PLoS ONE: Niche-afhængig genekspression Profil af intratumoral Heterogen kræft i æggestokkene Stem Cell Populations

Abstrakt

intratumoral heterogenitet udfordrer eksisterende paradigmer for anti-cancer terapi. Vi har tidligere vist, at de menneskelige embryonale stamceller (hESC) afledte cellulære mikromiljø i immunsvækkede mus, muliggør funktionel skelnen af ​​heterogene tumorceller, herunder celler, som ikke vokser ind i en tumor i en konventionel direkte tumor xenograft platform. Vi har identificeret og karakteriseret seks cancer cellesubpopulationer hver klonalt ekspanderet fra en enkelt celle, der er afledt fra human ovarie clear cell carcinoma af en enkelt tumor, at demonstrere slående intratumoral fænotypisk heterogenitet, der er dynamisk afhængig af tumorvækst mikromiljø. Disse cancercellelinier subpopulationer, kendetegnet som cancer stamceller cellesubpopulationer, trofast rekapitulere det fulde spektrum af histologisk fænotypiske heterogenitet kendt for human ovariecancer clear cell carcinoma. Hver af de seks subpopulationer viser et andet niveau af morfologiske og tumorigen differentiering, hvor væksten i embryonale-afledte mikromiljø favoriserer væksten af ​​CD44 + /aldehyd dehydrogenase positive lommer af selvfornyende celler, der opretholder tumorvækst gennem en proces med tumorigen differentiering i CD44- /aldehyddehydrogenase negative derivater. Påfaldende er disse afledte celler udviser mikromiljø-afhængig plasticitet med kapacitet til at genoprette selvfornyelse markører og CD44-ekspression. I den aktuelle undersøgelse, afgrænse vi den særskilte genekspression og epigenetiske profiler af to sådanne subpopulationer, der repræsenterer ekstreme fænotypisk heterogenitet i form af niche-afhængig selvfornyelse og tumorigen differentiering. Ved at kombinere Gene Set Berigelse, Gene ontologi og Pathway-fokuseret vifte analyser med methylering status, foreslår vi et udvalg af effektive forskelle i tumor selvfornyelse og differentiering veje, der ligger til grund for slående intratumoral fænotypiske heterogenitet, der kendetegner denne og andre solide tumorer maligniteter.

Henvisning: Abelson S, Shamai Y, Berger L, Skorecki K, Tzukerman M (2013) Niche-afhængig genekspression Profil af intratumoral Heterogen kræft i æggestokkene stamcellepopulationer. PLoS ONE 8 (12): e83651. doi: 10,1371 /journal.pone.0083651

Redaktør: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, USA

Modtaget: 21. maj 2013; Accepteret: November 6, 2013; Udgivet: 17. december 2013 |

Copyright: © 2013 Abelson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finnancial støtte for denne forskning blev leveret af Daniel M. Soref Charitable Trust, Skirball Foundation og ved en forskningsbevilling fra Israel Science Foundation (tilskud nr 453 /06MT og tilskud No. 62/10 MT) .De finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det er nu almindeligt forstås, at en enkelt tumor består af heterogene cellepopulationer, som hver især viser et mangfoldigt cellulær morfologi, fænotypiske ekspression, tumorinitiering kapacitet og iboende eller erhvervet resistens over for anticancerlægemidler. Den nyligt offentliggjort forskning, der beskriver intratumoral heterogenitet tarmkræft cellulære og funktionel adfærd, som vises af omfattende variation i vækst dynamik, vedholdenhed gennem serielle xenograft passager og respons på behandling understreger yderligere kompleksiteten af ​​humane tumorer [1].

