PLoS ONE: Resveratrol Forbedrer palmitat-induceret ER Stress og Apoptose i Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Palmitate, en mættet fedtsyre (FA), er kendt for at inducere toksicitet og celledød i forskellige typer af celler. Resveratrol (RSV) er i stand til at forhindre patogenese og /eller decelerere progressionen af en række sygdomme. Adskillige

in vitro

in vivo

undersøgelser har også vist en beskyttende effekt af RSV på fedtophobning fremkaldt af FA’er. Desuden har endoplasmatiske reticulum (ER) stress nylig blevet forbundet med cellulære adipogeniske responser. For at løse den hypotese, at RSV effekt på overdreven ophobning fedt fremmes ved forhøjede mættede FA’er kunne delvist medieres af en reduktion af ER stress, vi studerede RSV handling på eksperimentelt induceret ER stress ved hjælp palmitat i flere cancer cellelinjer.

hovedresultater Salg

Vi viser, at uventet RSV fremmer en amplifikation af palmitat toksicitet og celledød og at denne mekanisme skyldes sandsynligvis en forstyrrelse af palmitat akkumulering i triglycerid form og en mindre vigtig membranfluiditet variation. Derudover RSV falder radikale ilt arter (ROS) generation i palmitat-behandlede celler, men fører til øget X-box bindende protein-1 (XBP1) splejsning og C /EBP homologe protein (CHOP) udtryk. Disse molekylære virkninger har samtidig til caspase-3-spaltning, hvilket antyder, at RSV fremmer palmitat lipoapoptosis primært gennem en ER stress-afhængig mekanisme. Desuden lipotoxicity reversion induceret af eicosapentaensyre (EPA) eller ved en lever X receptor (LXR) agonist styrker den hypotese, at RSV-medieret hæmning af palmitat kanalisering i triglycerid puljer kunne være en nøglefaktor i forværring af palmitat-induceret cytotoksicitet.

konklusioner Salg

Vores resultater antyder, at RSV udøver sin cytotoksiske rolle i cancerceller udsat for en mættet FA sammenhæng primært ved triglycerid ophobning inhibering, sandsynligvis fører til et intracellulært palmitat akkumulering, der udløser et lipid-medieret celledød. Derudover er denne celledød fremmes af ER stress gennem en CHOP-medieret apoptotisk proces og kan udgøre en potentiel anticancer strategi

Henvisning:. Rojas C, Pan-Castillo B, Valls C, Pujadas G, Garcia-Vallvé S, Arola L, et al. (2014) Resveratrol Forbedrer palmitat-induceret ER Stress og apoptose i kræftceller. PLoS ONE 9 (12): e113929. doi: 10,1371 /journal.pone.0113929

Redaktør: Guillermo Velasco, Complutense University, Spanien

Modtaget: 14. september 2012; Accepteret: November 3, 2014; Udgivet: December 1, 2014

Copyright: © 2014 Rojas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne reserach blev støttet af tilskud fra Ministerio de Educación y Ciencia i den spanske Goverment (AGL2008-00387 /ALI og AGL2011-25831 /ALI). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

adipocyter har en unik evne til at lagre overskydende fedtsyrer (FAS) i form af triglycerider i lipiddråber, mens ikke-adipøst væv, såsom leveren, har en begrænset kapacitet til lipid opbevaring. En overbelastning af FA’er inducere lipotoxicity og celledød i ikke-fedt-celler, herunder cardiomyocytter, p-celler og hepatocytter [1] – [4]. Høje doser af mættede FA’er, såsom palmitat, kan forårsage cellulær skade og endda celledød, hvorimod forhøjede koncentrationer af oleat og linoleat, som er umættede FA’er, er bedre tolereret [1], [2]. Selvom de detaljerede mekanismer bag FA-induceret lipotoxicity forbliver usikkert, er det generelt accepteret, at reaktive ilt arter (ROS) og endoplasmatisk reticulum (ER) stress er de vigtigste intracellulære mekanismer [4] – [8].

