PLoS ONE: nedregulering af NDRG1 Fremmer Migration af kræftceller under reoxygenering

Abstrakt

Et kendetegn ved tumor mikromiljø er ilt udsving, som skyldes hyper-spredning og unormal metabolisme af tumorceller samt uorganiseret neo-kar. Reoxygenering af tumorer kan inducere oxidativt stress, som fører til DNA-beskadigelse og genomisk ustabilitet. Selvom de cellulære responser på hypoxi er velkendte, er lidt kendt om den dynamiske respons efter reoxygenering. For at undersøge de transskriptionelle responser af tumor tilpasning til reoxygenering blev brystkræft MCF-7-celler dyrket under 0,5% oxygen i 24 timer efterfulgt af 24 timer af reoxygenering i normoxi. Celler blev høstet efter 0, 1, 4, 8, 12 og 24 timer under reoxygenering. Den transkriptionelle profil af MCF-7-celler efter reoxygenering blev undersøgt under anvendelse Illumina Manuelle 6 v3 BeadChips. Vi identificerede 127 differentielt udtrykte gener, hvoraf 53,1% var opreguleret og 46,9% blev nedreguleret ved reoxygenering. Pathway analyse viste, at HIF-1-alfa-transkriptionsfaktor netværk og validerede targets af C-MYC transkriptionel aktivering var signifikant beriget med disse differentielt udtrykte gener. Blandt disse gener, blev en delmængde af interesse gener yderligere valideret af kvantitativ revers-transkription PCR. Især human N-MYC nedreguleret gen 1 (

NDRG1

) var stærkt undertrykt ved reoxygenering. NDRG1 er associeret med en række af stress og cellevækst-regulerende betingelser. For at bestemme om

NDRG1

spiller en rolle i reoxygenering blev NDRG1 protein overudtrykt i MCF-7-celler. Ved reoxygenering, overekspression af

NDRG1

signifikant hæmmede celle migration. Vores resultater viste den dynamiske karakter af genekspression i MCF-7 celler efter reoxygenering og viste, at

NDRG1

er involveret i tumor tilpasning til reoxygenering

Henvisning:. Lai LC, Su YY, Chen KC , Tsai MH, Sher YP, Lu TP, et al. (2011) nedregulering af

NDRG1

Fremmer Migration af kræftceller under reoxygenering. PLoS ONE 6 (8): e24375. doi: 10,1371 /journal.pone.0024375

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Juli 7, 2011; Accepteret: August 5, 2011; Udgivet: 30 August, 2011

Copyright: © 2011 Lai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af tilskud fra Kina Medical University, Taiwan (bevilge nr 97F008-119,. 99F008-308, https://english.cmu.edu.tw/) og center for Genomic Medicine, National Taiwan University (give nogen . 99R81400, https://www.cgm.ntu.edu.tw/chinese2007/eng_index.asp), og National Science Council (Grant No. 98-2320-B-002-044-MY3, http: //web1. nsc.gov.tw/mp.aspx?mp=7). Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tumor befolkninger nødt til at overvinde forskellige microenvironmental barrierer før metastaserende til andre organer. Invasive kræftformer derfor kunne betragtes som en serie af tilpasninger i fænotype til deres mikromiljøer. Alle tumor mikromiljøer er kendetegnet ved næringsberøvelse, lav pH, og hypoxi [1]. Disse ændringer var forbundet med perfusion underskud i solide tumorer, som kom fra hurtig vækst tumor og dybt uorganiseret kar [2]. Det er blevet foreslået, at tumor mikromiljø er en enestående ramme for tumor progression, som kræver genetiske tilpasninger kræftceller til videre overlevelse og spredning. Cell spændinger fremkaldt af den mikromiljø, især hypoxi [3], [4] og reoxygenering [5], [6], kan forårsage disse genetiske ændringer.

Regioner i hypoxi er et fælles træk i solide tumorer. Ilt er en begrænsende faktor på grund af ubalance mellem O

2 levering og forbrug [7]. O

2-mangel tilskrives utilstrækkelige vaskulaturerne og iltsvind i successive cellelag distalt til fartøjet lumen; samtidigt, er der en stigning i O

2 forbrug på grund af det høje metaboliske omsætning af tumorceller. Mange undersøgelser har rapporteret, at hypoxiske tumorer var mere malign og resistente over for behandling, og havde således en dårligere prognose [8]. Dette fænomen er blevet påvist i mange tumortyper [9], [10].

