PLoS ONE: Diagnose af blærekræft Gentagelse Baseret på Urinary Niveauer af EOMES, HoxA9, POU4F2, TWIST1, VIM, og ZNF154 Hypermethylering

Abstrakt

Baggrund

Ikke muskel invasiv blærekræft (NMIBC) har den højeste gentagelse sats for enhver malignitet og så mange som 70% af patienterne oplever tilbagefald. Aberrant DNA-methylering er til stede i alle blæretumorer og kan påvises i urinprøver. Tidligere undersøgelser har identificeret DNA methylering markører, der viste signifikant diagnostisk værdi. Vi evaluerede betydningen af ​​de biomarkører til tidlig opdagelse af tumor tilbagefald i urin.

Metodologi /vigtigste resultater

De methylering niveauer af

EOMES

,

HoxA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM,

ZNF154

i urinprøver blev målt ved real-time PCR (MethyLight). Vi analyserede 390 urin sedimenter fra 184 patienter diagnosticeret med NMIBC. Urin fra 35 aldersmatchede kontrolpersoner blev anvendt til bestemmelse af methylering udgangsniveauer. Gentagelse blev diagnosticeret ved cystoskopi og kontrolleret af histologi. Oprindeligt sammenlignede vi urin fra blærecancerpatienter og raske individer og påvist signifikant hypermethylering af alle seks markører (P 0,0001) opnåelse følsomhed i intervallet 82% -89% og specificitet i intervallet 94% -100%. Efter, vi valideret urinvejene hypermethylering til brug i tilbagefald overvågning og fundet følsomhed 88-94% og særlige forhold 43-67%.

EOMES

,

POU4F2

,

VIM

ZNF154

blev oftere methylerede i urin fra patienter med højere lønklasse tumorer (P≤0.08). Univariate Cox regressionsanalyse viste, at fem markører var signifikant associeret med recidiv;

HoxA9

(HR = 7,8, P = 0,006),

POU4F2

(HR = 8,5, P = 0,001),

TWIST1

(HR = 12,0, P = 0,015) ,

VIM

(HR = 8,0, P = 0,001), og

ZNF154

(HR = 13,9, P 0,001). Interessant, for en gruppe af patienter (n = 15) fandt vi, at hypermethylering var konstant til stede i urinprøverne trods manglen på tumor tilbagefald, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​et felt defekt.

Konklusion /Betydning

methylering niveauer af

EOMES

,

HoxA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM,

ZNF154

i urinprøver er lovende diagnostiske biomarkører for blærekræft gentagelse overvågning

Henvisning:. Reinert T, Borre M, Christiansen A, Hermann GG, Ørntoft TF, Dyrskjøt L (2012) Diagnose af blærekræft gentagelse baseret på Urinary Niveauer af