eR er det vigtigste sted i cellen for protein foldning og handel, og mange cellulære funktioner afhænger af dette rum. Svigt af ER adaptive kapacitet er defineret som ER stress, og cellerne vise forskellige tilpasningsreaktioner responser at lindre denne situation. Udfoldet protein reaktion (UPR) er den primære adaptative reaktion på ER stress og skærer med mange forskellige inflammatoriske og stress signaleringsveje [9], [10]. Overvågning af ER lumen og signaler gennem de kanoniske grene af UPR medieres af de følgende tre ER membranassocierede proteiner: (a) PERK (PKR-lignende eukaryot initieringsfaktor 2a kinase); (B) IRE1 (inositol trænger enzym 1); og (c) ATF6 (aktiverende transkriptionsfaktor-6). Når ER stress ikke er løst, er cellen funktionelt kompromitteret og kan undergå apoptose. I øjeblikket har flere veje blevet direkte impliceret i ER stress-induceret apoptose. For eksempel er transkriptionsfaktoren C /EBP homologt protein (CHOP) induceret af ER stress på det transskriptionelle niveau, som sensibiliserer celler til apoptose ved nedregulering af B-cellelymfom 2 (Bcl-2) og aktivering af GADD34 og ERO1α [11], [12]. ER stress aktiverer også IRE1 og PERK, som har været impliceret i aktiveringen af pro-apoptotiske c-Jun NH

2-terminale kinase (JNK) [13], [14]. Salg

Adskillige rapporter har studeret sammenhængen mellem resveratrol (RSV) virkninger (i sine beskyttende eller cytotoksiske udfald) og eR stress faktorer som nye molekylære mål for virkningen af polyfenoler [15] – [18]. Derudover har mange

in vitro

in vivo

undersøgelser har også vist en beskyttende virkning af RSV og andre polyphenoler på leveren fedtophobning induceret af mættet FA’er eller en kost med højt fedtindhold [19] – [22]. Bortset fra disse beskyttende virkninger, RSV er i stand til at hæmme tumor initiering, promotion og progression i forskellige cellekultursystemer og dyremodeller af mekanismer, som omfattede cellecyklusstandsning, kinase pathways hæmning og apoptose aktivering [23] – [26].

Det er interessant, metaboliske ændringer, karakteriseret ved øget glykolyse og lipogenese, er kendetegnende for cancerceller [27], [28]. Derfor aktivt prolifererende kræftceller til stede ikke kun kvantitative ændringer i

de novo

lipid biosyntese, men også ændringer i lipid membran sammensætning, der påvirker membran fluiditet, signaltransduktion og genekspression [29], [30]. En lang række af cancere tilstedeværende ændringer i lipidmembranen præparat, som primært er kendetegnet ved mættet FA og monoumættede FA akkumulering. Denne ophobning synes at være mindre på grund af en øget optagelse af mættet FA’er og monoumættede FA’er end at forværret syntese af endogen FA’er [31], [32].

Derudover mættede og umættede FA’er afviger betydeligt i deres bidrag til lipotoxicity. Tidligere undersøgelser med primære cellekulturer og cancercellelinier har antydet, at lipotoxicity følge af ophobning af langkædede FA’er er specifik for mættede FA’er. Denne selektivitet er blevet tilskrevet dannelsen af specifikke proapoptotiske lipidarter eller signalmolekyler som reaktion på mættede men ikke umættede FA’er [33]. Arten af disse signaler kan variere fra celletyper, men indbefatter ROS-generering,

de novo

ceramid syntese, nitrogenoxid generation, fald i phosphotidylinositol-3-kinase, og primære virkninger på det mitokondrielle struktur og funktion. Langkædede FA’er kan også undertrykke anti apoptotiske faktorer, såsom Bcl-2 [33].

