PLoS ONE: Deregulering af MIR-34b /Sox2 forudser Prostata Cancer Progression

Abstrakt

De fleste mænd diagnosticeret med prostatakræft vil have en indolent og helbredes sygdom, mens ca. 15% af disse patienter hurtigt vil udvikle sig til en kastrat-resistente og metastatisk stadie med høj sygelighed og dødelighed. Derfor er identifikationen af ​​molekylære signatur (er), der registrerer mænd i risiko for forløber sygdom er fortsat et presserende og stadig uopfyldt behov for disse patienter. Her anvendte vi en integreret opdagelse platform kombinerer prostatacancercellelinjer en transgen Adenokarcinom i Mouse Prostate (TRAMP) model og klinisk-kommenterede humane vævsprøver at identificere tab af ekspression af microRNA-34b som konsekvent associeret med prostatacancer tilbagefald. Mekanistisk, var dette forbundet med epigenetik silencing af MIR34B /C locus og øget DNA kopital tab, selektivt i androgen-afhængig prostatacancer. Til gengæld, tab af miR-34b resulterede i downstream deregulering og overekspression af “stemness” markør, Sox2. Disse resultater identificere tab af miR-34b som en robust biomarkør for prostatakræft progression i androgen-følsomme tumorer, og forventer en potentiel rolle stamfader /stamcelle signalering i denne fase af sygdom

Henvisning:. Forno I, Ferrero S, Russo MV, Gazzano G, Giangiobbe S, Montanari E, et al. (2015) Deregulering af MIR-34b /Sox2 forudser Prostata Cancer Progression. PLoS ONE 10 (6): e0130060. doi: 10,1371 /journal.pone.0130060

Academic Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: Februar 16, 2015; Accepteret: 15. maj 2015; Udgivet: 24 JUN 2015

Copyright: © 2015 Forno et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er indeholdt i papir og i Støtte Information filer. Desuden har TLDA array-rådata medtaget i de understøttende oplysninger

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Fondazione Cariplo med award n. 2010-0846 (til SB) (https://www.fondazionecariplo.it/it/index.html), og National Institutes of Health giver CA140043 (til LRL og DCA) og CA190027 (til DCA) (http: //tilskud .nih.gov /tilskud /oer.htm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret visceral malignitet blandt mænd over hele verden. I USA, PCa tegner sig for 26% af de samlede sager nye kræft og 9% af de samlede kræftrelaterede dødsfald, ranking sekunder til lungekræft. Sandsynligheden for at udvikle prostatacancer fra fødsel til død er 1 i 7, med den højeste forekomst hos mænd over 70 år [1]. Selv om de fleste mænd diagnosticeret med prostatacancer vil have en indolent og hærdelig klinisk forløb, vil cirka 15% af disse patienter har en hurtigt frem, behandlingsresistente og metastatisk sygdom til knogler og indre organer med høj morbiditet og mortalitet [2]. Da ingen pålidelige middel til at identificere patienter med risiko for metastatisk spredning er i øjeblikket tilgængelige [3], at søgningen efter molekylær signatur (er) for sygdomsprogression, især overgang kastrere-resistens [4] er et presserende og stadig i vid udstrækning udækket medicinsk behov i styre en prostatakræft diagnose.

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodning, endogene RNA med pleiotropiske funktioner i genekspression [5,6]. Denne vej er dramatisk udnyttes i cancer, og en række miRNA har været forbundet med deregulerede onkogene eller tumor- suppressor pathways [7,8]. Omvendt, førere af malignitet, herunder DNA-aberration, transkriptionel deregulering og epigenetik lyddæmpning bidrager til afvigende miRNA udtryk [9,10]. For deres stabilitet i biologiske væsker [11], og hvor relativt let påvisning i kliniske prøver [12], miRNA er blevet forfulgt som tumor biomarkører [8], for deres potentielle prædiktiv eller prognostisk værdi i patienter med brystkræft [13], lever [ ,,,0],14,15], eller lunge [16] cancer. Dereguleret miRNA udtryk er også blevet observeret i prostatakræft, i forhold til normale epitel [17-19], og i nogle tilfælde forbundet med metastatisk spredning [20-22], men endelig undertegnelse (r) af sygdomsprogression, især kastrere-modstand, er ikke blevet identificeret.

i denne undersøgelse brugte vi en integreret opdagelse platform kombinerer etablerede cellelinjer, en genetisk musemodel for sygdomsprogression, og delprøver patient for at profilere differentieret miRNA udtryk i prostatakræft.