EOMES

,

HoxA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM,

ZNF154

Hypermethylering. PLoS ONE 7 (10): e46297. doi: 10,1371 /journal.pone.0046297

Redaktør: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, USA

Modtaget: Juni 7, 2012; Accepteret: August 29, 2012; Udgivet: 3 oktober 2012

Copyright: © Reinert et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af John og Birthe Meyers Fond, dansk Frie Forskningsråd, Lundbeckfonden, Novo Nordisk Fonden, et EU-tilskud til UROMOL Consortium nr. 201.663, den danske Cancer Society, Aarhus Universitet, og det danske Indenrigs- og Sundhedsministeriet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft i urinblæren er den femte mest almindelige neoplasme i de industrialiserede lande. I cirka 75% af alle tilfælde vil patienterne præsentere med stadie Ta eller T1 non-muskel invasiv blærekræft (NMIBC), mens de resterende 25% af tumorerne vil være muskler invasive fase T2-4 kræftformer (MIBC) [1] . Ca. 60% -70% af patienter med NMIBC erfaring tumor tilbagefald inden 3 år efter resektion [2], [3] og patienter kan udvikle tilbagevendende tumorer årligt for mange år uden sygdomsprogression. Dog vil op til 25% videre til muskel invasiv sygdom [4]. Den høje recidivfrekvens og risikoen for progression bede behovet for hyppig og lang overvågning, hvilket gør blærekræft den dyreste kræft til behandling [5], [6]. Efter resektion af den primære tumor, patienter ofte overvåges af cystoskopi og cytologi. Biopsier taget under cystoskopi er den gyldne standard til diagnosticering blæretumorer. Følsomheden af ​​cystoskopi for NMIBC er tæt på 80% for hvidt lys cystoskopi, og 96% ved brug af dyrere, fluorescens-vejledt cystoskopi hjælp hexaminolevulinat (HAL). Til påvisning af dysplasi og carcinom in situ (CIS), følsomheden af ​​hvidt lys cystoskopi falder til 48% og 68%, henholdsvis; henviser følsomheden af ​​cystoskopi hjælp HAL for disse læsioner forbliver i området fra 93% -95% [7] – [9]. Cytologi anvendes ofte i kombination med cystoskopi, på grund af en høj specificitet på 99% (fra 0,83 til 0,997; 95% CI), men med en lav følsomhed på 34% (fra 0,20 til 0,53; 95% CI). Følsomheden af ​​cytologi stiger for tumorer høj-trins og høj kvalitet, især for primære tumorer [10]. Det er blevet foreslået, at en blære felt defekt kan forårsage den høje frekvens af tumor tilbagefald i blærecancerpatienter [11]. Adskillige molekylære ændringer har vist sig at være til stede i normalt udseende områder af urothelium hos patienter med blærecancer [12], [13], og for nylig en epigenetisk felt defekt blev beskrevet [14].

Epigenetik er undersøgelse af mitotisk og /eller meiotisk arvelige ændringer i genekspression, som ikke kan forklares med ændringer i DNA-sekvens [15]. DNA-methylering er et godt undersøgt epigenetisk mekanisme involveret i normale processer som udvikling, genomisk prægning, og X-kromosom inaktivering [16] – [18]. Ændringer i DNA-methylering er blevet associeret med adskillige humane patologiske lidelser, herunder cancer [19], og transkriptionel inaktivering ved afvigende hypermethylering er en veletableret mekanisme for gendæmpning i blære kræft [20] – [23]. Identifikation af DNA methylering markører til påvisning af blærekræft har stået på i nogle år. Flere undersøgelser har rapporteret høje følsomheder og særlige for disse markører, hvilket gør dem potentielt anvendelige som diagnostiske markører for blærekræft [24] – [31]. I en tidligere undersøgelse identificerede vi en række DNA-methylering markører (

EOMES

,

HoxA9

,

POU4F2

og

ZNF154

), der viste potentiale diagnostiske værdi i urinprøver fra BC patienter [26].

Vi har nu valideret den diagnostiske og prognostiske værdi af disse biomarkører sammen med tidligere rapporterede

TWIST1

[25] og

VIM

[30] i urinprøver. I første omgang, at validere betydningen af ​​de valgte methylering markører, og til at bestemme de markør afskæringsværdier, sammenlignede vi den første urinprøve fra hver patient med NMIBC til urinprøver fra raske individer. Efter, vi evaluerede den diagnostiske og prognostiske værdi af de markører til tidlig opdagelse af tumor tilbagefald ved hjælp af urinprøver opnået på senere opfølgende besøg.

Materialer og metoder

Etik Statement

informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter, og forskning protokoller blev godkendt af Region Midtjylland udvalgene vedrørende Biomedical Research Ethics.

Patient Materiale

i alt 652 annulleret urinprøver blev indsamlet ved Institut for urologi på Aarhus Universitetshospital fra 390 patienter blærecancer og 47 personer med benign prostatahyperplasi eller blæresten, men ingen historie for blærekræft (kontrol individer). Fra disse vi ekskluderet 227 prøver, fordi DNA beløb var under vores tærskel (Suppl. Tabel 1), hvilket efterlod 425 prøver (390 prøver fra 184 BC patienter og 35 fra kontrolprøver individer) (tabel 1 og Suppl. Figur 1). Ti til halvtreds ml urin blev opsamlet med regelmæssige opfølgende besøg. Urinprøver blev indsamlet umiddelbart før cystoskopi; celler blev sedimenteret ved centrifugering og nedfrosset ved -80 ° C. De tumorer blev iscenesat i henhold til TNM-systemet [32] og klassificeres efter Bergkvist [33]. Femten af ​​kontrolindivider var stix positiv for nitrit i urinen indikerer bakteriel infektion. Patient behandling og opfølgning blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i den europæiske sammenslutning af Urology [34].