For at teste hypotesen om, at RSV forringelse af overdreven ophobning fedt induceret af forhøjede mættede FA’er kunne delvist medieres af en reduktion i ER stressreaktion, vi eksperimentelt induceret ER stress under anvendelse palmitat i flere cancercellelinier med eller uden RSV. Uventet havde sub-toksiske RSV niveauer (25 uM) ikke redde celler fra palmitat-induceret ER-stress og lipoapoptosis. I modsætning hertil opnåede vi følgende: (a) en RSV-medieret apoptose kun ved tilstedeværelsen af den mættede FA, og (b) en stærk fremme af lipotoxicity af den ledsagende stigning i FA beløb. Vi karakteriseret denne RSV effekt på det molekylære niveau og fandt, at stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) rolle (umættethed berigelse) sandsynligvis er relateret til dette cellulære “fænotype”, men først og fremmest palmitat opbevaring i triglycerid puljer synes at være kritisk involveret i højere følsomhed af kræftceller til palmitat-induceret lipotoxicity. Disse resultater afslører en relativt ukendt RSV cytotoksisk mekanisme, der kunne udnyttes til at målrette apoptose fremme i transformerede celler.

Resultater

RSV inducerer ER stress i HepG2-celler

Figur 1 viser at HepG2 celler udsat for stigende RSV koncentrationer (i området fra 5 til 100 um) for forskellige varigheder (4, 8 og 24 h) har ændringer i eR homeostase dermed præsentere aktive eR stress mekanismer. Den detaljerede virkning på X-box-bindende protein-1 (XBP1) splejsning og CHOP ekspression blev evalueret (figur 1A og 1B). Den maksimale stigning i XBP1 splejsning (næsten hele XBP1 i den splejsede form) og i CHOP ekspression (51,29 ± 4,81-gange ændring; p 0,001) var på en 100 uM RSV koncentration og en 24 timers inkubering. Selv ER stress på 24 timer er tydeligt, at der er mangel på korrelation med cellelevedygtighed, hvilket antyder, at selv om cellen er tæt på svigtende grund til skadestuen funktionsfejl, det forbliver levedygtig; faldet i levedygtigheden vises efter 24 timers RSV behandling (figur 1C) med en værdi på ~ 40% efter 28 timer (p 0,001). Bemærk, at den valgte RSV koncentration (25 uM) anvendes i yderligere forsøg kunne ikke inducere signifikant ER stress på noget tidspunkt. Salg

HepG2 celler blev udsat for vehikel (0 uM) eller stigende RSV koncentrationer (5, 10 , 25, 50 og 100 uM) og høstet på bestemte tidspunkter (8, 4 og 24 h). A) RSV udøver en tids- og koncentrationsafhængig aktivering af XBP1 splejsning (XBP1 usplejset-197 bp amplikon; XBP1 splejset-171 bp amplikon). Repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg B) RSV udøver en tids- og koncentrationsafhængig aktivering af CHOP-ekspression. C) RSV formindsker HepG2 levedygtighed ved højere doser og inkubationstider. Levedygtigheden blev evalueret under anvendelse af et MTT-assay. Dataene er vist som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. Signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen (vehikel) blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test: *** p 0,001 og * p 0,05

RSV forværrer palmitat-induceret. celledød i HepG2-celler Salg

palmitat-induceret celledød (udtrykt som en formindskelse i cellulær levedygtighed) blev evalueret af en MTT-analyse på HepG2-celler. RSV virkning på palmitat-behandlede celler blev også evalueret. Som vist i figur 2A, stigende koncentrationer af palmitat (fra 0,2 mM til 1 mM) forårsagede en tids- (4, 8 og 24 timer) og dosis-afhængigt fald af cellulær levedygtighed. Når palmitat-behandlede celler blev co-inkuberet med stigende koncentrationer (RSV i området fra 25 um til 100 um), et yderligere fald i HepG2 levedygtighed blev observeret. Denne effekt var mere tydelig ved 50 uM (-60% maksimal reduktion af cellulær levedygtighed; p 0,001) og 100 uM (-80% maksimal reduktion af cellulær levedygtighed; p 0,001) RSV behandlinger på 24 timer af co-inkubation (figur 2B-D). På grund af manglen på en additiv effekt af de 25 uM RSV koncentration om palmitat-induceret celledød (-20% maksimal reduktion af cellulær levedygtighed ns), blev denne koncentration udvalgt til yderligere at undersøge RSV effekt på ER stress og dets forhold til fedtophobning induceret af forhøjede FA’er.