Materialer og metoder

kliniske prøver

De kliniske og patologiske parametre for PCA patienter eller benign prostatahyperplasi (BPH) undersøgt i disse undersøgelser er beskrevet i tabel 1. Globalt vi hentede arkivering væv og kliniske optegnelser fra 192 patienter, som gennemgik kirurgi 2004-2006 på San Paolo Hospital eller Fondazione IRCCS Ca ‘Granda Hospitaler i Milano (Italien), under en protokol godkendt af Institutional Review Boards (IRB) i San Paolo Hospital (kode 10664 ) og Fondazione IRCCS Ca ‘Granda-Ospedale Maggiore Policlinico (kode 1381-1311). På grund af den tilbagevirkende kraft af denne undersøgelse og anvendelse af data anonymisering praksis, blev behovet for skriftligt informeret samtykke fraviges. Opfølgning bestod i aktiv overvågning af patienterne ved fortløbende måling af serum prostata-specifikke antigen (PSA) niveauer. For PCA patienter blev biokemisk tilbagefald defineret som to på hinanden følgende PSA niveauer større end 0,2 ng /ml

For molekylær analyser tilfælde skal havde tilfredsstillende RNA indhold (260/280 Absorbansforhold . 1.2 og 2,1 og 500 ng af total RNA) i mindst et matchet normal og tumor prostata prøve pr patient. Sixty-seks patienter ud af de 192 vurderede tilfreds disse kriterier og for halvtreds af disse også prostata intraepitelialneoplasi (PIN) læsion var til rådighed. Derfor sorteres vi patienter i en første delmængde med fuldstændig tilgængelighed af normale, PIN og PCA væv (n = 50, serie A, tabel 1), og i en anden delmængde består af de øvrige patienter med kun matchede normale og tumorprøver (n = 16, serie B, tabel 1). Epitelvæv til normal prostata, blev PIN og PCa separat hentes ved stansning arkivers blokke med en nål diameter 1 mm som beskrevet [23]. Hver prøve konsekvent overskrides 80% renhed i epitelial celleindhold. Normalt væv prøveudtagning blev udført ved en afstand på mindst 2 cm fra neoplastisk væv. Det komplette sæt af patienter i dette studie (n = 192, serie C, tabel 1). Blev brugt til at bygge seksten væv mikro arrays (TMA) blokke [24] for immunhistokemiske evalueringer

BPH prøver (n = 10) var patienter, som gennemgik transuretral resektion af prostata (TURP) ved Fondazione IRCSS Ca ‘Granda Hospital (Milano), for hvem prostata kortlægning var negativ for PCa og fulgt op i mindst 3 år (serie BPH; tabel 1). Denne serie blev ikke medtaget i TMA-platformen og fuld vævssnit blev brugt til enten molekylære eller immunhistokemiske analyser.

Cellelinjer

Humane prostata cellelinjer RWPE-1, BPH-1, LNCaP, DU145 og PC3-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den normale cellelinie RWPE-1 blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium suppleret med 5 ng /ml EGF, 0,05 mg /ml oksehypofyseekstrakt, og 1% Pen-Strep antibiotika cocktail. Alle andre cellelinjer blev dyrket i RPMI suppleret med 10% FBS og 1% Pen-Strep. Cellekulturer blev holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. For miRNA transfektion blev cellerne podet ved en 5×10

5 pr brønd i seks-brønds plader, og transficeret med 150 pmol MIR-34b-inhibitor (a-MIR-34b, HSTUD0511), eller MIR-34b precursor (p- miR34b, HMI0511), eller tilsvarende ikke-targeting sekvenser (a-Ctrl eller p-Ctrl henholdsvis HMC0002 og NCSTUD001) i nærvær af Lipofectamine 2000 (Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA), som beskrevet [25]. Alle miRNA molekyler var fra Sigma Aldrich, Milano, Italien.