DNA Udvinding og Bisulfite Ændring

DNA blev ekstraheret med QIAsymphony Virus /Bakterier Midi kit (96) (Qiagen) ved anvendelse af QIAsymphony® SP instrument og under anvendelse af den Complex800_V5_DSP protokollen. Fem hundrede nanogram af DNA var bisulfit modificerede hjælp EZ-96 DNA-methylering D5004 (Zymo Research) ifølge producentens anbefalinger og elueret i 60 pi elueringspuffer og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

Real- time kvantitativ methyleringsspecifik polymerasekædereaktion (methyLight)

Methyleringsanalyse blev udført under anvendelse methyLight [35]. Primere og prober for de seks gener af interesse blev designet til at omfatte otte til ti CpG-dinukleotider (Suppl. Tabel 2). For normalisering af DNA tilført materiale, vi brugte ALU-C4 repeat element sekvens [36]. qPCR amplifikationer blev udført med TaqMan Universal PCR Master Mix nr AmpErase (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner i dubletter anvendelse af 2 pi (5 ng) af bisulfit-modificerede DNA i et slutvolumen på 5 pi i 384-brønds plader på en ABI 7900 HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). Hvis dubletter var inkonsekvent, én gentagelse være positiv for methylering og en negativ for methylering, blev analysen gentaget. Prøven blev udelukket med hensyn til den specifikke markør hvis en anden inkonsekvent resultat blev opnået. Amplificeringsprotokoller er anført i suppl. Tabel 2. Amplification data blev analyseret ved påvisning sekvens-system (SDS 2.4, Applied Biosystems). Hver plade indeholdt en seriel fortynding (25-0.04ng) af fuldt methylerede DNA: CpGenome ™ Universal Methyleret DNA) (Millipore) med genet af interesse og ALU-C4, flere kontroller uden skabelon (NTC) brønde, 5 nanogram af en methyleret kontrolprøve [CpGenome ™ Universal methyleret DNA (Millipore)], og umethyleret prøve bestående af hel-genom amplificeret DNA fra perifert blod DNA. Procentdelen af ​​methyleret reference (PMR) blev beregnet for hver prøve ifølge ligningen: 100 × [(gen-x copy værdi) prøve /(ALU-C4 kopi værdi) prøve] /[(gen-x copy værdi) Universal Methyleret DNA /(ALU-C4copy værdi) Universal Methyleret DNA].

Statistisk analyse

Stata 11 (Statacorp, Texas, USA) blev anvendt til alle statistiske beregninger. To-tailed tests blev betragtet som statistisk signifikante, hvis P 0,05. Methylering forskelle blev evalueret ved ikke-parametrisk Wilcoxon-Mann-Whitney-test. Fishers eksakte test blev anvendt til analyse dikotome variabler. Den nøjagtige $ x ^ 2 $ test blev anvendt til at analysere associationer mellem klinik-patologiske parametre med to eller flere kategorier. Korrelationer på methylering niveauer af markørerne blev beregnet med Spearman korrelationskoefficienter. En ROC-kurve blev foretaget for hver markør og kombinationer af markører ved at plotte følsomhed mod (1-specificitet) og arealet under kurven (AUC) blev beregnet. Log-Rank test blev anvendt til at vurdere lighed af overlevelse og Kaplan-Meier overlevelsesrater parceller blev anvendt til visualisering. Univariate Cox regressionsanalyse blev brugt til at analysere sammenslutninger af alder, køn, stadie, grad, mangfoldighed, og CIS med recidiv overlevelse

Resultater

Vores analyse var opdelt i to dele:. 1 ) for at etablere cutoff niveauet af methylering markører og for at vise betydningen af ​​de valgte markører vi analyserede den første urinprøve fra hver patient og sammenlignet med kontrol urinprøver fra raske individer; 2) ved hjælp af bestemte markør cutoff niveauer, vi så valideret den diagnostiske og prognostiske værdi af methylering markører i urinprøver taget under patient overvågning.

