede Eksperimentel Cancer Medicine Center Grant, og APC-P og MJS af Cancer Research UK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udviklingen af ​​resistens ved tumorceller er ansvarlig for den fattige samlet overlevelse set med de fleste kræftformer [1]. Blandt de mange lægemiddelresistensmekanismer ligger fibroblastvækstfaktor (FGF) -2 signalering. FGF-2 kan tilvejebringe celler med pro-overlevelse og mitogene signaler, og giver bredspektret resistens over for kemoterapeutiske lægemidler [2], [3], [4]. De-reguleret FGF-2 signalering er blevet associeret med en række forskellige maligniteter og forhøjede niveauer af dette molekyle i patientens serum blev etableret som en selvstændig dårlig prognostisk faktor for lymfom, lungecancer og sarkom patienter [5], [6], [7 ]. Især blev FGF-2 vist sig at fremme lægemiddelresistens af småcellet lungecancer (SCLC) celler gennem dannelsen af ​​et multi-protein kompleks, der omfatter protein kinase C (PKC) ε, v-raf musesarcoma viral onkogen homolog B1 (B -RAF) og p70 S6 kinase β (S6K2). Det afhang af ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) 1/2 aktivitet [3], [8], [9]. Dannelsen af ​​dette kompleks førte til translationel opregulering af centrale anti-apoptotiske proteiner, som derefter tillagt resistens over for apoptose og tilladte celler til at overleve ved udsættelse for cytotoksiske lægemidler.

De fleste cytokiner og mange vækstfaktorer signal

via

Janus kinaser (Jaks) og signal transducere og aktivatorer af transkription (stats) [10], [11]. Konstitutiv STAT phosphorylering er karakteristisk for en lang række humane cancercellelinier og primære tumorer [12]. Overaktivering af Jaks har også været impliceret i tumorigenese [13]. Det faktum, at Jaks og statistikker aktiveres af flere mitogener har tilskyndet forskere til at udvikle strategier til at målrette dem i kræftbehandling. Der er begrænset, lidt forvirrende, beviser for JAK /STAT signalering nedstrøms for FGF-2 og dens relevans er uklar [14], [15], [16]. Vi og andre [17] har observeret de-reguleret JAK /STAT ekspression i en række forskellige lungecarcinom og sarkom cellelinier. Dette og det faktum, at patienter med forhøjet FGF-2 i serummet har dårligere resultater i klinikken førte os til hypotesen, at Jaks og /eller STAT’er spillet en rolle i FGF-2 signalering medieret lægemiddelresistens pathway (s). Her viser vi, at Janus kinaser JAK1, JAK2 og Tyk2, men ikke deres primære nedstrømseffektorer STAT1, STAT3 eller STAT5A /B, er nødvendige for FGF-2-medieret chemoprotection i U2OS osteosarcomaceller. Dette vil igen, åbner nye terapeutiske muligheder for kræft, der stadig er vanskeligt at kontrollere.

Resultater

FGF-2 beskytter osteosarkom U2OS celler fra cisplatin-medieret celledød via en mekanisme, der involverer PKCε , B-RAF og S6K2 proteinkomplekser