Laser-assisteret mikrodissektion af prostata læsioner fra transgene Adenokarcinom i Mouse Prostata (TRAMP) mus

Archival væv blokke af urogenitale tarmkanalen, herunder blære, sædblærer og prostata fra fem TRAMP mus blev anvendt [26,27]. Alle mus havde udviklet prostatatumorer og blev aflivet efter 24 ugers alderen. Alle dyreforsøg er blevet revideret og godkendt af en Institutional Animal Care og brug Udvalg på Thomas Jefferson University. Ubehag og skade dyr er blevet begrænset til det, som er uundgåelig i udførelsen af ​​videnskabeligt værdifuld forskning. Alle eksperimentelle procedurer, der gennemføres som led i denne undersøgelse er i overensstemmelse med godkendte protokoller for at sikre de højeste standarder i human pleje til dyrene. Analgetika, anæstetika og beroligende lægemidler er blevet anvendt som bestemt ved veterinærpersonalet. Eutanasi er udført af CO

2 anæstesi. Denne metode er i overensstemmelse med anbefalingerne fra 1316 Panel af Eutanasi af American Veterinary Medical Association

Prostata prøver fra TRAMP mus blev beriget med PIN eller prostatatumorer (S1 Fig) ved laser-assisteret mikrodissektion (LMD.; Leica Microsystems, Milano, Italien) af epitelial læsioner, som beskrevet [28]. For miRNA profilering, PCa eller PIN væv fra forskellige dyr (n = 5 pr gruppe) blev samlet.

RNA rensning, retrotransskription og microRNA profilering

Samlet RNA blev isoleret ved hjælp af MasterPure RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA), som beskrevet [28], og retrotranskriberet under anvendelse af Megaplex RT-primere Humane eller Rodent pools A og B v3.0 og Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit. Murine prøver blev præ-amplificeret under anvendelse Megaplex PreaAmp primer Gnavere pools A og B. humane eller gnaver TaqMan low-density arrays (TLDA) blev derefter udført for miRNA profilering i prostata cancer cellelinjer eller TRAMP prostatavæv henholdsvis. Menneskelig TLDA omfatter 754 miRNA og 4 endogene nucleolar RNA (RNU44, RNU48 og U6snRNA), mens Rodent TLDA omfatter 750 miRNA og 6 kontrol RNA’er, hvoraf 675 miRNA og tre endogene kontroller (snoRNA135, snoRNA202 og U6snRNA) er specifikke for mus. Både menneskelige og gnaver platform omfatter en negativ kontrol sonde (ATH-miR-159a) per kort. For validering, atten udvalgte miRNA plus reference- udskrifter (U6snRNA, RNU48, RNU44, og RNU24) og to negative kontroller (ATH-miR-159a og en brønd uden afsløring probe) blev analyseret i humane prøver (serie A, B og BPH; Table 1) ved hjælp af en brugerdefineret RT og preamp primere puljer sammen med en brugerdefineret TLDA platform med præ-plettede primere og Taqman sonder. Alle reagenser, kits og instrumentering, der anvendes til miRNA profilering var fra Life Technologies Inc. (nu en del af Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA).

Methylering analyse af MIR34B /C CpG ø

genomisk DNA blev oprenset fra 4 prostata cellelinier (RWPE-1, BPH-1, LNCaP, DU145), 16 PCa og 12 normale prostatavæv (blandt serie B), og fra 10 BPH (serie BPH) prøver under anvendelse af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Waltham, MA, USA). Natriumbisulfit omdannelse af DNA (400 ng) blev udført under anvendelse af EZ DNA-methylering-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). Methyleringsspecifik polymerasekædereaktion (MSP) af et CpG island opstrøms for MIR34B /C-locus blev udført som beskrevet [29], under anvendelse af følgende primere til detektion af umethyleret (UM) eller methyleret (M) region: UM-forward 5 ‘ – TGTTTTTTGGTGAAATGGGGTTTGAGGT-3 ‘UM-reverse 5’CCTACAAACCAAACACCAAACACCCACA3 «; M-forward 5’CGGTGAAATGGGGTTCGAGGC-3 ‘M-reverse 5′-CCGAACACCGAACACCCGCG-3’. Den termiske profil var 95 ° i 10 min efterfulgt af 95 ° C i 1 min, 65 ° C i 1 min og 72 ° C i 1 min i 45 cykler og derefter 72 ° C i 7 min.

kopital variation (CNV) analyse

Genomiske variationer af 11q23.1b klynge og tilstødende loci blev analyseret ved TaqMan kopiantal assay i forhold til reference-genet RNase P, som beskrevet [30]. De assay identifikationsnumre var som følger: Hs00608392_cn (CNV # 1; præcis placering 111.383.042), Hs03049129_cn (CNV # 2 præcis placering 111.368.721) og Hs06336326_cn (CNV # 3; præcis placering 81.902.545). Variationer i DNA-kopital blev kvantificeret ved anvendelse af Copy Caller software. Alle assays, reagenser og software var fra Life Technologies Inc.