Etablering af Test Cut-off niveauer og Initial Validering af Marker Betydning

i første omgang vi defineret cut-off niveauer ved den gennemsnitlige methylering for hver markør + 2x standardafvigelse af methylering niveauet i urinprøver fra 35 kontrolpersoner (kun prøver med methylering værdier over nul blev inkluderet). Cut-off niveauer (PMR-værdier – se materialer og metoder), der anvendes til at dichotomize de methylering markører var:

EOMES

= 0,348,

HoxA9

= 0,077,

POU4F2

= 0,371 ,

TWIST1

= 0,405,

VIM =

0,368 og

ZNF154

= 1,51. Andre cut-off-niveauer (middel + 1xSD og + 3xSD) baseret på methylering niveauer i kontrolprøver urinprøver blev indledningsvis anset (resultater ikke vist). For at validere betydningen af ​​markørerne for blærekræft diagnose Vi sammenlignede den første urinprøve fra 184 patienter diagnosticeret med NMIB til urinprøver fra 35 kontrolindivider (tabel 1). Alle seks markører var stærkt signifikant hyper-methyleret i urinen fra patienter med NMIBC sammenlignet med urin fra raske individer (Mann-Whitney, P 0,0001) (tabel 2). Bedre følsomhed markørerne blev observeret ved analyse urinprøver fra patienter med en hændelse tumor sammenlignet med urin fra patienter med tilbagevendende tumor (Suppl. Tabel 3). Der blev ikke observeret sammenhæng mellem de enkelte markører og tumor stadie, men

EOMES

,

POU4F2

,

VIM

, og

ZNF154

var mere denatureret i lønklasse III læsioner sammenlignet med klasse i læsioner (Fishers eksakte test, P≤0.048) (Suppl. tabel 4).

EOMES

,

POU4F2

og

ZNF154

var mindre denatureret i tumorer med en størrelse under 3 cm. (Fishers eksakte test, P≤0.047) (Suppl. Tabel 4).

Påvisning af Gentagelser af Methylering Markers

Vi valideret den kliniske anvendelighed af markører for blærekræft overvågning. Vi stratificeret vores analyse kun omfatter patienter, der oprindeligt viste hypermethylering af en eller flere methylering markører. Afhængigt af det undersøgte markering, 11-18% af patienterne viste ingen methylering i den første tumor og blev derfor ikke inkluderet. Dette begrænsede analysen til 158 patienter og 206 urinprøver fra de opfølgende besøg; 139 urinprøver var fra patienter med tilbagevendende blære tumor og 67 urinprøver var fra patienter uden tumor tilbagefald (tabel 1). Anvender cut-point bestemmes indledningsvis ved hjælp af urin fra raske personer; vi opnåede følsomhed i området fra 87% til 94%, og specificiteter i intervallet fra 28% til 47% (tabel 3). Til sammenligning følsomheden af ​​cytologi var 77% og specificiteten var 60%. Vi observerede ingen signifikante sammenhænge mellem methylering niveauer og clinicopathologic variabler for denne patientgruppe kohorte med tilbagevendende tumorer (Suppl. Tabel 5).