Siden FGF-2 blev vist sig at beskytte SCLC celler fra cytotoksisk lægemiddel-induceret celledød [4], vi oprindeligt søgt at udvide denne observation til de forskellige kræftcelle typen osteosarkom U2OS celler. Disse blev behandlet med det klinisk relevante lægemiddel cisplatin i nærvær og fravær af FGF-2 (fig. 1). Koncentrationen af ​​vækstfaktor anvendte blev bestemt under anvendelse ERK1 /2 phosphorylering som en udlæsning (fig. S1). Celledød blev vurderet ved anvendelse af WST-1 celleviabilitetstest, hvilket gav identiske resultater til de, der opnås ved celletælling med trypanblåt (data ikke vist). Behandling natten over med 60 pM cisplatin dræbte 50% af cellerne, men før inkubering med FGF-2 til 4 timer forhindret dette, hvilket antyder, at FGF-2 beskyttede U2OS celler mod cisplatin (fig. 1a). Den WST-1 analysen ikke diskriminerer mellem apoptose og nekrose. Desuden kunne redning fra cisplatin tilskrives proliferation, hvilket også blev induceret ved FGF-2, snarere end rent til inhibering af celledød. Monitorerede vi derfor parallelt induktionen af ​​apoptose ved hjælp af spaltning af caspase substrater, såsom poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og lamin B som udlæsninger (fig. 1B og data ikke vist). Desuden blev cellecyklusanalyse ved flowcytometri anvendes til at kvantificere tabet af DNA-indhold, der kan anvendes som en anden udlæsning for apoptose (fig. 1C). Overnight behandling med cisplatin-induceret apoptose i U2OS celler, der viste sig ved fremkomsten af ​​en kDa PARP-spaltning fragment 85 (fig. 1 B) og en stigning af underområdet G1 cellepopulation (fig. 1C). Disse hændelser blev forhindret ved at forbehandle celler med FGF-2, som også reduceret basal celledød detekteret i ubehandlede prøver. Graferne repræsenterer gennemsnitsværdierne opnået i tre uafhængige forsøg. Som observeret for SCLC celler [8], kunne reduktion af celledød ved FGF-2 forhindres ved inhibering af mitogenaktiveret proteinkinase kinase (MEK) /ERK-aktivitet med en selektiv inhibitor (fig. S2), mens inhibering af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) og for rapamycin kompleks (TORC) 1-signalering ikke havde nogen indvirkning (data ikke vist). Således FGF-2 udøver en anti-apoptotisk virkning i U2OS celler, som blev medieret af ERK1 /2 og forhindrede de cytotoksiske virkninger af cisplatin. Vigtigere, ved seponering, FGF-2-reddet celler forblev levedygtige i kultur i flere uger (data ikke vist). Dette understøtter yderligere den opfattelse, at FGF-2 effektivt kan fremme overlevelsen af ​​cancerceller udsat for cytotoksiske lægemidler. Salg

Celler blev inkuberet i serumfrit medium natten over. Efter 4 timer før behandling med FGF-2 (10 ng /ml) blev celler behandlet med cisplatin (60 uM) natten over. A. Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af WST-1 assay. Værdier svarer til tetrazoliumsalt WST-1 spaltes til farvede formazan forbindelser ved mitokondrielle dehydrogenaser. Middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg udført tredobbelt præsenteres som gange induktion i forhold til ubehandlede kontroller. B. Proteiner blev separeret på en 7,5% SDS-PAGE-gel og western blotting-analyse udført på totale cellelysater (levende og døde celler) under anvendelse af antistoffer mod PARP. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Et repræsentativt Western blot og middelværdi ± SEM af densitometriske værdier (spaltet PARP) fra tre uafhængige eksperimenter er vist. C. Celler blev permeabiliseret og DNA’et farvet med propidiumiodid (PI). Cellecyklus-profiler blev vurderet ved flowcytometri, og data udvundet ved hjælp FlowJo. Middelværdi ± SEM af sub-G1 begivenheder fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som fold-change af sub-G1 populationer over ubehandlede kontrol.