MIR-34b mål ekspressionsanalyse

hyperplastisk (BPH-1) eller tumor (LNCaP og DU145) prostata cellelinier blev transfekteret med miR -34b mimic /inhibitor eller kontrol i 72 timer, og total RNA blev oprenset som beskrevet ovenfor. Derefter blev DNA-fri total RNA revers transkriberet med tilfældige hexamerer og SOX2, CDKN1A, MET, c-myc, HES1 gener udtryk (TaqMan genekspression assays) blev relativt kvantificeret på en reference udskrift (beta-2-mikroglobulin) ved Real- Time PCR (qPCR). Alle reagenser og instrumenter var fra Life Technologies Inc. Target udtryk blev derefter beregnet ved hjælp af 2 ^

-ΔCt formel, median normaliseret og log2 forvandlet til zonekort generation hjælp dChip softare (DNA-Chip Analyzer, www.dchip.org) som beskrevet [9].

immunblotting

Celler blev høstet 72 timer efter transfektion af miRNA efterligner /inhibitor og solubiliseret i 100 pi lysisbuffer tilsat protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Schweiz) som beskrevet [25]. Prøver (50 ug) af hver cellelysat blev probet med 1 pg /ml af de følgende primære antistoffer mod c-Myc (klon D84C12; cellesignalering Technologies, Danvers, MA, USA), Sox2 (klon D6D9; cellesignalering Technologies), eller Notch1 (klon A-8; Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA). β-tubulin (Sigma-Aldrich) blev anvendt som en loading kontrol. Reaktive bånd blev visualiseret med ECL Plus (GE Healthcare, Milano, Italien).

Prostata Væv Microarrays (TMA) konstruktion og Immunhistokemi (IHC)

Fra hver af de 192 PCA patienter (serie C tabel 1), fire kerner af prostata tumor, en kerne af PIN og en kerne af normal parenchym hvis tilgængelig, blev anvendt til at bygge 22 TMA blokke, som beskrevet [24], med modifikationer [23]. FFPE væv fra patienter med BPH (serie BPH; Tabel 1) blev anvendt som fuldgyldige sektioner og blev ikke inkluderet i TMA. Fire um-tykke snit fra hver blok blev farvet med et antistof mod Sox2 (1: 100; Cell Signaling), med diaminobenzidin (DAB) som et chromogen. Immunhistokemi blev udført ved hjælp Benchmark Ultra Roche Ventana immunostainer (Roche Group, Tucson, AZ, USA). Alle objektglas blev modfarvet med hematoxylin. To patologer (GG og SF) blindet for kliniske data evalueres og scorede alle dias. Når uoverensstemmelser opstod, blev sagen yderligere revideret for at nå til enighed score. Kun reaktivitet for nuklear Sox2 i epitelceller og ikke i basal myoepithelial kammer blev registreret, og procentdelen af ​​immunoreaktive celler i PCA prøverne blev som gennemsnit blandt de fire kerner fra den samme patient. I tråd med tidligere rapport [31], blev Sox2 immunreaktivitet derefter kategoriseret i fire grupper og scoringer blev derefter tildelt som følger: score 0 (negativ nuklear farvning), 1 (1-10% af nukleart Sox2), 2 (11-50% nuklear Sox2), 3 (mere end 50% af nukleare Sox2).

Statistisk analyse

miRNA relative mængder (RQ) blev opnået importere rå TLDA datafiler i DataAssist software (Life Technologies Inc .) med en værdi på 35 som grænse for maksimalt tilladte Ct og global normalisering for target kvantificering. RQ-værdier blev derefter log2 transformeret og importeret i BRB ArrayTools (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) hvor Anova eller differential udtryk analyser blev udført som beskrevet [15]. Korrelationsparametrene mellem miRNA ekspression og klinisk-patologiske variabler blev udledt ved hjælp Wilcoxon Rank Sum, Friedman test eller chi-square test for kontinuerlig eller diskret variabel, henholdsvis anvendelse af GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) eller MedCalc ( Mariakerke, Belgien) statistisk pakke. Receiver opererer egenskaber (ROC) kurver metode blev anvendt til at teste nøjagtigheden af ​​miRNA korrekt skelne mellem godartet sygdom, PIN-kode eller prostatakræft, og for at identificere patienter, som havde PSA fiasko (PSA 0,2 ng /ml i mindst to på hinanden følgende gange) under opfølgningen, som beskrevet [15]. dChip software blev anvendt til uovervåget hierarkisk klyngedannelse.