De molekylære test kan have en højere følsomhed i forhold til guldstandarden cystoskopi. For at løse dette, vi derfor brugt cystoskopi resultater fra en 12 måneder periode efter urin blev udtaget. Vi fandt mange af prøverne tidligere klassificeret som falske positiver til at være sandt positive; de simpelthen haft en positiv lead tid i forhold til cystoskopi. Den opnåede følsomhed varierede fra 88% til 94%, og specificiteten varierede fra 43% til 67% (tabel 4). Herunder tumorer diagnosticeret i løbet af en 12-måneders opfølgningsperiode og kombinere to markører med kravet om, at begge mærker var positive for en positiv test resultere følsomheden faldt (område: 86-93%), mens specificiteten øges (område: 50-73 %). Hvis blot én af to markører bør være positiv, følsomheden forøges (område: 92-98%), mens specificiteten faldt (område: 29-60%) (.. Suppl tabel 6 og Suppl tabel 7, henholdsvis). Samlet set har kombinationer af markører ikke forbedre både sensitivitet og specificitet af testene.

prognostiske værdi af methylering Markers for Forudsigelse Senere Gentagelser

For at løse den prognostiske værdi af de methylering markører vi analyserede urinprøver fra patienter på besøg, hvor der ikke tumorer blev diagnosticeret ved hjælp af cystoskopi. For alle markører fandt vi, at en positiv markør på en tumor-negative besøg var signifikant associeret med senere tumor tilbagefald i løbet af 24- og 60-måneders opfølgningsperiode perioder (Log-Rank test, P≤0.04) (Figur 1 og Suppl. Figur 3). blev observeret De væsentligste forskelle i 24-måneders tidsramme for

POU4F2

ZNF154

(Log-Rank test, P 0,0001), hvor kun 12% (3/25) og 8% (2/26) uden methylering oplevet en gentagelse inden for 2 år, hhv. For methylering-positive prøver var procentdelen af ​​patienter med senere recidiv 68% (21/31) i

POU4F2

og 63% (20/32) i

ZNF154

. Univariate Cox regressionsanalyse viste, at

HoxA9

(HR (95% CI) = 7,8 (1.8-33.7)),

POU4F2

(HR (95% CI) = 8,5 (2,5-28,5) ),

TWIST1

(HR (95% CI) = 12,0 (1.6-88.6)),

VIM

(HR (95% CI) = 8,0 (2.4-26.8)), og

ZNF154

(HR (95% CI) = 13,9 (3.3-59.7)) var signifikant associeret med recidiv overlevelse. Alder, køn, tidligere stadie, tidligere klasse, tidligere mangfoldighed, og tidligere CIS blev ikke signifikant associeret med recidiv-overlevelse (P 0,05). Følgelig er tilstedeværelsen af ​​en ændret methylering af DNA i urinen syntes at være stærkt relateret til prognosen.

DNA methylering er forbundet med efterfølgende tumortilbagevenden inden for 24 måneder for patienter uden tumor, men med methylering positive urinprøver. Kaplan-Meier-kurver over tilbagefald overlevelse som funktion af dikotomiseret methylering niveauer for

EOMES Hotel (P = 0,0397) (A),

HoxA9 Hotel (P = 0,0009) (B),

POU4F2 Hotel (P 0,0001) (C),

TWIST1 Hotel (P = 0,0017) (D),

VIM Hotel (P = 0,0001) (E), og

ZNF154 Hotel (P 0,0001). (F)

Identifikation af patienter med en mulig Epigenetisk Field defekt

Hvis methylering af biomarkører var begrænset til maligne celler, vi skal kun registrere de markører i urin, når en tumor var til stede, eller ligger inden for en overskuelig fremtid, afhængigt af væksten af ​​tumoren. Imidlertid viste vore resultater, at selv høje niveauer i urinprøver af methylering kunne være til stede ved besøg uden gentagelser (Suppl Figur 2, patienter C og D;.. Suppl figur 3). Vi kunne identificere en gruppe af 15 patienter (31%), hvor methylering var til stede i urin ved det første besøg og fortsatte med at være til stede i urinprøver taget på senere opfølgningsbesøg, selv om ingen tumor indtraf. Som et eksempel blev en methylering-positive patient med den mest langvarig opfølgning diagnosticeret med CIS efter 118 måneder, men havde ingen læsioner i mellem. De 15 patienter med et felt defekt, men ingen gentagelse, har en betydelig lavere antal tumorer ved tidligere besøg (P = 0,02) i forhold til patienter med recidiv.

Modificeret fra Hermann GG et al. (https://skejby.net/Webudgaven/DaBlaCa2010.htm.).