I SCLC celler, FGF-2-medieret lægemiddel-resistens pathways involverer dannelsen af ​​et proteinkompleks involverer PKCε, B-RAF og S6K2 [4]. Vi næste spurgt, om FGF-2 kunne fremkalde lignende protein interaktioner i U2OS celler. Celler inkuberet i nærvær eller fravær af FGF-2 for de angivne tidspunkter blev lyseret og immunpræcipiteret S6K2 før western blotting for PKCε, B-RAF eller S6K2 (fig. 2A). B-RAF og PKCε forbundet med S6K2 i hvilende celler, en virkning, som var signifikant forhøjet ved FGF-2-behandling i 10 minutter (fig. 2A). Samspillet var forbigående og ikke længere signifikant med 30 minutter efter FGF-2 behandling. For at underbygge den opfattelse, at de tre proteiner interageret, vi næste immunpræcipiteret enten PKCε (fig. 2B) eller B-RAF (fig. 2C) fra cellelysater. Vi udførte derefter Western-blotting til at probe for disse proteiner og S6K2. Mens B-RAF og PKCε basal interaktion steg 10 min efter FGF-2 stimulering og efterfølgende fastholdt, vi var ude af stand til at opdage S6K2 i disse immunpræcipitater (fig. 2B, 2C og data ikke vist). Dette kan forklares ved lavere ekspressionsniveauer af S6K2 forhold til PKCε og B-RAF i U2OS celler, variation i støkiometri af foreninger eller dannelse af flere, forskellige, protein-komplekser. de data antyder Samlet, at FGF-2 fremmer molekylære interaktioner mellem PKCε, B-RAF og S6K2. Parallelt med alle immunopræcipitationer blev niveauer af de tre proteiner også analyseret i helcelleekstrakter (Fig. S3). Interessant nok blev en lille (1.5 til 1.7,-fold), men meget reproducerbar og statistisk signifikant stigning i S6K2 detekteret 10 min efter tilsætning af FGF-2, mens niveauer af PKCε, B-RAF, ERK1 /2 og β-actin (sidstnævnte to bruges som lastning kontroller) var upåvirket (fig. S3 og også S5). Om stigningen i S6K2 signal skyldes udelukkende en stigning i phosphorylering eller stabilisering af proteinet skal stadig bestemmes. Phosphorylering af ERK1 /2 blev også overvåget for at sikre funktionaliteten af ​​FGF-2 (fig. S3). For yderligere at kontrollere, at U2OS celler opførte sig som SCLC som reaktion på FGF-2 pro-overlevelse signalering vi også bestemt, hvis kunne påvises en stigning i anti-apoptotiske proteiner [8]. Som forudsagt, FGF-2 øgede B-celle leukæmi /lymfom-2 (BCL-2), BCL-2-like 1 protein (BCL-x

L) og X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP) ekspressionsniveauer men derudover vi også observeret induktion af en anden vigtig anti-apoptotisk protein, nemlig myeloid celle-leukæmi-sekvens (MCL) 1, i U2OS celler (fig. 2D og data ikke vist). Salg

celler blev serum- udsultes som før og efter stimulering med FGF-2 (10 ng /ml), proteiner ekstraheret ved anvendelse af co-immunoudfældning lysisbuffer. Cellelysater blev underkastet immunpræcipitation med (A.) S6K2, (B.) PKCε eller (C) B-RAF-antistoffer og proteiner detekteret ved Western blotting som angivet. D. Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af totale cellelysater og antistoffer mod MCL1 og BCL-2. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Repræsentative Western blots og middelværdi ± SEM fra tre uafhængige eksperimenter er vist i graferne. ‘-. Min

nedregulering af JAK1, JAK2 eller Tyk2, men ikke STAT1, STAT3 eller STAT5, hæmmer FGF-2-medieret resistens i U2OS celler

Mange kræftceller brugt i forskningen har de-reguleret JAK /STAT signalering. Dette afspejler den