aggressivitet og opfindsomhed af humane kræftformer stammer hovedsageligt fra en sådan kompleks intratumoral heterogenitet, som igen er blevet tilskrevet genetiske og epigenetiske ændringer kombineret med adaptive reaktioner på tumor mikromiljø. Akkumulerende beviser viser, at modellen af ​​’cancer stamceller “(CSC) og klonal evolution model, gensidigt bidrage til intratumoral heterogenitet, som CSC selv gennemgår klonal evolution [2-7]. Den kontinuerlige akkumulering af mutationer genererer heterogenitet af celler i en fast tumor og dens metastaser, og kan afspejle en proces, hvorved visse undergrupper af tumorceller blive mere aggressive i processen for tumorprogression. En afgørende indsigt vedrører forståelse for, at selv-fornyelse kapacitet for kræft stamceller er ikke en holdbar tilstand, men snarere dynamisk og niche-afhængig. Tumor stroma interaktion signaler også regulere epitelial kræft celle plasticitet via epitelial til mesenkymale overgang programmer (EMT), som ud over at lette invasion og metastase af kræftceller, muliggør omdannelsen af ​​ikke CSCS i CSCS og kan påvirke ændringen af ​​tumor mikromiljø ved at konvertere cancerceller i tumor understøttende stroma [8-11]. Som sådan kompleksitet og plasticitet af faste tumorer udstråler fra kravet om en støttende mikromiljø, som tilvejebringer en kompatibel netværk af interaktioner mellem de heterogene cancerceller og forskellige tumor-understøttende celler [12-16]. Rekruttering af tumor understøtter multipotente mesenkymale stamceller kombineret med omfattende ombygning af tilstødende væv er en vigtig fremgangsmåde til tilvejebringelse af et mikromiljø, som understøtter cancercelleproliferation, migration og invasion [17,18]. De særlige processer, der er blevet meget omfattende undersøgt omfatter neoangiogenese [19], tiltrækning af inflammatoriske celler [20] og cancer associeret fibroblaster [21-23], som sammen med den ekstracellulære matrix (ECM) skabe kompleksiteten af ​​tumormassen [24] .

xenotransplantation modeller til frembringelse humane tumorer i immundefekte mus er begrænset af forskelle mellem det murine og det humane mikromiljø, især med hensyn til de niche-afhængige egenskaber hos CSC selvfornyelse [25,26]. I mange tilfælde denne begrænsning fører til forskellige læse outs af distinkte tumor subkloner i xenotransplantation analyser [5,21,27,28]. Derfor har vi etableret og valideret en tumor mikromiljø model baseret på potentialet i humane embryonale stamceller (hESC) til at generere teratomer i immunsvækkede mus. Denne model har den lethed af standard xenograftmodeller, men den fordel, at tumormikromiljøet består af en lang række ikke-transformerede differentierede væv hidrørende fra alle tre kimlag og strukturer af menneskelig oprindelse [29,30]. Vi har tidligere vist, at dette

in vivo

model giver en privilegeret tumorigenese mikromiljø med følgende funktioner: a) forbedret tumor celle levedygtighed; b) fremtrædende tumorinvasion celle; c) tumorinduceret vaskulogenese; og d) relativ beskyttelse mod immuntoksin induceret regression [29,30].

æggestokkene klar celle karcinom (OCCC), er kendetegnet ved slående intratumoral morfologisk heterogenitet, herunder celler med træk af fremskreden ovariecancer strukturel variation på den ene side, og celler med træk af tumorigen differentiering (f.eks invasion, spredning) og tilsvarende celleoverfladen og intracellulært markør heterogenitet [31-35]. Vi har isoleret og karakteriseret seks forskellige cancercellelinier subpopulationer (CCSPs) fra en tumor i en enkelt patient, og demonstreret niche afhængige tumorigene kapacitet og histologiske fænotyper, når de dyrkes i embryonale-afledte teratom væv, der kumulativt rekapitulere det fulde spektrum af tumor heterogenitet [ ,,,0],36]. De seks CCSPs blev karakteriseret som æggestokkene CSC i kraft af funktionelle og fænotypiske udtryk for CD44 + CD24 + EpCAM + og ALDH1 aktivitet [5,36]. Desuden har disse seks distinkte subpopulationer blevet funktionelt karakteriseret som viser de vigtigste stamcelle egenskaber af både selvfornyelse og tumordannende differentieringsfaktorer kapacitet i en niche afhængig måde. I murine niche, der er begrænset støtte til selvstændig fornyelse af CSC, sammen med en høj grad af tumorigen differentiering, mens embryonale-afledte niche mere fremtrædende fastholder CSC selvfornyelse i modsætning til differentiering. Således embryonale-baserede model giver en afgørende

in vivo

platform i betragtning af den vigtige rolle, CSC selvfornyelse i modstanden mod anti-cancer behandlinger og rendering intratumoral heterogenitet modtagelig for biologisk analyse samt anticancer terapi test [5]. Endvidere blev det for nylig påvist, at embryonale-baserede model udtrykke

bona fide

menneskelig tumor blodkar og forbedre tumor transplantation sats ved primære humane ovariecancer stamceller-lignende celler (CSC) [37]. Derfor vi havde til formål at undersøge de respektive genekspression profiler af to forskellige OCCC-afledte CCSPs repræsenterer de ekstreme ender af spektret i form af niche-afhængig selvfornyelse versus tumorigen differentiering. De opnåede resultater fremhæve veje for intratumoral heterogenitet på genekspression og epigenetiske niveauer, og det vigtige bidrag af tumor mikromiljø til denne heterogenitet.