Diskussion

I dette studie vi udført en uafhængig validering af

EOMES

,

HoxA9

,

POU4F2

,

TWIST1

,

VIM

, og

ZNF154

methylering for urin diagnose i blærekræft overvågning. Vi opnåede følsomheder i området 87% -93% og særlige i intervallet 28% -47%. Når herunder tumorer resektion i en 12-måneders opfølgningsperiode opnåede vi følsomheder i intervallet 88% -94% og særlige i intervallet 43% -67%. Univariate Cox regressionsanalyse viste, at methylering markører forudsagte fremtidige gentagelser med hazard ratio i intervallet fra 7.8 til 13.9 (P≤0.015). Forrige etape, kvalitet, mangfoldighed og CIS blev ikke signifikant associeret med tumor tilbagefald. Interessant, vi også observeret, at nogle blærekræft patienter uden tilbagefald stadig opretholdt afvigende urin methylering der adskiller dem fra kontrolpersoner. Vi mener, at dette kan være forårsaget af en generel epigenetisk blære slimhinden ændring.

Den kontrol, der anvendes i denne undersøgelse var fra patienter med benign prostatahyperplasi (BPH) eller blæresten og 43% af kontrollerne var nitrit positive, indikerer blære infektioner. Nogle af cellerne i urinen hos kontrollerne kan stamme fra hyperplasi, eller kan være immunologisk eller bakterieceller. Lignende kontrolprøver blev påført, når markørerne blev indledningsvis undersøgt som markører for blærecancer, hvilket antyder, at methylering hyppigheden af ​​de valgte markører er lav i disse celletyper [25], [26], [30]. Celler fra prostata eller fra en blære infektion kan stadig forspænder de opnåede resultater ved fortynding af tumorcellerne. Dette kunne føre til falske negative testresultater. Bakterielle infektioner er langt mindre udbredt, og i vores studie infektioner blev ikke signifikant associeret med markør methylering, hvilket indikerer, at infektioner ikke påvirkede markør følsomhed (Suppl. Tabel 4).

Det er bemærkelsesværdigt, at kun 9% af gentagelser er klasse I. Derfor de beregnede følsomhed markørerne kan højere sammenlignet med følelser, der ville blive opnået fra en fortløbende serie af patienter med lav risiko med en meget højere antal Grade i tumorer.

en af ​​de største udfordringer ved hjælp af urin markører bliver tilstrækkelige tumorceller, og mens MethyLight er en meget følsom metode havde vi stadig til at udelukke 227 (35%) prøver fra undersøgelsen på grund af utilstrækkelige mængder af DNA. Vi observerede, at hvis vi medtaget prøver med mindre end 5 ng DNA som template i analysen, nedsat følsomhed, og til patienter under overvågning specificiteten forøges. Ved at udelukke patienter baseret på mængden af ​​DNA ekstraheret fra de annulleret urinprøver, fastholder vi integritet MethyLight analysen ved omkostningerne ved at indføre en bias hvor især patienter med stadie Ta grad I tumorer er udelukket, da lønklasse I læsioner exfoliate den mindste antal celler [37] (Fishers eksakte test, P 0,05) (. Suppl tabel 1). For nylig viste en undersøgelse fra Zuiverloon et al. rapporteret en stigning i følsomheden af ​​

FGFR3

mutation som markør for tumortilbagevenden fra 75% til 100%, når mængden af ​​urin anvendt til testen blev øget [38]. Ved at øge mængden af ​​indsamlet urin fra de nuværende 10 til 50 ml, vil færre prøver skal udelukkes [39], [40]. Andre muligheder for at forbedre assay til påvisning af methylering kan omfatte analyse af to eller flere prøver hver for sig eller til at bruge en anden teknologi end Methylight (f.eks Indlejret PCR).

methylering markør test kan suppleres med

FGFR3

mutationsanalyse.