in vivo

situation observeres den samme i humane tumor prøver. På trods af deres traditionelle roller i immunrespons Jaks og statistikker bliver i stigende grad anerkendt som vigtige molekyler i kræft biologi. Vores foregående data viste, at FGF-2 inducerede interaktioner mellem B-RAF, PKCε og S6K2, steg ekspressionen af ​​centrale anti-apoptotiske molekyler og beskyttede U2OS celler fra cisplatin-induceret apoptose. Vi næste spurgt, om ubikvitært udtrykte JAK familiemedlemmer og /eller deres substrat STAT’er var en del af denne signalvej. For at løse dette spørgsmål, blev RNA-interferens (RNAi) induceret ved hjælp korte forstyrrende (si) oligonukleotider mod JAK1, JAK2, Tyk2, STAT1, STAT3 og STAT5A /B. Gennem denne undersøgelse har vi anvendt siRNA pools hver omfatter fire siRNA oligonukleotider rettet mod forskellige regioner af samme target-molekyler. Alle siRNA pools blev valideret ved udfoldning og western blotting under anvendelse af antistoffer dannet mod det kendte mål samt nært beslægtede molekyler, som tidligere beskrevet i vores laboratorium [18]. Silencing effektivitet og specificitet af poolede siRNA’er er vist i figur S4. U2OS celler transficeret med siRNA blev behandlet med eller uden FGF-2 i 4 timer og efterfølgende eksponering for cisplatin (fig. 3 og 4). Ca. 50% af U2OS celler, der var bragt til tavshed JAK1 (siJAK), JAK2 (siJAK2) eller Tyk2 (siTYK2) behandlet med cisplatin undergik apoptose, og dette kunne ikke forhindres ved at forbehandle disse celler med FGF-2 (fig. 3). Apoptose blev vurderet ved hjælp af WST-1 assay (data ikke vist), eller ved anvendelse af PARP-spaltning (fig. 3A) og DNA-fragmentering (Fig. 3B) som udlæsninger. I stærk kontrast, blev den forøgede PARP-spaltning og sub-G1 cellepopulation induceret af cisplatin forhindret af FGF-2 i kontrolceller transficeret med en ikke-specifik siRNA (NS) og i ikke-transficerede celler. Således blev hver af de analyserede Jaks kræves til effektiv FGF-2-medieret chemoprotection fra cisplatin-induceret apoptose. Salg

Celler blev transficeret med 75 nM siRNA mod JAK1, JAK2 eller Tyk2. Utransficerede celler og celler transficeret med ikke-specifik siRNA (NS) blev anvendt som kontroller. Efter 48 timer blev cellerne genudpladet (2 × 10

5 celler /brønd) og inkuberet i serumfrit medium natten over. Efter 4 timer før behandling med FGF-2 (10 ng /ml) blev celler behandlet med cisplatin (60 uM) natten over. A. gennemsnit ± SEM af densitometriske værdier (spaltet PARP) fra tre forsøg er vist. B. cellecyklus profiler af tre uafhængige forsøg er grafisk repræsenteret som middelværdi ± SEM af sub-G1 populationer. De øverste paneler eksemplificere dataene og svarer til at kontrollere celler.

Celler blev transficeret med 75 nM siRNA mod STAT1, STAT3 eller STAT5A /B. Utransficerede celler og celler transficeret med ikke-specifik siRNA (NS) blev anvendt som kontroller (sml fig. 3). Cellerne blev behandlet som i figur 3. A. Middelværdi ± SEM af densitometriske værdier (spaltet PARP) fra tre forsøg er vist. B. cellecyklus profiler af tre uafhængige forsøg er grafisk repræsenteret som middelværdi ± SEM af sub-G1 befolkninger.

Vi næste undersøgt, om Jaks kan virke gennem deres kanoniske downstream mål STAT1, STAT3 eller STAT5. Men silencing hver af disse molekyler havde individuelt ingen virkning på FGF-2-induceret lægemiddelresistens. Faktisk PARP spaltning (fig. 4A) og sub-G1 hændelser (fig. 4B) udløst af cisplatin forblev signifikant reduceret i celler forbehandlet med FGF-2, uanset niveauet af STAT1, STAT3 eller STAT5A /B.

FGF-2 inducerer Tyk2 men ikke STAT fosforylering

STAT1, STAT3 og STAT5A /B er naturlige substrater af Jaks, men vores foregående data viser, at de ikke kan være påkrævet for FGF-2-induceret pro-overlevelse signalering. Hvis dette var sandt, ville man forvente FGF-2 til at være ude af stand til at aktivere STAT’er, en proces, der involverer tyrosinphosphorylering på specifikke rester, for hvilke phosphospecifikke antistoffer er tilgængelige [19]. Følgelig Derefter undersøgte vi, hvorvidt STAT’er blev modificeret nedstrøms for FGF-2 ved at analysere tyrosinphosphorylering af STAT1 (Tyr