Materialer og metoder

Udledning af æggestokkene kræft celle subpopulationer

Samling af ascites væske blev udført med et skriftligt informeret samtykke fra en 64-årig patient diagnosticeret med stadie IV æggestokkene Clear celle karcinom og protokollen blev godkendt af institutionelle etisk gennemgang Komité Rambam Medical center. Seks forskellige cancercellelinier subpopulationer, klonalt ekspanderet fra en enkelt celle, herunder CCSP C12 og C13, blev afledt af maligne æggestokkene ascites og propageret i kultur som beskrevet tidligere [5,36]. Klonalitet assays under anvendelse af HUMARA metoden [38] og Forensic STR-analyse indikerede et monoklonalt oprindelse for alle seks CCSPs undersøgt (data ikke vist). Alligevel karyotype-analyse af metafasekromosomer ekstraheret fra hver cancer cellesubpopulation, udspredt på objektglas og analyseret ved Spectral-Karyotyping (SKY), viste en høj grad af kromosomale ændringer og variationer blandt CCSPs (data ikke vist). Det skal bemærkes, at selv om opretholdes i kultur i mere end 6 år, cellekulturer gentagne gange indledt fra frosne lagre hver 3-4 måneder, og de CCSPs holdbart og konsekvent fastholde “

bona fide

” ovariecancer karakteristika , CSC karakteristika og xenotransplanteret tumor histologiske fænotype [5,36].

Dyr, teratoma, tumor dannelse og væv håndtering

SCID /beige mus blev indkøbt fra Harlan Laboratories Ltd., Jerusalem, Israel. Musene blev huset og holdt under specifikke patogenfrie betingelser som instrueret af Udvalget for Tilsyn dyreforsøg ved Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel. Dette blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Technion (Protokol # IL-026-02-12). Mus blev observeret for teratom og tumordannelse gang om ugen og aflivet under anvendelse af CO

2 inhalation. For teratom dannelse, udifferentieret embryonale fra klon H9.1 (46XX), blev injiceret i mus bagben muskulatur (~ 5×10

6 celler pr injektion) [29]. Ved 7-8 uger efter indledende injektion af embryonale, 4×10

6 cancerceller blev injiceret i teratom (i.t tumorer) og fik lov at vokse i yderligere 20 til 60 dage. Kontrol tumorer afledt af direkte indsprøjtning (im tumorer) af 4×10

6 celler i muskulaturen bagben blev høstet ved 20 til 60 dage efter injektionen.

genekspressionsstudier

Udtrykket undersøgelser var udført med tre uafhængige prøvesæt vha Illumina HumanWG-6 V3.0 ekspression beadchip Array. De scannede billeder blev analyseret under anvendelse Illumina s GenomeStudio V.2009.1 software (Illumina Inc. San Diego, CA, USA) til ekstraktion og kvalitetskontrol. De rå data fra tre uafhængige microarray eksperimenter blev importeret til genomics software (Genomics Suite, Partek Inc., St. Louis, MO), normaliseret, og en fjernelse af eventuelle ikke-biologiske, “batch effekter”, som kan forstyrre den resultater udført. Genekspressionen signaler blev transformeret ved at beregne basen to logaritmer. Gener, de givne transkript ikke blev udtrykt over baggrunden defineret af negative kontrolprøver prober Illumina beadchip i alle prøver blev frafiltreret. Dataene er deponeret i National Center for Biotechnology Information GEO7, og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse GSE43208.

Differentiel udtryk for enkelte gener

Gener, som er forskelligt reguleret i hver gruppe, var vælges på grundlag af deres fold ændring. Gennemsnittet af de normaliserede gener signaler mellem de forskellige grupper blev sammenlignet og t-test blev anvendt til at vurdere den statistiske signifikans af folden forskel mellem dem. Gener blev udvalgt baseret på fold ændring ( 2), og tilsvarende statistisk signifikant p-værdi ( 0,05). For at reducere risikoen for falske positiver, gener, som ikke følger den 2 gange tærskel i hver af de 3 uafhængige genekspression arrays blev udeladt.