Desuden oxygenkoncentrationen inden for et hypoksisk område er meget varierende. Da tumor vaskulaturerne er meget ineffektive og ustabile, røde blodlegemer flux til de hypoksiske områder, hvilket resulterer i reperfusion eller reoxygenering [11]. Reoxygenering ikke kun øger oxygentilførsel men også inducerer oxidativt stress i cellerne. Denne oxidativ stress kan forårsage skade på cellulære makromolekyler og føre til øget genomisk instabilitet [12]. Hvis tumorceller overlever efter udsættelse for hypoxi /reoxygenering fornærmelser, kan de vise stigninger i malignitet [13], DNA over-forstærkning [14], resistens [15], og metastatisk potentiale [16].

Cellular tilpasning til hypoxi er veldokumenteret, men lidt er kendt om adaptive mekanismer til reoxygenering. Derfor brugte vi genom-dækkende udtryk microarrays at undersøge dynamikken i transskriptionsprofilering under reoxygenering i MCF-7 brystcancerceller. Vores microarray Resultaterne viste, at N-MYC nedreguleret gen 1 (

NDRG1

) havde den maksimale respons efter reoxygenering. Derfor har vi fokuseret på at undersøge dets funktionelle rolle i reoxygenering. De funktionelle assays afslørede, at celle migration af brystkræftceller under reoxygenering var drevet af nedregulering af

NDRG1

. Endelig blev den reguleringsmodel af

NDRG1

bruge

i silico

analyse foreslås til yderligere undersøgelse.

Resultater

Identifikation af gener, som reagerer på reoxygenering

MCF-7 humane brystcancerceller blev inkuberet under hypoxi (0,5% O

2-koncentration) i 24 timer og derefter flyttet til normoxi. Celler blev høstet henholdsvis 0 (hypoxi kontrol), 1, 4, 8, 12 og 24 timer efter reoxygenering. Hver gang serien blev uafhængigt udført tredobbelt. Efter ekstraktion total RNA blev Illumina Menneske-6 v3 BeadChips bruges til at undersøge dynamikken i transkriptionel profilering på reoxygenering. Baggrund justeret signaler blev normaliseret ved en fraktil normalisering algoritme. For at identificere differentielt udtrykte gener, blev t-test anvendes til at undersøge ekspressionsniveauerne af hver gang punkt efter reoxygenering versus den for tiden nul. Generne reagerer på reoxygenering blev udvalgt ved at vælge gener, hvis middelværdi

P

-værdien på et givet tidspunkt var 10

-4. I alt vi identificeret 127 gener, hvis transkriptniveauer afveg signifikant fra tid nul. Blandt dem, 53,1% var opreguleret og 46,9% blev nedreguleret ved reoxygenering. De fleste af disse gener (n = 112) blev identificeret på kun ét tidspunkt, men 13 blev identificeret på to tidspunkter, og to gener blev identificeret ved mere end to tidspunkter.

Dernæst principal komponent analyse ( PCA) blev anvendt til at under- reproducerbarheden mellem forskellige replikater samt tidspunkter, hvor specifikke gener blev aktiveret. Som vist i figur 1a, replikerer af samme tidspunkt aggregeret sammen, hvilket indikerer høj reproducerbarhed af vores data. Også forskellige tidspunkter fordelt sekventielt i overensstemmelse med mængden af ​​tid under reoxygenering. Tidspunkterne for 8 timer, 12 timer og 24 timer blev samlet i en klynge, hvilket indikerer lignende genekspressionsmønstre på senere tidspunkter.