701), STAT3 (Tyr

705) og STAT5A /B (Tyr

694) ved western blotting . Efter aftale med vores tidligere fund (fig. 4), FGF-2 undlod at fremkalde aktivering af STAT1, STAT3 eller STAT5 i U2OS celler (Fig. 5A). Men som forventet, disse proteiner kan phosphoryleres af interferon (IFN) -. Γ, interleukin (IL) -6, eller oncostatin M (OSM), der blev anvendt som positive kontroller (. Figur 5A)

EN. FGF-2 inducerede ikke STAT1, STAT3 eller STAT5 fosforylering. U2OS celler blev serumudsultet natten over og derefter stimuleret med FGF-2 i de angivne tidsrum. Celler behandlet med IFN-γ (500 IE /ml), IL-6 (200 ng /ml) /sIL-6R (250 ng /ml) og OSM (50 ng /ml) blev anvendt som positive kontroller til aktivering af STAT1, STAT3 og STAT5 hhv. Proteiner blev analyseret som før du bruger antistoffer mod phosphoryleret STAT1 (Tyr

701), phosphoryleret STAT3 (Tyr

705), phosphoryleret STAT5 (Tyr

694), og antistoffer, der genkender både phosphorylerede og phosphorylerede proteiner. B. FGF-2 inducerede phosphorylering af Tyk2 i U2OS celler. Celler blev inkuberet i serumfrit medium og derefter behandlet med FGF-2 (10 ng /ml) i de angivne tidsrum. Tyk2 blev immunpræcipiteret og western blotting-analyse blev udført under anvendelse af antistoffer mod phosphorylerede tyrosiner og total Tyk2. Tyk2 blev anvendt som en loading kontrol. C. totale cellelysater anvendt til at immunpræcipitere Tyk2 og fra celler transficeret med siTYK2 blev separeret på en 7,5% SDS-PAGE-gel og analyseret ved western blot. Membraner blev undersøgt for Tyk2, pErk1 /2-Thr

202/185 /Tyr

204/187 og total ERK1 /2. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. ‘-. Min

En potentiel forklaring på disse resultater omfatter muligheden for at FGF-2 simpelthen ikke aktivere Jaks, en proces, der også involverer tyrosinphosphorylering. For at bestemme om Jaks kan aktiveres ved FGF-2, besluttede vi at fokusere vores opmærksomhed på Tyk2, en af ​​de mindre undersøgte Jaks, der er bredt udtrykt i mange celletyper. U2OS celler blev behandlet med FGF-2 for forskellige perioder og Tyk2 blev immunpræcipiteret. Tyk2 tyrosinphosphorylering blev bestemt ved anvendelse af antistoffer mod phosphorylerede tyrosiner (4G10 og PY20, 01:01 blanding) og Tyk2 proteinekspression med et anti-Tyk2 antistof. FGF-2 inducerede en transient 2 gange stigning i Tyk2 tyrosinphosphorylering, som toppede ved 5 min og returneres tæt på basale niveauer med 30 min (fig. 5B). Nr phospho-Tyk2 eller Tyk2 sås i kontrolprøver (immunopræcipitationer med perler kun, eller med et irrelevant antistof). Sideløbende hermed blev helcellelysater anvendes til immunfældning og lysater fra siTYK2-transfekteret celler (antistofkontrol) analyseres (fig. 5C). Dataene således tyder på, at Tyk2 phosphoryleres, og potentielt aktiveret, nedstrøms for FGF-2. Disse resultater sammen med dem, der præsenteres i figur 3 er i fuld overensstemmelse med en rolle for Tyk2 neden for FGF-2, der ikke afhænger af den samtidige fosforylering /aktivering af STAT1, STAT3 og STAT5. Det er endnu ikke etableret, hvis JAK1 og JAK2 er også phosphoryleret nedstrøms FGF-2.