Gene Set Enrichment analyser (GSEA)

GSEA blev udført ved anvendelse af JAVA-baseret software [39]. Forkanten Analyse værktøj (LEA) blev anvendt til at udtrække de centrale gen medlemmer af de berigede gensæt med henblik på at oprette lister over gener, der yder det største bidrag til de tilsvarende berigning scorer (ES) opnået for enten C12 im, C12 det, C13 im, og C13 det klasseskel. bestemtes 0,05 efter 1.000 tilfældige permutationer, En konservativ tærskel af False Detection Rate (FDR) 0,05 og p-værdi 0,005 blev valgt efter Bonferroni korrektion for multiple sammenligninger

Restriktive analysekriterier

1) Gener, som ikke følger den 2 gange tærskel i hver af de tre uafhængige. genekspression arrays blev udeladt (meget restriktive kriterier). 2) I GSEA, konservative nominel p-værdi 0,05 (NOM p) og FDR q-værdi 0,05 blev valgt 3) LEA blev anvendt. 4) I GO berigelse analyse, cutoff af p-værdi. blev 0,005 valgt

Pathway-Fokuseret Arrays

Den menneskelige Wnt, Sonic Hedgehog, og Notch signalvejen RT

2 Profiler PCR arrays (SuperArray Bioscience, Frederick, USA) blev anvendt ifølge producentens instruktioner med 1 ug af RNA som udgangsmateriale i hver opstilling. Analyse af dataene blev udført med SABiosciences webbaseret PCR Array Data Analysis software (https://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php) og opfindsomhed Pathway Analysis (IPA) software (Ingenuity Systems, Redwood City, CA).

RNA ekstraktion fra laser mikro-dissekeret tumorprøver, og fra

i

vitro

voksende celler, QRT-PCR-analyser og Bisulfite sekventering er beskrevet i Materialer og metoder S1. Genes specifikke primere anvendt til QRT-PCR og bisulfit analyser findes i tabel S2 og S3.

Resultater

Expression profiler af OCCC-afledte heterogene kræftceller

in vitro

in vivo

Vi har for nylig rapporteret den observation, at konsekvent heterogenitet i tumorigene egenskaber blandt seks forskellige OCCC-afledte CCSPs var mest slående udtryk i deres niche-afhængige

in vivo

tumorigene kapacitet og tumor cellulære fænotyper [36], og at hESC-afledte niche understøtter yderligere selvfornyende CSC og udsætter deres fulde repertoire af tumorigene fænotyper [5]. For at kaste lys over tumor mikromiljø bidrag til denne heterogenitet, vi fokuseret på genekspression microarray-analyser til at karakterisere genekspressionsprofilerne af to forskellige kræft celle subpopulationer, CCSP C12 og C13, der vokser med succes i både xenotransplantation og embryonale-baserede teratoma modeller, og som udviser ekstreme tumorgene fænotypiske egenskaber og niche-afhængig selvfornyelse kapacitet [5,36]. C12-afledte tumorer er kendetegnet ved en overflod af meget differentierede æggestokkene strukturer, mens C13-afledte tumorer udviser dårlig æggestokkene strukturel differentiering [36]. Desuden C13 bevarer sin evne til selvfornyelse som påvist af

in vivo

fortsættelse af tumorgene cancerceller både i murine og embryonale-afledte cellevæv mens C12 undlader at forevige tumorigene celler i murine væv, men genererer meget aggressive og invasive tumorer i embryonale-afledte cellevæv [5]. I lyset af denne slående effekt, vi havde til formål at afgrænse genekspression profil CCSP C12 og C13 afledte tumorer som en afspejling af samspillet mellem tumorceller og tumor mikromiljø. RNA-prøver blev ekstraheret fra C12 og C13 dyrket i cellekultur, og fra tumorer genererede i.m. og i.t (hver prøve i tre eksemplarer) og hybridiseret på hele genomet udtryk arrays (se Materialer og fremgangsmåder). Skematisk fremstilling af analysen procedure er beskrevet i figur 1. Opstillingen analyser blev udført på følgende niveauer: C12 versus C13

in vitro

dyrkes celler, C12 versus C13 im tumorer og C12 versus C13 det tumorer (Figur 1A , B). Principal komponent analyse (PCA) for dataene opnået blev udført for at vurdere den relative hierarkiske bidrag til forskelle i genekspression mellem prøverne (figur 2A). Tydelig gruppering af C12