FGFR3

mutationer er til stede i omkring 70% -80% af lav kvalitet NMIBC, og mutationer i

FGFR3

gen har vist sig at kunne påvises i DNA fra udtømt urin [41], [42]. Svarende til methyleringsanalyse,

FGFR3

Analysen er baseret på DNA, og det primære besøg kan bruges til at lagdele for tilstedeværelsen af ​​mutationen. Nylige undersøgelser med

FGFR3

mutationer alene at opdage NMIBC gentagelser rapporterer en følsomhed på 58% for samtidige gentagelser. Følsomheden øges, når 12 måneders opfølgning var inkluderet [43]. Kombinationen af ​​

FGFR3

mutationer og methylering markører er blevet testet af Serizawa et al., Og de observerede en stigning i følsomheden af ​​DNA fra udtømt urin, når man kombinerer methylering markører og

FGFR3

mutationer [44 ]. Det er bemærkelsesværdigt, at de observerede en omvendt korrelation mellem hypermethylering og

FGFR3

mutationer.

Det faktum, at vi finder ingen associationer mellem methylering og clinicopathologic variabler ved brug af kun urin fra patienter med tilbagevendende tumorer er spændende , men det kan være, at lavere følsomhed observeret i lav kvalitet tumorer ikke kun forårsaget af få eksfolierede tumorceller i urinen, men snarere at hypermethyleringen ikke er til stede i tumoren eller i det omgivende urothelium, og ved at stratificere for methylering på et tidligere besøg disse patienter er udelukket. Det er muligt, at patienter uden methylering skal betragtes som en særlig gruppe af blæretumorer. Endelig kan den manglende sammenhæng mellem methylering og klinik-patologiske variabler også være en konsekvens af den relativt lille datasæt.

methylering markører har specificitet værdier i området 43% til 67%, hvilket er lavt i betragtning at de alle har mellem 94% -100% tumorspecificitet sammenlignet med kontrolpersoner. En tilsvarende lav specificitet blev observeret i et studie, der undersøgte mRNA niveauerne af hTERT, SENP1, PPP1CA, og MCM5 i urin fra patienter under sygdomsovervågning [45]. Lav specificitet blev også observeret ved Zuiverloon et al. når man studerer

FGFR3

mutationer til at opdage blærekræft gentagelser [38]. Endvidere blev lav specificitet methylering markører tidligere rapporteret andre steder af to undersøgelser med henblik på at afsløre NMIBC gentagelser [46], [47].

methylering observeret i urinprøver fra cystoskopi-negative besøg kan have flere kilder, ( i) en lille tumor registreres ikke af cystoskopi, (ii) resterende tumorceller på stedet af resektion, eller (iii) det kan være et symptom på epigenetisk ændrede urothelial celler til stede i urothelium omgiver tumoren eller andetsteds (felt defekt ), der ikke har nogen fænotype for at skelne dem fra normale urothelial celler – en epigenetisk urotelial methylator fænotype [14]. Nogle af de falske positive prøver med en gentagelse inden for 12 måneder efter cystoskopi er mest sandsynligt forårsaget af ubesvarede tumorer eller resterende tumorceller, men for resten af ​​de falske positive prøver er usandsynligt denne forklaring og vores resultater stemmer godt overens med tilstedeværelsen af ​​en blære felt defekt. Nylige data understøtter opfattelsen af, at der er en DNA-hypermethylering felt defekt i blærer fra BC patienter, hvor det normalt udseende væv indeholder udbredt DNA-methylering [14]. Wolff og medarbejdere tyder på, at den afvigende methylering ikke skyldes klonal ekspansion, men i stedet skyldes generaliseret epigenetisk ændring i urothelium tværs blæren. Det er blevet foreslået, at denne udbredte område af afvigende methyleret normalt udseende urothelium kan være oprindelsen af ​​den høje recidivraten i blærekræft [14].