(a) Principal komponent analyse (PCA) O

2-responsive gener i MCF7-celler i løbet af 24 timer af reoxygenering efter hypoxi. Akserne er de første to hovedkomponenter (PC), der kan forklare det meste af genekspression profilering. Tre uafhængige forsøg blev udført på hvert tidspunkt. Forskellige former repræsenterer forskellige replikater, forskellige farver repræsenterer forskellige tidspunkter. (B) Antallet af O

2-responsive gener på hvert tidspunkt under reoxygenering. Både opreguleret og ned-regulerede gener er afbildet som en funktion af tid. Sorte bjælker angiver antallet af gener, der er blevet identificeret for første gang, mens grå søjler angiver antallet af gener, som blev identificeret på tidligere tidspunkter. (C) Relative udtryk profiler af de O

2-responsive gener efter skift til reoxygenering. Ekspressionsprodukterne værdier for hvert tidspunkt blev normaliseret med den for tiden nul. Skalaen bjælke til venstre angiver 20 gener, og farven nederst angiver graden af ​​genekspression ændring i forhold til tiden nul. (D) Kvantitativ RT-PCR validering af top ti O

2-responsive gener ved deres respektive tidspunkter af maksimal respons.

Dynamiske reaktioner af genekspression profilering på reoxygenering

at kvantitativt karakterisere O

2-responsive gener på hvert tidspunkt under akklimatisering til reoxygenering, statistisk analyse (Students

t

-test) af hvert tidspunkt mod tiden 0 blev anvendt for hvert gen. Antallet af gener, der var signifikant forskellige (

P

0,0001) fra hypoksi kontrol blev afbildet i figur 1b. Antallet af O

2-responsive gener, herunder både op- og ned-regulerede gener, var 0 ved 1 time, 17 ved 4 timer, 44 ved 8 timer, 49 ved 12 h, og 35 ved 24 timer. Ved 8 h, havde kun 7% af gener (3/44) blevet identificeret på 4 timer, mens 22% af gener (11/49) ved 12 timer var blevet identificeret på 4 eller 8 timer. Således viste dette resultat, at transkriptionelle responser blev aktiveret mellem 8 og 12 timer efter reoxygenering, og derefter formindsket ved 24 timer efter reoxygenering.

For at forstå udtrykket profiler af disse O

2-responsive gener , ekspressionsprodukterne værdier ved hvert tidspunkt blev normaliseret med den for tiden 0 (figur 1c). Den Heatmap viste, at i almindelighed intensiteten af ​​op- eller ned-regulerede gener forøges som celler forblev længere under reoxygenering. Dernæst blev 10 gener med de største udtryk ændringer efter reoxygenering udvalgt til at validere microarray resultater ved anvendelse af kvantitativ RT-PCR. Som vist i figur 1d, udtrykket værdierne af disse gener, undtagen én, ved de tidspunkter med maksimale reaktion var meget konsekvent med microarray resultater.

Pathway analyse af gener reagerer på reoxygenering

for at forstå hvilke veje var involveret i tilpasning til reoxygenering blev pathway analyse udført ved hjælp af NCI-Nature pathway Interaction Database [17]. Blandt de 127 identificerede gener, afslørede pathway analyse, som forventet, det mest markant (

P

0,01) beriget pathway var HIF-1-alfa-transkriptionsfaktor netværk, og den næstvigtigste pathway blev valideret mål for c-myc transkriptionel aktivering (tabel 1). Endvidere at undersøge hvilke pathway blev aktiveret ved hvert tidspunkt, pathway analyser blev udført separat under anvendelse O

2-responsive gener identificeret ved hvert tidspunkt. Resultaterne viste, at gener aktiveres ved 8 h var involveret i validerede targets af C-MYC transkriptionel aktivering (tabel 1). Gener aktiveret ved 12 timer var hovedsageligt involveret i HIF-1-alfa transskription faktor netværk, ceramid signalvejen, og samregulering af androgen receptor aktivitet.

nedregulering af NDRG1 fremmer cellemigration under reoxygenering

Da

NDRG1

, som reguleres af MYC signalvejen, havde den største ændring i ekspression efter reoxygenering, og at disse reoxygenering gener blev beriget med validerede targets af C-MYC transkriptionel aktivering, vi ville yderligere at undersøge reaktion

NDRG1

til reoxygenering. Det var ikke klart, om

NDRG1

kan påvirke metastatiske evne af tumorceller. Derfor blev transwell assays udført for at undersøge migration evne MCF-7-celler ved forskellige O

2 koncentrationer. Som vist i figur 2, Transcript niveauer af

NDRG1

var faldet betydeligt ved reoxygenering (figur 2a), hvorimod migration evne MCF-7 signifikant forøget (figur 2b). En Western blot bekræftede, at C-MYC og N-MYC steg, og NDRG1 faldt under reoxygenering betingelser (figur 2c). Disse resultater viser, at

NDRG1

kan påvirke migration af transformerede celler via MYC-signalvejen.