In vitro Salg forsøg blev udført mindst tre gange, og data er udtrykt som middelværdi ± SD med mindre andet er angivet. En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

miRNA underskrifter af prostatakræft modeller

Vi begyndte denne undersøgelse ved at profilere ekspression af miRNA i et panel. af prostata cancer celletyper med forskellig tumorigent potentiale (S1 File) og TRAMP mus (S2-fil). I disse eksperimenter miRNA ekspression let differentieret androgen-ufølsom (DU145 og PC3) fra følsomme prostatacancer celletyper (figur 1A). Følgelig non-tumorigene RWPE-1 og BPH-1 cellelinjer (Fig 1A) grupperet separat fra mere aggressive, LNCaP-celler. Vi næste valgte miRNA baseret på to kriterier: en 20-fold forskel mellem androgen-følsomme eller-ufølsomme celletyper og ikke-tumorigen RWPE-1 eller tumorigen LNCaP (Fig 1B) (i), og en betydelig variation (p 0,05 ved Anova) i ekspression mellem normale, hyperplastiske, androgen-sensitive og-ufølsomme celler (fig 1C) (ii). Disse analyser identificeret 18 miRNA, og 16 af disse udskrifter havde mus ortologer (Fig 1D).

A) Heat-kort over de globale miRNA profiler (≈750 miRNA) i ikke-tumorgene (RWPE-1, Normal) , hyperplastiske (BPH-1), androgen-afhængige (LNCaP, AR

sens-PCA) eller-uafhængige (DU145 og PC3, AR

ins-PCA) prostata kræftceller. Rød, overekspression; blå, under-udtryk, hhv. B) Scatterplots diagrammer blev udført mellem androgenafhængige og-uafhængig PCA celler og mellem normale prostata celler og AR

sens PCA celler til at vælge miRNA med differentieret udtryk i begge retninger (fold-ændring) på mindst 20 folder. En liste med 41 miRNA samtidigt ændret i begge sammenligninger blev genereret. C) Skematisk diagram af udvælgelseskriterier, der er vedtaget for at identificere miRNA potentielt relateret til PSA. D) De atten miRNA signaturer identificeret i C blev verificeret ved qPCR i de angivne prostata celler. Alle miRNA undtagen to (MIR-577 og MIR-886-3p) havde mus ortologer. Rød, hvid og blå farver i varmen-map repræsenterer højere, lig med eller lavere miRNA udtryk i prøver respekt til median miRNA værdi.

Vi næste udført globale miRNA profilering af LMD PIN eller tumor læsioner fra TRAMP mus (fig 2A), ved anvendelse af en 20-fold cutoff forskel i miRNA ekspression mellem de to prøver (fig 2B). En hundrede enogtyve miRNA opfyldte disse kriterier (Fig 2B og 2C), og 61 miRNA havde menneskelige ortologer (S1 tabel). I denne analyse blev kun fire miRNA udtrykkes forskelligt i både humane prostata cancer cellelinjer og tumorprøver fra TRAMP mus, herunder miR-34b-3p, miR-34c-5p, miR-138, og miR-224 (Fig 2C og 2D ). Derfor udtrykket profil af disse fire microRNA’er viste, at androgen-uafhængige DU145 eller PC3 celler blev mere tæt forbundet med TRAMP tumorer, end andre humane cellelinjer (Fig 2D).

A) Global miRNA profilering af prostatakræft (PCA) eller prostata intraepitelialneoplasi (PIN) læsioner isoleret fra TRAMP-mus. B) Scatterplot diagram af miRNA med differentieret ekspression af mindst 20 folder mellem PIN og PCA væv af TRAMP-mus. Af de identificerede 121 deregulerede miRNA (S1 tabel) 61 havde menneskelige ortologer. C, D) Sammenligning af betydelige miRNA signaturer mellem prostata-cellelinjer og TRAMP læsioner. Kun fire miRNA var i fælles mellem de to eksperimentelle systemer. Ekspressionsanalyse efterfulgt af ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse D) af MIR-224, -34b-3p, -138 og MIR-34c-5p afslører, at androgen-uafhængige prostatacancerceller er mere lig TRAMP væv end til androgen-afhængige eller ikke-tumorigene prostata humane celler.