Med opdagelsen af ​​methylering markører med meget høj følsomhed, gennemførelse af methylering markører i overvågningen af ​​patienter med lav-grade NMIBC synes sandsynligt. På tidspunktet for diagnosen, skal være etableret før markøren kan anvendes til overvågning af methylering for hver methylering markør. Forud for det næste kontrolbesøg, kan patienten levere en urinprøve til analyse, og der findes tre mulige udfald: i) hvis testen er positiv patienten vil have en cystoskopi gjort, og 67 patienter ud af 100 et tilbagevendende tumor vil blive fundet, mens de resterende 33 patienter, der ikke vil have en tumor tilbagefald. Dette er ikke et stort problem, da de falske positive patienter ville have haft en cystoskopi udført under alle omstændigheder; ii) en negativ test vil give patienterne for at springe den aktuelle cystoskopi. Med den nuværende præstation af analysen, er 94 ud af 100 BC patienter med en tumor tilbagefald diagnosticeres korrekt og seks patienter fejlagtigt diagnosticeret som ikke at have en tumor tilbagefald. Denne mængde falske negativer er sammenlignelig med HAL-guidet cystoskopi og bedre end hvidt lys cystoskopi, hvor der kan forventes 20 patienter, der skal fejlagtigt diagnosticeret som ikke at have en tumor tilbagefald [7] – [9]. Men i denne undersøgelse

ZNF154

markør undladt at diagnosticere to muskel-invasiv blære kræftformer, der skred fra to T1 grad III tumorer. Dette ville ikke være acceptabelt i et klinisk miljø, og indikerer, at patienter med en høj risiko for progression (fx alle T1, grad III tumorer eller CIS) er nødt til at fortsætte med den almindelige behandlingsregime. En anden mulighed kunne være at bruge en mere konservativ cut-off. Ved at definere de cut-off værdier som gennemsnittet plus 1x standardafvigelse af methylering niveau, de to muskel invasive tumorer ville ikke have været savnet; iii) en urinprøve med utilstrækkelig DNA bør føre til en fortsættelse af den oprindelige behandlingsregime. I alle tre tilfælde vil patienten levere en ny urinprøve inden det næste kontrolbesøg, der vil afgøre, hvorvidt patienten skal have en cystoskopi udført. De methylering markører kan også øge opdagelse sats af CIS-læsioner, som en positiv test med en negativ cystoskopi så kunne følges af en anden cystoskopi herunder HAL.

Som konklusion, ved at anvende en meget følsom og semi-kvantitativ metode til detektering blærekræft gentagelser og stratificering for status for methylering af den oprindelige tumor, har vi vist, at anvendelse af en enkelt markør (

ZNF154

) vi kan detektere en ledsagende tumortilbagevenden med en følsomhed på 94% og en specificitet på 67 %. Ifølge EAU retningslinjer for NMIBC, den nuværende behandling ordning for lavrisiko-NMIBC patienter er cystoskopi ved 3 og 12 måneder efter TUR og derefter hvert år i yderligere 4 år [48]. Denne undersøgelse tyder på, at methylering markører kan anvendes som markører for blærekræft gentagelse at reducere antallet af cystoscopies hos patienter med lav risiko uden samtidig tumor (figur 2) og dermed forbedre livskvaliteten for patienterne samt nedgang sundhedspleje udgifter.

Støtte Information

figur S1.

rutediagram, der illustrerer flowet af prøver i løbet af studiet.

doi: 10.1371 /journal.pone.0046297.s001

(EPS)

figur S2. Salg Eksempler på methylering niveauer på første besøg og to efterfølgende besøg i 5 patienter med eller uden tilbagefald. Patienter med to efterfølgende gentagelser (A og B). Patient uden gentagelser ved første kontrolbesøg, men tilbagefald på et senere kontrolbesøg (C og D). En patient med nogen efterfølgende gentagelser (E). PMR er procentdelen af ​​relativ reference. En værdi på 0% betyder ingen methylering og en værdi på 100% betyder fuldt methyleret. En mørk søjle repræsenterer et besøg med samtidig tumor og en grå bjælke repræsenterer et besøg uden tumor

doi:. 10,1371 /journal.pone.0046297.s002

(EPS)

Figur S3.

Kaplan-Meier plot af tid til tilbagefald. DNA-methylering er forbundet med efterfølgende tumortilbagevenden inden for 60 måneder for patienter uden tumor, men med methylering positive urinprøver.