Tyk2 bindes til PKCε og B-RAF på FGF-2 behandling og er nødvendig for fuld phosphorylering af ERK1 /2 og MCL1 induktion

De foregående data fik os til at afgøre, om Tyk2 interagerede med B-RAF, PKCε og S6K2. Det var ikke trivielt at opdage Tyk2 i S6K2, B-RAF og PKCε proteinkompleks (r) formentlig på grund af lave udtryk niveauer for dette protein i U2OS celler. Tyk2 blev derfor immunpræcipiteret efter behandling med FGF-2 og immunopræcipitaterne analyseret ved Western blotting med antistoffer mod B-RAF, PKCε og S6K2 stedet. Ved FGF-2 stimulering Tyk2 kortvarigt forbundet med B-RAF og PKCε (fig. 6A). Den forbigående karakter af disse foreninger kan også forklare, hvorfor det var også svært at opdage S6K2 i disse immunkomplekser. De kontrol- lysater er vist i figur S5.

A. FGF-2 inducerede interaktion Tyk2 med PKCε og B-RAF i U2OS celler. Cellerne blev behandlet som beskrevet tidligere og proteiner isoleret ved anvendelse af co-immunopræcipitering puffer. Tyk2 blev immunpræcipiteret fra helcellelysater og immunpræcipitater blev analyseret under anvendelse western blots. Membraner blev probet for PKCε, B-RAF og Tyk2, sidstnævnte anvendes her som en loading kontrol. B. og C. Tyk2 silencing i U2OS celler førte til nedsat ERK1 /2 phosphorylering og inhiberede opregulering af MCL1 som reaktion på FGF-2. Celler blev transficeret med siTYK2 som før. Utransficerede celler og celler transficeret med en ikke-specifik siRNA (NS) blev anvendt som kontroller. Efter 48 timer blev celler behandlet som tidligere beskrevet og derefter stimuleret med FGF-2 til (B) 10 min og (C) 4 timer. B. Proteiner blev analyseret under anvendelse af antistoffer mod p-ERK1 /2 (Thr

202/185 /Tyr

204/187) og total ERK1 /2. Værdier svarer til phospho-ERK1 og -ERK2 niveauer. C. Western blotting-analyse blev udført ved anvendelse totale cellelysater og anti-MCL1 antistof. β-actin blev anvendt som en loading kontrol og til normalisering. Middelværdi ± SEM af densitometriske værdier af tre uafhængige forsøg er vist.

FGF-2-medieret chemoprotection kræves ERK1 /2-aktivitet (Fig. S2). For at konstatere, om dette var afhængigt af Tyk2 blev U2OS celler transficeret med siTYK2, behandles efterfølgende med FGF-2 og ERK1 /2 phosphorylering vurderes ved Western blot (fig. 6B). Sammenlignet med utransficerede celler, RNAi mod Tyk2 signifikant reduceret ERK1 /2 phosphorylering (med 40% for ERK1 og 25% for ERK2), et fænomen ikke observeret i celler transficeret med ikke-specifik siRNA. Dette fik os til at undersøge næste hvorvidt opregulering af anti-apoptotiske proteiner ved FGF-2 blev svækket ved Tyk2 silencing. RNAi blev udført som før, og, som et eksempel, ekspressionen af ​​MCL1 overvåges ved Western blot (fig. 6C). Utransficerede celler og celler transficeret med enten en ikke-specifik siRNA eller siERK1 /2 blev anvendt som kontroller. I utransficerede celler eller celler transficeret med en ikke-specifik kontrol, FGF-2 fører til en signifikant stigning i MCL1 proteinniveauer. Som forudsagt, siRNA mod ERK1 /2 inhiberede opregulering af MCL1 protein. Vigtigere er, at MCL1 ekspression ikke stige som reaktion på FGF-2 i celler med nedsatte niveauer af Tyk2, antyder, at denne JAK er påkrævet for opregulering af MCL1.

Discussion

Der er mange molekylære mekanismer, som celler kan blive resistente over for cytotoksiske lægemidler og dermed forskellige typer af resistens skal løses for at undertrykke kræftceller. FGF-2 er blevet identificeret som en negativ prognostisk faktor for mange kræftpatienter [5], [6], [7] og Seckl og Pardo har vist sin relevans for resistens [3], [4], [8], [ ,,,0],9], [20].

udgangen af ​​JAK /STAT signalveje konsekvenser langt ud over cytokin rige. Det er almindeligt accepteret, at JAK /STAT signalering er meget kontekstafhængig [18], [21], [