palmitat-induceret celledød (udtrykt som procentdelen af cellulær levedygtighed) blev bedømt ved en MTT-assay i HepG2-celler. RSV virkning på palmitat-behandlede celler blev også evalueret. A) Stigende palmitat koncentrationer (der spænder fra 0,2 mM til 1 mM) forårsagede en tids- (4, 8 og 24 timer) og dosisafhængig reduktion af cellulær levedygtighed. Palmitat-behandlede celler blev også co-inkuberet med stigende koncentrationer af RSV som følger: B) 25 pM RSV; C) 50 uM RSV og D) 100 μMRSV. Et yderligere fald på HepG2 levedygtighed sammenlignet med behandlinger med palmitat alene blev observeret i 50 uM RSV og 100 uM RSV assays. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. Signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen (vehikel) blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test: *** p 0,001 og * p 0,05

RSV øger palmitat-induceret. eR stress i cancerceller

bidraget af eR stress i palmitat-induceret celledød blev indledningsvist undersøgt ved anvendelse XBP1 splejsning som en eR stress markør. Figur 3A viser, at en sub-toksisk RSV koncentration (25 uM) inducerede en ledsagende stigning i palmitat virkning på XBP1 splejsning. For yderligere at verificere vores resultater, vi studerede andre ER stress markører, såsom ATF4, ATF6 og CHOP. Interessant nok blev RSV virkning også observeret (figur 3B) på CHOP (17.03 ± 0.01 vs 8.91 ± 0.65; p 0,001; den maksimale fold ændring var mellem RSV-behandlede og de ubehandlede prøver) og ATF4 ekspression (3,13 ± 0,35 vs. 1,7 ± 0,09; p 0,01; den maksimale fold ændring var mellem RSV-behandlede og de ubehandlede prøver). Virkningen var palmitat-afhængig, hvilket indikerer, at selv om den samme koncentration af polyphenol var til stede, den stimulus, fremmet en forstørrelse af de molekylære virkninger for næsten alle de undersøgte ER stress markører var FA elevation.

HepG2-celler blev vasket to gange i serumfrit DMEM og overført til serumfrit medium med eller uden 25 pM RSV i 28 timer; 8 timer før afslutningen af eksperimentet, stigende koncentrationer af palmitat (0,25, 0,5, 0,75 og 1 mM) blev tilsat til den tilsvarende brønd. A) XBP1 splejsning. (XBP1 usplejset-197 bp amplikon; XBP1 splejset-171 bp amplikon). Et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg er vist. B) ATF4, CHOP og ATF6 mRNA ekspressionsniveauer. Resultaterne er vist som middelværdien af folden ændring ± SD af tre uafhængige forsøg. HeLa-celler blev vasket to gange i serumfrit DMEM og overført til serumfrit medium med eller uden 25 pM RSV i 28 timer; 8 timer før afslutningen af eksperimentet, stigende koncentrationer af palmitat (0,25, 0,5, 0,75 og 1 mM) blev tilsat til den tilsvarende brønd. C) Følsomheden af HeLa-celler til palmitat-induceret ER stress. XBP1 splejsning. (XBP1 usplejset-197 bp amplikon; XBP1 splejset-171 bp amplikon). Et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg er vist. D) RSV forværrer palmitat-induceret splejsning i HeLa-celler. XBP1 splejsning. (XBP1 usplejset-197 bp amplikon; XBP1 splejset-171 bp amplikon). Et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg er vist E) RSV forstærker CHOP medieret signalering. CHOP mRNA ekspressionsniveauer. Resultaterne er vist som middelværdien af folden ændring ± SD af tre uafhængige forsøg. Signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen (vehikel) blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test:. *** P 0,001 og ** p 0,01

ATF6 var den eneste studerede eR stress markør, der syntes at være upåvirket af behandlingen. Imidlertid er ATF6 translokation til Golgi-apparatet kræves til dens aktivering; Derfor er det sandsynligt, at dens ekspression er upåvirket.