(a) Relativ ekspressionsniveauer af

NDRG1

under forskellige O

2 betingelser. MRNA-niveauer af

NDRG1

målt ved RT-PCR blev først normaliseret ved 18s rRNA, og derefter sammenlignet med dem i normoxi (*

P

0,01). (B) Relativ migration evne MCF-7 under forskellige O

2 betingelser. En transwell assay blev anvendt til måling MCF-7 migration. Migration evne blev udtrykt som fold ændringer i forhold til normoxi. (C) Western blots af HIF1α, C-MYC, N-myc, og NDRG1 i hypoxi og reoxygenering. GAPDH var lastning kontrol.

Næste, da

NDRG1

blev nedreguleret ved reoxygenering, vi overudtrykt

NDRG1

i MCF-7 celler for at undersøge dens fysiologiske fungere. At bekræfte overekspression, blev mRNA og protein niveauerne af NDRG1 undersøgt ved kvantitativ RT-PCR (figur 3a) og western blotting (figur 3b). Transcript og proteinniveauer af NDRG1 i NDGR1-transficerede celler var signifikant højere end i celler transficeret med tom vektor kontrol. MCF-7-celler transficeret med

NDRG1

eller tom vektor blev derefter inokuleret i transbrøndene til en anden runde af cellemigration assays under reoxygenering. Resultaterne viste, at overekspression af NDRG1 væsentligt (

P

0,001). Inhiberede cellemigration under reoxygenering (figur 3c)

(a) Kvantitativ RT-PCR-analyse af

NDRG1

overekspression i MCF-7. De mRNA niveauer af

NDRG1

blev normaliseret ved 18s rRNA. EV: tom vektor. (B) Western blotting af overudtrykt NDRG1. Protein fra helcellelysater blev blottet med NDRG1-specifikt antistof, og p-actin var lastning kontrol. (C) Relativ migration evne MCF-7-celler efter overekspression NDRG1. Migration evne blev udtrykt som fold skifter i forhold til MCF-7 under reoxygenering.

Forudsigelse af MYC-associeret transkriptionsfaktorer og hypoxi-relaterede microRNA’er i reguleringen

NDRG1

for at forstå de mekanismer, der regulerer

NDRG1

udtryk, vi brugte bioinformatik værktøjer og en litteratur undersøgelse for at forudsige de bindende motiver af MYC-associeret transkriptionsfaktorer i promotoren for

NDRG1

og bindingen steder af hypoksi-relaterede microRNA’er (miRNA) i 3’UTR. Brug Matlnspector og kriterier i de materialer og metoder, blev 170 bindende motiver af transkriptionsfaktorer identificeret i promotoren af ​​

NDRG1

. Blandt disse transkriptionsfaktorer blev MYC-associeret transkriptionsfaktorer, der blev rapporteret tidligere valgte. Disse transskriptionsfaktorer inkluderet E2F-MYC aktivator, MYC forbundet zinkfingre, og E-box binding faktorer. Deres bindende motiv, placering og sekvens logo er anført i tabel S1. Disse resultater, der er sigtet

NDRG1

kunne reguleres af disse transkriptionsfaktorer, selvom flere forsøg er berettiget.