in vitro

dyrkede prøver celler og C13

in vitro

dyrket celler prøver blev observeret, men en oplagt forhold er påvist mellem C12 im og det prøver og mellem C13 im og det prøver, der angiver signifikante forskelle i genekspression profiler mellem CCSPs C12 og C13. Hierarkisk klyngeanalyse (HCA) af hver prøve i tre eksemplarer yderligere bekræfter disse resultater (figur 2B). Differentielt udtrykte gener (DEG) mellem C12 og C13

in vitro

dyrkede celler og mellem tumorer genereret im, og det blev identificeret baseret på fold ændring ( 2) og tilsvarende statistisk signifikante p-værdier ( 0,05) . Overlapning af DEG på tværs af alle de undersøgte prøver afslørede 47 overlappende gener, der var signifikant ændret (figur 1A), som omfatter de centrale forskelle mellem C12 og C13 kræft celle subpopulationer, hvoraf, 26 og 21 gener viste forhøjede udtryk i C12 og i C13 henholdsvis (tabel 1 og 2).

En

, Workflow af de udførte for genekspression profilering af kræft celle subpopulationer (CCSPs) analyser C12 og C13

i

vitro

i

vivo

.

B

, Identifikation af differentielt udtrykte gener mellem C12 og C13

i

vitro

dyrkede celler og mellem tumorer genereret intramuskulær (im) og intrateratoma (det), og Gene ontologi anmærkninger, som korrelerer med tumorer genereret im og det

En

, The PCA Resultaterne leveres som todimensionale fremstillinger baseret på bidrag scoringer for de to første komponenter. Forskelsbehandling af kræft celle subpopulationer (CCSPs) C12 og C13 prøver vises som angivet i farve fange.

B

, hierarkisk klyngedannelse af prøverne ved hjælp af alle 48,803 probe elementer på Illumina perle chip demonstrerede variabilitet mellem CCSPs C12 og C13 prøver.

Forhøjede i CCSP C12

C12 vs C13-celler

C12 vs C13 im

C12 vs C13 det

Illumina probe_ID

Gene Symbol

Gene Name

fold ændring

p-værdi

fold forandring

p-værdi

fold ændring

p-værdi

ILMN_1677814ABCC3ATP-bindende kassette, sub-familie C (CFTR /MRP), medlem 310.030.00212.40010.400.003ILMN_2081070BTCbetacellulin6.380.0012.7103.290ILMN_1677108CAPN13calpain 135.800.01211.070.0015.930.005ILMN_1777190CFDcomplement faktor D (adipsin) 4.370.0013.6803.140.001ILMN_1656560DKFZP564O0823prostate androgen-reguleret mucin-lignende protein 15.2503.780.0013.830.004ILMN_1815673DKK3dickkopf WNT signaleringsvej inhibitor 32.630.0256.380.0036.270.004ILMN_2398159DKK3dickkopf WNT signalvejen inhibitor 33.210.0098.700.0018.490.001ILMN_1729455EML1echinoderm mikrotubulus-associeret protein ligesom 13,150. 0105.680.0035.680ILMN_1743445FAM107Aamily med sekvens lighed 107, medlem A29.680.00917.21016.300ILMN_1715748FLNCfilamin C, gamma10.7003.750.0064.380.001ILMN_1799744GALCgalactosylceramidase9.140.00112.380.00113.480ILMN_1726666GPX3glutathione peroxidase 3 (plasma) 169.140409.810368.950ILMN_1696183HBQ1hemoglobin, theta 17.6802.9903.020ILMN_2217329IAH1isoamyl acetat-hydrolyserende esterase 1-homolog (S. cerevisiae) 13.4309.4506.930ILMN_1673521KISS1RKISS1 receptor5.6204.1403.970ILMN_1662358MX1myxovirus (influenza virus) modstand 1, interferon-inducerbart protein p78 (mus) 17.36039.970.00127.660ILMN_1709814NMRAL1NmrA-lignende familie domæne, der indeholder 18.7409.41010.100ILMN_1680339PDGFRLplatelet-vækstfaktorreceptor-like2.950.0035.200.0015.310.001ILMN_1792506PLA1Aphospholipase A1 medlem A4.8402.4902.840.003ILMN_1736533RND2Rho familien GTPase 26.800.0017.360.0016.500.002ILMN_1726928TCEA3transcription elongeringsfaktor A (SII ), 312.4903.970.0015.620ILMN_1760245TMEM42transmembrane protein 426.780.0015.260.0015.190ILMN_1713990TRIP6thyroid hormon receptor interactor 63.370.0016.210.0015.120.004ILMN_1670377ZNF20zinc finger protein 203.950.0016.4905.680ILMN_1798533ZNF22zinc finger protein 227.7206.7206.570ILMN_2117904ZNF22zinc finger protein 227.6906.5107.660ILMN_1728710ZNF816Azinc finger protein 8166.510.0017.040.0017.220 ILMN_1802053ZNF91zinc finger protein 914.180.0063.9003.770.001Table 1. differentielt udtrykte gener mellem kræftcellen subpopulationer (CCSPs) C12 og C13