Globalt disse resultater antydede, at RSV fremmet ændringer i flere molekylære mekanismer, der blev forstærket, når mængden af palmitat forøget.

Bemærkelsesværdigt, den samme eksperimentelle resultat blev opnået, når en anden cancer cellelinie, HeLa-celler, blev anvendt (tallene 3C, 3D og 3E). Dette antyder, at denne virkning ikke var begrænset til en bestemt cancer cellelinje.

RSV sensibiliserer HepG2 celler til palmitat-induceret apoptose

For at vurdere RSV effekt på palmitat lipoapoptosis udviklede vi Western blotting analyser af spaltet caspase-3. Den proapoptotiske protein caspase-3 syntetiseres som et inaktivt proenzym (32 kDa), der forarbejdes i celler, der undergår apoptose ved selv-proteolyse og /eller spaltning af en anden opstrøms protease. Den processerede form af caspase-3 består af store (17 kDa) og små (12 kDa) subunits, associeret til dannelse af et aktivt enzym. Den aktive caspase-3 proteolytisk spalter og aktiverer andre caspaser og relevante mål i de celler, såsom PARP og DFF [34].

Figur 4A viser, at palmitat behandlinger kun inducerede en lille stigning i caspase-3 spaltning ved højere doser (0,75 og 1 mm). Da RSV blev tilsat, stedet for at reducere den apoptotiske niveau, det fremmede lipoapoptotic virkning palmitat. Således RSV co-behandling inducerede følgende: (a) forøgelse af caspase-3-spaltning sammenlignet med den observeret med palmitat alene; og (b) reduktion af den mættede FA-koncentration tærskel, der kræves til at fremkalde den apoptotiske virkning (dvs. 0,5 mM palmitat vs. 0,5 mM palmitat +25 uM RSV).

ROS produktion reduceres med RSV i palmitat-behandlede HepG2-celler

Bidraget fra oxidativ stress i palmitat-induceret celledød blev undersøgt ved detektion ROS produktion. Til dette assay målte vi det fluorescerende signal efter intracellulær oxidation af ROS (såsom hydrogenperoxid og hydroxylradikal) af membranen permeabel farvestof 2 ‘, 7’-dichlor-dihydro-fluoresceindiacetat (DCFH-DA). Figur 4B viser, at dyrkning af HepG2-celler med stigende koncentrationer af palmitat (fra 0,2 mM til 1 mM) i 8 timer forårsagede en stigning i fluorescerende signal (1026 ± 104 vs. 3294 ± 61; p 0,001; den maksimale forskel var mellem de ikke-behandlede prøver og de palmitat behandlede prøver). Tidligere inkuberinger med 25 pM RSV i 20 timer faldt mængden af intracellulær ROS i alle de analyserede palmitat doser (2478 ± 36 vs. 1222 ± 108; p 0,001; den maksimale forskel var mellem palmitat behandlede prøver og RSV + palmitat behandlede prøver). Dette resultat understøtter den etablerede antioxidant kapacitet polyphenol [35] og foreslår, at de førnævnte RSV virkninger i forbindelse med forværring af palmitat virkning på HepG2 celler ikke primært skyldes en stigning i den intracellulære ROS-produktion.