LNCaP PCa model spejle miRNA deregulering i human prostata sygdom

Vi næste undersøgt miRNA identificeret ovenfor (n = 18) i en serie af 50 patienter (serie a ; tabel 1) med et spektrum af læsioner, herunder PCa, PIN og normal epitel. MIR-31, miR-34b-3p, miR-205, miR-224 og miR-452 udviste differential ekspressionsniveauer mellem normal, PIN og PCa matchede prøver (p 0,01 af Friedman test, Fig 3). Alle miRNA blev nedreguleret i PCa i forhold til normal epitel, der matcher de opnåede resultater med LNCaP, RWPE-1 eller BPH-1 celletyper (figur 1D).

Matchede normale prostata kirtler, prostata intraepitelialneoplasi (PIN ) og prostatacancer (PSA) læsioner er tilgængelige fra 50 patienter blev testet for ekspressionsniveauer af de atten udvalgte miRNA. MIR-31, 34b-3p, 205, 224 og miR-452 de viste væsentligt ændret niveauer mellem de tre væv klasser (p 0,01 af Friedman test). Barer, middelværdi ± SEM. RQ, relativ miRNA mængde

Vi næste fokuseret på disse fem miRNA, og undersøgt deres potentielle tilknytning til kliniske parametre for PCa progression, herunder biokemiske gentagelse (to på hinanden følgende PSA værdier . 0,2 ng /ml i løbet af opfølgning), Gleason score (GS ≤7

vs

GS 7), tumorstørrelse (T2

vs

T3-T4 PCA) og lymfeknuder metastaser. For yderligere validering, brugte vi en ekstra, uafhængig sæt af seksten patienter (serie B i tabel 1) en samlet antal på 66 analyserede PSA. I denne analyse reducerede miRNA niveauer korreleret med klinisk-patologisk progression af PCa (tabel 2), og differentieret udtryk for mir-31, miR-34b-3p og miR-452 kunne væsentlig diskriminerer patienter i henhold til biokemisk tilbagefald (Fig 4A). Dernæst spurgte vi om det samme sæt af fem miRNA kunne skelne mellem PIN og PCA læsioner, således svarer til forholdet mellem BPH-1 og LNCaP celler. Til disse eksperimenter, vi evaluerede ti patienter, som gennemgik TURP for BPH (serie BPH i tabel 1), og blev fulgt op i mindst 3 år på Fondazione IRCCS Ca ‘Granda Hospital. Både miR-31 og miR-34b-3p blev differentielt udtrykt mellem PIN eller PCA prøver og BPH (p 0,001 af Mann Whitney test, Fig 4B). Til forskel fra den observeret i cellelinier profil, miR-34b-3P-niveauer steg mere end ti-folder i BPH prøver sammenlignet med PIN eller PSA. Endelig ekspressionen af ​​miR-34b-3p præcist diskrimineret PIN eller PCA prøver fra BPH, ved ROC-analyse (p 0,0001, S2 Fig). MIR-205 ekspressionsniveauet var lavere i BPH sammenlignet med PIN (p = 0,0027, Fig 4B). Omvendt MIR-452 og MIR-224 blev ikke differentielt udtrykt mellem PCa og BPH eller mellem PIN og BPH, (fig 4B).

A) Receiver Operating karakteristik (ROC) kurver blev anvendt til at teste nøjagtigheden af miRNA til at identificere patienter, som havde PSA fejl under opfølgning. AUC; Areal under kurven; CI, konfidensinterval. B) MIR-31, 34b-3p, 205, 224 og MIR-452-ekspression blev bedømt ved qPCR i uparrede præcancerøse kirtler (PIN, n = 50), neoplastiske prostata læsioner (PCA, n = 66), eller godartet hyperplastisk væv (BPH, n = 10). **, P = 0,0027; ***, P 0,001, alle af Mann-Whitney test. Barer, middelværdi ± SEM. RQ, relativ miRNA mængde.