Endelig er ekspressionsniveauerne af miRNA vides at ændre under hypoxi. For at undersøge muligheden for

NDRG1

være underlagt miRNA regulering under forskellige O

2 betingelser, blev bindingssteder af hypoxi-relaterede miRNA søgt i 3’UTR af

NDRG1

. Kriterierne søgning tilladt en mismatch, wobble, sletning eller kløften mellem anden og syvende nukleotider af miRNA. Som vist i tabel S2, seks bindingssteder for frø regioner af fire hypoxi-relaterede miRNA-MIR-25, mir-93, MIR-106a, og MIR-210-blev identificeret i 3’UTR af

NDRG1

, tyder på, at

NDRG1

kunne reguleres af disse fire miRNA. Dette resultat kunne bruges til at designe eksperimenter undersøger post-transkriptionel regulering af

NDRG1

af miRNA.

Diskussion

Flere undersøgelser har rapporteret, at tumorceller udviser forøget resistens og metastatisk potentiale efter udsættelse for hypoxi /reoxygenering fornærmelser [13], [15]. Selvom cellulære tilpasninger til hypoxi er veldokumenteret, er lidt kendt om adaptive mekanismer til reoxygenering. Her undersøgte vi dynamikken i hele genomet genekspression under reoxygenering, og fandt, at de differentielt udtrykte gener var involveret i HIF-1-alpha transkriptionsfaktor netværk og C-MYC transkriptionel aktivering.

I denne undersøgelse , principalkomponentanalyse af de oxygenholdige responsive gener viste høj reproducerbarhed over tid. Baseret på antallet af O

2-responsive gener på forskellige tidspunkter, vises den aktive periode af transskription som respons på reoxygenering at være mellem 8 og 12 timer. Desuden afslørede pathway analyse, at de O

2-responsive gener på 12 timer var involveret i HIF-1-alfa transskription faktor netværk, ceramid signalvejen, og samregulering af androgen receptor aktivitet. Det er ikke overraskende, at HIF-1-alfa-transkriptionsfaktor netværk var involveret i reoxygenering, fordi det er blevet rapporteret i en lignende situation, dvs. bestråling. Efter strålebehandling, tumor reoxygenering fører til nuklear akkumulering af HIF-1 som respons på reaktive oxygenarter [18]. En af gener, nemlig

NDRG1

, i HIF-1-alfa transskription faktor netværk henlede vores opmærksomhed, fordi det havde den største ændring i udtrykket efter reoxygenering.

NDRG1

udtrykkes ubikvitært i væv stimuleret under en bred vifte af spændinger og cellevækst-regulerende betingelser, såsom hypoksi [19], [20], DNA-beskadigelse [21], cellulær differentiering [22], [23], [24], proliferation og vækststandsning [23]. Det er blevet rapporteret, at

NDRG1

kraftigt opreguleret under hypoxiske betingelser. Et onkogent og tumorfremmende rolle

NDRG1

er også rapporteret, fordi det blev overudtrykt i forskellige humane cancere, herunder lunge, hjerne, hud, nyre, og brystcancer [25], [26]. Men

NDRG1

fungeret som metastatisk suppressor i prostata og tyktarmskræft [24], [27]. De modstridende roller

NDRG1

i kræft stadig at blive afklaret, selvom de måske forklares ved sine mange cellulære lokaliseringer og kompleks regulering af forskellige fysiologiske og patologiske faktorer. For nylig, Toffoli et al. tilkendegivet, at

NDRG1

kan induceres med vekslende hypoxi at fremme celle migration [28]. Flere undersøgelser foreslog også, at

NDRG1

induceres af hypoxi og forbundet med metastase, men den reguleringsmekanisme af

NDRG1

forbliver undvigende og sin rolle i henhold reoxygenering er stadig uklart.

NDRG1

havde det maksimale transkriptionel respons på reoxygenering i denne undersøgelse, som vi følte berettiget yderligere undersøgelser. Vi observerede, at ekspressionen af ​​

NDRG1

havde et omvendt forhold med cellemigrering ved reoxygenering. Disse resultater implicerer NDRG1 som en metastase suppressor, i overensstemmelse med resultaterne af Maruyama et al. [8]. Forskellen mellem vores resultater og de Toffoli et al. [28] kan skyldes forskellige typer af celler og eksperimentelle indstillinger.