SCD1 dynamik ændres som reaktion på RSV

Det har tidligere vist, at blandt de ernæringsmæssige stimuli, der modulerer SCD1 genekspression, mættet fedt var stærke aktivatorer. I dyrkede myorør, palmitat forøget SCD1 ekspression forbundet med en stigning i FA muskel opbevaring [36]. Figur 5A viser, at 8 h behandling med stigende palmitat koncentrationer inducerede betydelig overekspression af SCD1 ved højere palmitat doser (1 ± 0,14 vs. 2,21 ± 0,52; p 0,001; den maksimale fold ændring var mellem palmitat behandlede og de ubehandlede prøver ). I modsætning hertil, når HepG2-celler blev forbehandlet i 20 timer med RSV, SCD1 overekspression faldt betydeligt, hvilket antyder, at RSV forringer palmitat-inducerede stigning i SCD1 ekspression (2,21 ± 0,52 vs. 0,7 ± 0,12; p 0,001; den maksimale forskel var mellem palmitat behandlede prøver og RSV + palmitat behandlede prøver). Omvendt blev et lille fald i proteinindholdet opnået, når SCD1 blev undersøgt på proteinniveauet (figur 5B). Denne mangel på sammenhæng mellem SCD1 mRNA og protein niveauer tyder på, at faktorer (post-translationelle faktorer, enzymatisk aktivitet regulering) end genekspression også kunne være vigtigt at de SCD1 dynamik som reaktion på RSV. På grund af denne uoverensstemmelse, vi udviklede siRNA knockdown eksperimenter for at præcisere, hvilken rolle SCD1 i RSV-induceret ER stress. SCD1 udtryk faldet markant på grund af siRNA transfektion (figur S1A). De store niveauer af inhibering blev opnået ved en 10 nM siRNA koncentration på siRNA- (3) eller ved en kombination af de tre siRNA oligonukleotider siRNA- (1, 2, og 3). Derfor SCD1 indhold (figur S1B) protein blev også signifikant reduceret på grund af denne eksperimentelle tilgang. Når SCD1 knockdown blev valideret, undersøgte vi effekten af dette gen silencing på ER stressmekanismer vha XBP1 splejsning som en ER stress markør. Interessant, som tidligere er blevet beskrevet af andre forfattere [37], SCD1 inhibering aktiveret XBP1 splejsning (figur S1c), hvilket antyder, at faldet i membranen umættethed kunne udløse ER-stress og celledød. Vi valgte siRNA (3) og kombinationen af de tre siRNA oligonukleotider siRNA- (1, 2, og 3) for yderligere at undersøge virkningen af SCD1 inhibering i en mættet FA sammenhæng (palmitat behandling). Overraskende begge siRNA silencing tilgange (tallene 5c) viste, at den efterfølgende eksponering af palmitat til eksperimentelt SCD1-depleterede celler ikke forværrer XBP1 splejsning; omvendt i nærvær af palmitat, dette splejsning blev faldet lidt. At bekræfte, at dette cellulære fænotype ikke skyldtes en hypotetisk “tungtvejende” af lyddæmpende strategi, studerede vi SCD1 ekspression gang siRNA- (3) blev transficeret. Den palmitat behandling ikke var i stand til at vende SCD1 genetiske undertrykkelse (figur 5D). Derfor, som beskrevet nedenfor, kan andre kompenserende mekanismer fremmes af SCD1 hæmning være ansvarlig for den relative nedgang i XBP1 splejsning. Derudover figur 5E viser, at CHOP niveauer steg en smule på grund af SCD-1 hæmning, tyder på, at trods det relative fald i XBP1 splejsning, andre sensorer i ER stress, såsom ATF6 eller PERK, kunne påvirke CHOP udtryk. Især denne CHOP elevation er ikke sammenlignelig med tidligere opnåede med RSV + palmitat behandlinger (figur 3B). Salg

HepG2 celler blev vasket to gange i serumfrit DMEM og overført til serumfrit medium med eller uden 25 pM RSV i 28 timer; 8 timer før afslutningen af eksperimentet, stigende koncentrationer af palmitat (0,25, 0,5, 0,75 og 1 mM) blev tilsat til den tilsvarende brønd. A) SCD1 genekspressionsniveauer. Resultaterne er vist som middelværdien af folden ændring ± SD af tre uafhængige forsøg. B) SCD1 proteinniveauer. Cellelysaterne blev fremstillet og analyseret ved Western blotting. Resultaterne af tredobbelte immunoblots blev kvantificeret ved densitometri. Resultaterne vist i grafen Resultaterne repræsenterer forholdet SCD1 /tubulin. En repræsentativ immunoblot er vist under grafen. . Signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen (vehikel eller palmitat) blev analyseret ved parret Students t-test for SCD1 mRNA-ekspression og ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test for Western blot kvantificering *** p 0,001, ** p 0,01 og * p 0,05. SCD1 knockdown (C) inducerer XBP1 splejsning men dette splejsning reduceres, når depleteret SCD1 celler eksponeres for stigende palmitat koncentrationer. (XBP1 usplejset-197 bp amplikon; XBP1 splejset-171 bp amplikon). Et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg er vist. D) Faldet i XBP1 splejsning i siRNA + palmitat celler ikke skyldes SCD1 restaurering. Procentdelen af relativ SCD1 genekspression er vist. Resultaterne er repræsenteret som gennemsnittet af folden ændring ± SD af tre uafhængige forsøg. E) SCD1 lyddæmpning fremmer en svag stigning af CHOP udtryk. Resultaterne er vist som middelværdien af folden ændring ± SD af tre uafhængige forsøg.