MIR-34b undertrykkelse er en biomarkør for PCa

MIR-34b og miR-34c er transskriberet fra den samme locus på kromosom 11 ( cytogenetisk band 11q23.1, fig 5A), og deres ekspression reguleres af epigenetik, såsom CpG ø metylering [29], og p53-funktion [32]. Derfor undersøgte vi BPH-patienter udviste en undergruppe af PCA prøver (tilfældigt udvalgt fra serien B; tabel 1), normal prostata prøver og ikke-tumorigene eller invasive prostata cellelinier for potentiel allelisk kopiantal variation, og status for methylering af CpG ø i MIR34B /C locus (fig 5B-5G).

A) Skematisk diagram af human MIR34B /C locus på kromosom 11q. B, C) MIR-34b-3p og MIR-34c-5p-ekspression i de angivne prøver af normal prostata (pulje af 10 prøver), godartet hyperplasi (BPH), prostatacancer (PSA) eller ikke-neoplastiske (RWPE-1) , hyperplastiske (BPH-1) eller tumor (LNCaP, DU145) prostata cellelinier. D, E) Copy antal genomiske DNA-områder proksimalt for MIR34B /C locus (CNV # 1; Hs00608392), eller til BTG4 genet (CNV # 2, Hs03049129) blev bedømt ved qPCR i de samme prøver som beskrevet i paneler B, C . Cutoff værdier for signifikant tab eller gevinst af mål DNA i forhold til en reference assay (RNase P) blev defineret som kopier 0,5 eller 4, henholdsvis (ingen ændring: CNV = 2). F, G) Analyse af MIR34B /C CpG ø epigenetisk status blev udført ved methylering specifik PCR i matchet normal eller neoplastisk (PCA) prostata parenkym, godartede hyperplastiske prøver og prostata-cellelinjer. En prøve blev betragtet delvist methyleret (M /UM) hvis amplificeret ved begge primerpar. M, denatureret; UM, Umethylerede. Blank, ingen skabelon kontrol; NA, prøve ikke tilgængelig.

I disse eksperimenter blev miR-34b-3p faldt i PCa, sammenlignet med normale eller hyperplastiske prostata prøver, BPH-1 eller LNCaP-celler (Fig 5B). I modsætning hertil MIR-34c-5p havde et andet mønster af ekspression i humane væv, hvilket antyder, at de to transkripter kan være uafhængigt reguleret (Fig 5C). Genomisk analyse viste, at kun regionen proksimalt for MIR34B /C locus (assay CNV # 1, Fig 5D) udviste tab af DNA kopital, da de fjernere prober (CNV # 2 og CNV # 3) viste ingen ændringer i genomisk indhold (fig 5E og S2 tabel). Tab af DNA kopital var signifikant mere udtalt i PCA væv, sammenlignet med benigne hyperplastiske kirtler (p = 0,01 ved Fisher exact test), og kunne ikke påvises i puljen af ​​normale kontroller (Fig 5D). Både CNV # 1 og # 2 blev tabt i BPH-1 og LNCaP-cellelinjer, potentielt afspejler samtidig nedregulering af MIR-34b /c. I modsætning hertil DU145 celler ikke udviser modulering af MIR-34b /C-ekspression, eller allele kopiantal tab (Fig 5D og 5E).

Når analyseret for epigenetisk status ved methylering-specifik PCR, CpG island opstrøms af MIR34B /C-locus (fig 5F) var signifikant mere methyleret i prostatacancer end normale eller hyperplastiske prostata prøver (50% versus 30% eller 0%, p = 0,026 ved chi-square test, fig 5G). kunne detekteres En delvis grad af methylering i alle cellelinjer, men BPH-1, hvori MIR34B /C-locus blev epigenetisk tavshed (Fig 5F og 5G). Sammen antyder disse data, at nedsat ekspression af miR-34b i PCa kan involvere en kombination af epigenetisk inaktivering og DNA-kopi nummer tab (S2 tabel).