i

vitro

dyrkede celler og mellem tumorer genereret intramuskulær (im) og intrateratoma (det).

Værdier af nul (0) = mindre end 0,001 CSV Hent CSV Forhøjede i CCSP C13

C13 vs C12 celler

C13 vs C12 im

C13 vs C12 det

NAME

Gene Symbol

Gene Name

fold forandring

p-værdi

fold forandring

p-værdi

fold forandring

p-værdi

ILMN_1802167ALDH1L1aldehyde dehydrogenase en familie, medlem L15.1103.870.0016.570.001ILMN_1805410C15orf48chromosome 15 åben læseramme 488.380.0073.060.0092.830.002ILMN_1774287CFBcomplement faktor B4.450.0013.500.0015.350ILMN_1810942CYP3A5cytochrome P450, familie 3, underfamilie A, polypeptid 54.870.0115.760.0179.230.007ILMN_1725597FXYD4FXYD domæne indeholdende ion transport regulator 44,570. 0056.080.0056.800.004ILMN_1660973GAD1glutamate decarboxylase 15.440.0012.520.0022.550.001ILMN_1712082GCNT3glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type5.900.0093.6504.190.002ILMN_1739813HYAL1hyaluronoglucosaminidase 14.030.00815.84014.140ILMN_2314417HYAL1hyaluronoglucosaminidase 12.430.0046.050.0025.650.001ILMN_1778010IL32interleukin 322.870.0096.450.0015.180ILMN_1705814KRT80keratin 803.990.0153.840 .0023.570ILMN_1692223LCN2lipocalin 220.320.0052.500.0023.820.006ILMN_1814270LY6Dlymphocyte antigen 6 kompleks, locus D10.2909.520.00212.990ILMN_1802780M160CD163 molekyle-lignende 13.290.0015.320.0044.830.001ILMN_1651568MUC13mucin 13, celleoverfladen associated4.570.0053.980.0027.130ILMN_1709809NHP2L1NHP2 ikke-histon kromosom protein 2-lignende 1 (S. cerevisiae) 11.1407.9505.260.001ILMN_1773389PLTPphospholipid overførsel protein6.3803.280.0034.610.006ILMN_1713829PTGESprostaglandin E synthase5.9108.5309.180ILMN_1651429SELMselenoprotein M2.530.0013.510.0023.800.001ILMN_1683670SLC10A2solute luftfartsselskab familie 10 (natrium /galdesyre cotransporter), medlem 25.650.00115.1105.140.006ILMN_1739001TACSTD2tumor-associeret calcium signal transducer 276.1505.310.0125.460.004ILMN_1725387TMEM200Atransmembrane protein 200A4.540.0047.310.0047.950.003Table 2. differentielt udtrykte gener mellem kræftcellen subpopulationer (CCSPs) C13 og C12

i

vitro

dyrkede celler og mellem tumorer genereret intramuskulær (im) og intrateratoma (det)