RSV inhibering af palmitat akkumulering i triglycerid pools korrelerer med stigningen i CHOP og XBP-1 splejsning

for at belyse andre mulige RSV molekylære mekanisme, der fremmer forværring af eR stress-afledt apoptose, vi fokuserede vores opmærksomhed på triglycerid akkumulation.

triglycerid opbevaring blev evalueret ved olie rød O farvning. Figur 6A viser, at 8 h palmitat behandling inducerede en dosisafhængig stigning i HepG2 triglyceridindhold (0,643 ± 0,006 vs. 0,994 ± 0,015; p 0,001; den maksimale forskel var mellem de ikke-behandlede prøver og palmitat behandlede prøver). Omvendt, når cellerne blev præinkuberet i 20 timer med RSV, blev det intracellulære lipidindhold reduceret på alle de analyserede palmitat koncentrationer (0,951 ± 0,068 vs. 0,774 ± 0,011; p 0,001; den maksimale forskel var mellem palmitat behandlede prøver og RSV + palmitat behandlede prøver). Disse resultater er i overensstemmelse med den akkumulerede

in vitro

in vivo

bevis for anti-adipogene effekt af RSV [38], [39].

HepG2-celler blev vasket to gange i serumfrit DMEM og overført til serumfrit medium med eller uden 25 pM RSV i 28 timer; 8 timer før afslutningen af eksperimentet, stigende koncentrationer af palmitat (0,25, 0,5, 0,75 og 1 mM) blev tilsat til den tilsvarende brønd. A) Olie rød O farvning kvantificering. Triglycerid akkumulering udtrykkes som middelværdien af OD (optisk densitet) ± SD af fire uafhængige forsøg. For de faste RSV koncentrationer blev HepG2-celler vasket to gange i serumfrit DMEM og overført til serumfrit medium med en bærer (0,1% ethanol), 5, 10, 25, 50 eller 100 uM RSV og en fast koncentration af palmitat ( 0,25 mM) i 24 timer. B) Oil red O farvning kvantificering. Triglycerid akkumulering udtrykkes som middelværdien af OD (optisk densitet) ± SD af fire uafhængige forsøg. Signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen (bærestof) og 0,25 mM palmitat blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test: *** p 0,001. C) CHOP mRNA ekspressionsniveauer. Resultaterne er vist som middelværdien af folden ændring ± SD af tre uafhængige forsøg. Signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen (vehikel) blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test: *** p 0,001 og ** p 0,01. D) XBP1 splejsning. (XBP1 usplejset-197 bp amplikon; XBP1 splejset-171 bp amplikon). Et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg er vist.

Desuden har vi udviklet flere forsøg, hvor vi faste den palmitat koncentration (0,25 mM) og udsat HepG2-celler til at øge RSV koncentrationer. Især RSV kunne falde triglycerid akkumulering på en dosis-afhængig måde (figur 6B). Trods dette fald i triglycerid ophobning, der var en samtidig aktivering af en primær ER stress komponent, såsom XBP1 splejsning og ER-afledt nedstrøms apoptotisk faktor CHOP (figur 6C og 6D). Dette resultat kraftigt antydet, at på trods af den initiale gavnlige virkning af RSV i faldende triglycerid ophobning, der var en tærskel på RSV-induceret inhibering af lipid akkumulering (25 uM RSV), at når nået, udløste ER stress-afledte apoptose induceret af palmitat. Derfor viste det sig, at selv om bufferkapacitet palmitat af cellen inhiberes af RSV (primært ved den velkendte RSV inhibitoriske virkning af SREBP1c), når denne inhibering er overdrevent stærk /fortsat, mængden af det resterende palmitat inde i celle vil øge og fremme de skadelige virkninger af den mættede FA (palmitat-induceret ER stress og apoptose).