En miR-34b-3p-SOX2 aksen selektivt dereguleret i androgenafhængig PCa

MIR-34b-3p regulerer ekspressionen af ​​stamcelle-relaterede faktorer, herunder c-Myc, Sox2, Met og Notch1 [33,34], der har også været impliceret i prostatacancer [ ,,,0],35-37]. I overensstemmelse med disse observationer, tvungen ekspression af MIR-34b precursor sekvenser i forskellige prostata-cellelinjer, men ikke antagonist (Panel A i S3 Fig), kraftigt undertrykt endogene Sox2 niveauer i BPH-1-celler (Fig 6a) ikke modulere ekspressionsniveauerne af c-Myc, Notch1 og Met (felt B, C i S3 fig). Omvendt oplyste androgen-uafhængige DU145 celler ikke udviser miR34b-modulering af Sox2 ekspression (Fig 6A), og LNCaP-celler havde ingen påviselige niveauer af Sox2 (S4 Fig). Endelig blev celledeling ikke signifikant påvirket under de forskellige testede (Panel D i S3 Fig) betingelser.

A) Sox2 udtryk blev analyseret ved immunoblotting i BPH-1 eller DU145 celler efter transfektion med miR-34b efterligner eller kontrolsekvens i 72 timer. Untr., Ubehandlede prøve. p-MIR-34b eller a-MIR-34b, precursor eller antagonist MIR-34b; p-Ctrl eller a-Ctrl, ikke-targeting styringer til precursor eller antagonistiske molekyler. B) Sox2 immunoreaktivitet blev analyseret i en prostata TMAs, som omfattede normale væv, præ-neoplastiske (PIN) og tumor (PCA) læsioner fra 192 patienter, og i benign prostatahyperplasi (BPH) prøver. Sox2 udtrykkes kraftigt i basalcellelaget fra ikke-neoplastiske væv og i epitelceller i cancervæv. C, D) Sox2 forhøjet udtryk karakteriserer PCA væv fra PIN eller BPH læsioner og skelner PCA patienter med biokemisk tilbagefald. Antallet af PIN-kode, PCa eller BPH sager (C) eller af PCA patienter, som gennemgik eller ej biokemisk tilbagefald under klinisk opfølgning (serologisk PSA 0,2; D) i henhold til nukleare Sox2 farvning scores er illustreret. p = 0,02 eller p = 0,0006, henholdsvis Chi-square test.

Når analyseret i humane væv (Fig 6B), Sox2 vises yderst heterogene niveauer af ekspression, især i PCA væv fra 0% til 70% af positive cellekerner (fig 1C). Omvendt PIN eller BPH læsioner udstillet høj Sox2 immunoreaktivitet i basale myoepitelcellerne (ikke scoret), mens deres epitel rum vises lavt Sox2 niveau (≤10%; Sox2 score = 1; Fig 1C). Som tidligere dokumenteret [31,36,38], immunoreaktivitet for Sox2 blev anatomisk begrænset til myoepithelial /basale celler i ikke-neoplastiske kirtler. Omvendt blev dette mønster gradvist tabt i PIN og PCA prøver. Faktisk Sox2 ekspression i mere end 10% af kernerne (Sox2 scores 2 og 3) var en egenskab ved PCa sammenlignet med PIN- eller BPH prøver (p = 0,02 ved Chi-square test). I tråd med dette resultat, var højere Sox2 scores oftere findes i PCA væv af patienter, som oplevede biokemisk tilbagefald (p = 0,0006 ved Chi-square test; Fig 6D). Faktisk de fleste Sox2-negative PCa (59 ud af 68, 87%) oplevede ikke biokemisk tilbagefald modsat PCa med Sox2 i mere end 10% af cellerne (1 ud af 6, 0,17%, Fig 6D)

Ingen andre kliniske variable undersøgt signifikant korreleret med Sox2 udtryk.

diskussion

i denne undersøgelse har vi vist, at tabet af miR-34b er forbundet med progression af prostatakræft, og kan præcist skelne mellem godartet hyperplasi og PIN læsioner eller infiltrere prostata adenocarcinom hos mennesker. Mekanistisk denne vej afspejler epigenetisk inaktivering og DNA kopital tab af MIR34B /C-locus på kromosom 11, hvilket resulterer i dereguleret ekspression af den nedstrøms stemness mål, Sox2 i PSA. Vigtigt er det, vises dereguleret miR-34b signalering til selektivt adskille med androgenafhængige prostataceller, hvilket tyder på en potentiel rolle for denne vej i sygdom tilbagefald og potentielt i overgangen til kastrere-resistente fase.

MIR-34 familie af miRNA er tidligere blevet rapporteret at undertrykke tumorigenese ved forskellige mekanismer, herunder modulering af cellecyklus overgange, EMT, metastase eller cancer stemness [33].