Værdier på nul (0) = mindre end 0,001 CSV Hent CSV

mikromiljø -. afhængig tumor genekspression profil

for at undersøge genekspression profil af CCSP C12 og C13 – afledte tumorer som en afspejling af samspillet mellem tumorceller og tumor mikromiljø (figur 1B), vi anvendte sæt berigelse gen analyse (GSEA) [39] for at vurdere, om forskellige gen-apparater var statistisk signifikante. Til dette formål brugte vi i alt 3279 gen-sæt, som er offentliggjort i Molecular signaturer Database over GSEA officielle hjemmeside (https://broadinstitute.org/gsea). GSEA detekterer berigelse af hele sæt af funktionelt beslægtede grupper af gener ved at sammenligne udtryk data med udvalgte gensæt fra tilgængelige gensæt databaser. De gen-sæt med nominel p-værdi 0,05 (NOM p) og FDR q-værdi 0,05 blev brugt til at minimere identifikation af falske positiver i GSEA analysen. Af de 3279 gensæt, som blev testet i C12 i.m. versus i.t sammenligning blev 401 gensæt beriget med C12 i.t, og 43 gensæt beriget med C12 i.m. Endvidere i C13 i.m. versus i.t sammenligning blev 120 sæt beriget med C13 i.t klasse, og 43 gensæt blev korreleret med C13 i.m. klasse (tabel 3). Ved fortolkningen denne store mængde data effektivt, brugte vi LEA redskab for GSEA software, udtrække de centrale gen medlemmer af de berigede gen sæt, der bidrager mest til de tilsvarende ES værdier. Ved at der alene tages hensyn forkant gener, genereret vi 4 gen lister, der repræsenterer de væsentligste delmængder for C12 i.m., C12 i.t, C13 i.m. og C13 i.t. Figur 3 viser de 100 mest differentielt udtrykte gener klassificeret efter GSEA for C12 og C13

in vitro

dyrkede celler (figur 3A) og for C12 i.m. og i.t (figur 3B) og C13 i.m. og i.t. (Figur 3C).

Berigede gen sæt

Gene Set Name Ver.2.5

Gene Set Størrelse

ES

NES

NOM p

FDR q

C12 i.m. DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.755-2.27700GNF2_IGF125-0.667-2.18200.002GNF2_LYN26-0.630-2.15000.003MODULE_345114-0.495-2.22300.003MODULE_436124-0.449-2.08200.006MODULE_7121-0.633-2.01400.01IFN_BETA_UP65-0.477-1.96700.011MODULE_171128-0.428-1.97900.014PROTEASOME17-0.588-1.7620.0060.045ANDROGEN_AND_ESTROGEN_METABOLISM23-0.552-1.7910.010.038 C12 i.tHSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.7942.65200HSA01430_CELL_COMMUNICATION1350.7082.51600DNA_REPLICATION_REACTOME440.6912.10400.002CANCER_UNDIFFERENTIATED_META_UP680.6412.08300.003HSA04350_TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY880.5721.94500.012CELL_ADHESION1710.5181.86700.022HSA04310_WNT_SIGNALING_PATHWAY1470.5151.82700.03CELL_CYCLE770.5651.8520.0010.024HSA05217_BASAL_CELL_CARCINOMA550.6171.9400.0010.013SRC_ONCOGENIC_SIGNATURE580.5621.7530.0060.044 C13 i.m. BECKER_TAMOXIFEN_RESISTANT_UP38-0.487-3.12600DSRNA_UP36-0.436-2.13200CMV_8HRS_UP32-0.451-2.08800MODULE_35528-0.416-2.10900DAC_IFN_BLADDER_UP17-0.535-2.21300.001HPV31_DN48-0.379-2.16700.002CMV_24HRS_UP72-0.263-1.26100.007NF90_UP24-0.487-1.92600.008RIBAVIRIN_RSV_UP22-0.409-1.79800.016ET743_RESIST_UP17-0.385-1.68900.036C13 det HSA01032_GLYCAN_STRUCTURES_DEGRADATION300.5931.59000.002MYC_ONCOGENIC_SIGNATURE1900.4941.52100.006RAS_ONCOGENIC_SIGNATURE2490.4491.39600.029HSA04910_INSULIN_SIGNALING_PATHWAY1350.4541.3860.0010.032HSA04012_ERBB_SIGNALING_PATHWAY870.4851.4330.0020.019HSA04370_VEGF_SIGNALING_PATHWAY700.4821.4150.0040.023HSA04150_MTOR_SIGNALING_PATHWAY480.5201.4770.0050.011HSA04512_ECM_RECEPTOR_INTERACTION850.4541.3350.0120.052HSA04330_NOTCH_SIGNALING_PATHWAY460.4881.3810.020.033HSA00100_BIOSYNTHESIS_OF_STEROIDS240.5421.4180.0310.022Table 3. Repræsentant beriget gen sæt til CCSPs C12 og C13-afledte tumorer genereret intramuskulær (im) og intrateratoma (det).