tilbagevenden af RSV virkninger på grund af co-behandlinger med eicosapentaensyre (EPA) eller leveren X-receptoren ( LXR) agonist (tO-901.317)

for yderligere at undersøge, om eR stress induktion i RSV + palmitat-behandlede celler skyldes ændringer i palmitat forarbejdningskapacitet af cellen, vi udviklet følgende to eksperimentelle tilgange: ( a) polyumættet fedtsyre (PUFA) tilskud (behandling med EPA ved to stigende koncentrationer) og (b) LXR agonist behandling (tilsætning af tO-901.317 at stimulere SCD1 ekspression). Slående, figur 7C viser, at tilskud af begge koncentrationer EPA reddet HepG2 celler fra den apoptotiske proces (reducerede niveauer af spaltet caspase 3 sammenlignet med RSV + palmitat). Dette reducerede niveau af den apoptotiske faktor korreleret med et fald i XBP1 splejsning (figur 7A) og CHOP ekspression (figur 7B) (16.54 ± 2.16 vs. 6,27 ± 0,67; p 0,001; den maksimale forskel var mellem RSV + palmitat behandlede prøver og RSV + palmitat + EPA-behandlede prøver), hvilket antyder restaurering af ER-funktionen.

HepG2 celler blev vasket to gange i serumfrit DMEM og overført til serumfrit medium med en bærer (0,1% ethanol), 25 iM RSV, 50 pM EPA eller 100 uM EPA for 28 timer; 8 timer før afslutningen af eksperimentet, stigende koncentrationer af palmitat (0, 0,75 og 1 mM) blev tilsat til den tilsvarende brønd. A) XBP1 splejsning. (XBP1 usplejset-197 bp amplikon; XBP1 splejset-171 bp amplikon). Et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg er vist. B) CHOP mRNA ekspressionsniveauer. Resultaterne er vist som middelværdien af folden ændring ± SD af tre uafhængige forsøg. C) Det spaltede caspase-3-niveau blev bestemt ved Western blotting. Den viste blot er et repræsentativt billede af tre uafhængige forsøg. Signifikante forskelle blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test: *** p 0,001 og ** p 0,01

Alternativt HepG2 celler behandlet med to koncentrationer (1 uM. og 10 uM) af LXR-agonist TO-901.317 viste øget SCD1 protein og mRNA-niveauer (figur S2A og S2B). Derudover Figur 8 viser, at agonist behandling også korrigeret virkningerne fremmes af palmitat og udløst af RSV. For eksempel agonistbehandlingen korrigeret stigningen i caspase-3-spaltning (figur 8A) og tilbagekaldte virkningerne på ER stress (figur 8B og 8C) i XBP1 og i CHOP ekspression (4,43 ± 0,26 vs. 1,67 ± 0,26; p 0,001; den maksimale forskel var mellem RSV + palmitat behandlede prøver og RSV + palmitat + TO-901317 behandlede prøver)

HepG2 celler blev vasket to gange i serumfrit DMEM og overført til serumfrit medium med. køretøjer (0,05% ethanol og 0,1% DMSO) og 25 uM RSV eller 10 mM TO-901.317 i 28 timer; 8 timer før afslutningen af eksperimentet, stigende koncentrationer af palmitat (0,75 og 1 mM) blev tilsat til den tilsvarende brønd. A) XBP1 splejsning. (XBP1 usplejset-197 bp amplikon; XBP1 splejset-171 bp amplikon).

Kronisk sygdom

PLoS ONE: Resveratrol Forbedrer palmitat-induceret ER Stress og Apoptose i Cancer Cells

Be the first to comment

Leave a Reply Annuller svar