Værdier på nul (0) = mindre end 0.001MSigDB Ver.2.5ES = Berigelse Score NES = Normalized Enrichment Score FDR = False Discovery Rate CSV Hent CSV

De 100 mest differentielt udtrykte gener mellem kræftcellen subpopulationer (CCSPs) C12 og C13

i

vitro

dyrkede celler (

A

), CCSP C12-afledte tumorer genererede intramuskulær (im) og intrateratoma (den) (

B

) og CCSP C13-afledte tumorer genereret im og det (

C

). Den differentielle ekspression af gener blev beregnet efter signal-til-støj-metrics. De 50 bedste symboler repræsenterer gener, der blev forhøjet i tumorer udviklede i.t. De næste 50 symboler repræsenterer gener, forhøjet i tumorer udviklet i.m. Gener, som er placeret højere i hver af de to 50-gen-grupper indikerer en større forskel niveau end gener lokaliseret ved lavere positioner. Expression værdier er repræsenteret som vist i farven billedtekst.

Gene Ontology (GO) berigelse analyse

De resulterende gen lister blev udsat for GO berigelse analyse [40], ved hjælp af Gorilla webbaseret software. Indgangen til denne analyse bestod af lister over forkant gener og en baggrund liste, som repræsenterer alle de testede i Illumina genekspression platform gener. Med en konservativ kriterium Bonferroni justeres p-værdi 0,005, vi opnåede to lister med beriget GO termer pr CCSP, der repræsenterer dens interaktion med de to forskellige mikromiljøer. Vigtigt er, i den murine niche, blev kun et begrænset antal forskelle mellem de to CCSPs fundet (figur 4A, C). 10 og 7 GO vilkår blev beriget i CCSP C12 og C13 hhv. Alle de 7 GO vilkår, der blev beriget med CCSP C13 i.m. blev også beriget med CCSP C12 i.m. med lignende berigelse scorer (ES) værdier. Alle sådanne udpegede GO vilkår er relateret til immunresponset systemet og er involveret i “celle respons på en stimulus produceres af en levende organisme”. Den berigelse af disse GO vilkår viser en ændring i tilstand eller aktivitet CCPSs som følge af interaktion med det heterologe ydre miljø som ville forventes. På den anden side, i embryonale-afledte mikromiljø blev observeret langt større forskelle mellem de to CCSPs (figur 4B, D). CCSP C12 udviste berigelse af multiple GO udtryk vedrørende cellecyklus, hvilket kan afspejle virkningen af ​​hESC-afledte mikromiljø som en mere støttende niche i modsætning til det murine mikromiljø. Desuden GO udtryk relateret til processen med epitelial til mesenkymale overgang (EMT) blev også beriget med C12 afledte tumorer i embryonale-afledte mikromiljø. I forhold til C12, CCSP C13 afledte tumorer i embryonale-afledte mikromiljø udviser kun få, lav ES værdi beriget GO vilkår, for det meste forbundet med metaboliske processer. Listerne over berigede GO vilkår i C12 og C13 – afledte tumorer genereret i.m. og i.t er præsenteret i tabel S1.

Statistisk signifikante GSEA gen sæt blev udsat for forkant analyse (LEA) og de resulterende gener blev grupperet i ontologiske anmærkninger biologiske proceskategorier. De cirkeldiagrammer præsentere de berigede GO anmærkninger og deres matchende berigelse scores (ES) til:

En

, GO anmærkninger opreguleret i C12 tumorer genereret i.m. sammenlignet med C12 tumorer genereret i.t.

B

, GO anmærkninger opreguleret i C12 tumorer genereret i.t sammenlignet med C12-tumorer genereret i.m. (de 20 GO anmærkninger med den højeste berigelse scores vist).

C

, GO anmærkninger op reguleret i C13 tumorer genereret i.m. sammenlignet med C13 tumorer genereret i.t.

D

, GO anmærkninger opreguleret i C13 tumorer genererede det sammenlignet med C13 tumorer genereret im

Tilsammen denne analyse viser de forskellige veje for interaktioner mellem CCSPs C12 og C13 med mikromiljø under processen for tumorprogression. I modsætning til den konventionelle murin model, den embryonale-baserede model demonstrerer en mere kompleks cancercelle-mikromiljø interaktion, som kan give en mere autentisk afspejling af korrespondent forholdet mellem tumorceller af en patient og de komplekse humane væv, der omgiver tumoren.