For at forstå mere fuldt ud mulige reguleringsmekanismer af

NDRG1

under reoxygenering,

i silico

sekvensanalyse blev udført for at forudsige DNA bindende motiver af transkriptionsfaktorer i promotoren for

NDRG1

. Blandt myc-associerede bindende motiver identificeret, zink finger proteiner, E2F-MYC aktivator /celle cyklus lovgivere, og E-boks bindende faktorer kan påvirke genekspression [29], [30], [31], [32]. Disse kandidat transkriptionsfaktorer kan yderligere valideres ved at konstruere forskellige initiativtagere hjælp luciferaseassays. Endvidere ekspressionsniveauerne af flere miRNA har vist, at ændre i hypoxi [33], [34], [35]. Især er miR-210 induceret under hypoxi via en HIF1-afhængig mekanisme, og udtryk for miR-210 havde en stærk korrelation med ekspressionen af ​​

NDRG1

[34]. Derfor vi hypotese, at ekspressionen af ​​

NDRG1

også blev reguleret af miRNA. Faktisk blev de bindingssteder af frø regioner af fire hypoxi-relaterede miRNA (miR-106a, miR-93, miR-25, og miR-210) identificeret i 3’UTR af

NDRG1

. Derfor foreslog vi en arbejdsgruppe model baseret på bioinformatiske forudsigelse og litteratur undersøgelse (figur 4). Denne model giver en ramme for fremtidige biologiske eksperimenter

TSS:. Transskriptionsstartstedet. Hvid kasse: transkriptionsfaktor bindingssted på + streng; black box: transskriptionsfaktorbindende site på – streng; grå boks: miRNA bindingssted

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig brystkræft MCF-7 blev opnået fra Bioresource Indsamling og Research Center (. Hsiuchu, Taiwan). MCF-7-celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) indeholdende 1,5 g /l natriumbicarbonat suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (Hyclone, Gibco) og med 1% antibiotisk opløsning (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). For hypoksiske kulturer blev celler inkuberet i en hypoxi kammer (InVivO

2-200, Ruskinn Technology, Leeds, UK) i 24 timer med en gasblanding, der indeholder 5% CO

2, 95% N

2 ved 37 ° C. Oxygenkoncentrationen i hypoxi kammeret blev holdt på 0,5%. Efter 24 timers hypoxisk vækst, blev celler inkuberet i en brønd befugtet inkubator med 5% CO

2 og 95% stueluft ved 37 ° C. Seks prøver blev indsamlet henholdsvis 0, 1, 4, 8, 12 og 24 timer efter reoxygenering. Cellerne blev vasket med kold PBS, flash-frosset i flydende N

2, og opbevaret ved -80 ° C til senere RNA-isolering. Hvert forsøg blev udført tredobbelt.

RNA-ekstraktion

Totalt RNA blev ekstraheret med TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) og blev oprenset ved RNeasy Micro oprydning kit (Qiagen, Valencia, CA ) ifølge producentens instruktioner. RNA-koncentrationen og kvaliteten blev bestemt under anvendelse af et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) og en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), som beregner et RNA integritet nummer (RIN). Totalt RNA (500 ng) med A

260 /A

280 = 1,7-2,1 og RIN . 7.0 blev anvendt til at syntetisere den første streng cDNA via revers transkription

Illumina human hel-genom-ekspression beadchips

det totale RNA blev primet med T7 Oligo (dT) primer og amplificeret ved Illumina TotalPre RNA Amplification Kit (Ambion Inc., Austin, TX) at syntetisere cDNA indeholdende en T7-promotorsekvens. Efter den første streng cDNA-syntese, blev anden streng cDNA syntetiseret ved at omdanne det enkeltstrengede cDNA i en dobbeltstrenget DNA (dsDNA) template til transkription. Reaktionen anvendte DNA-polymerase og RNase H til samtidig nedbryde RNA og syntetisere anden streng cDNA. Den dobbeltstrengede cDNA derefter en oprydning proces at fjerne overskydende RNA, primere, enzymer, og salte, som ville forhindre in vitro transkription. Derefter blev in vitro-transskription udført under anvendelse af dobbeltstrenget cDNA som en template og T7-RNA-polymerase til at syntetisere adskillige kopier af biotinyleret cRNA. Efter amplifikation blev cRNA blandet med et tilsvarende volumen af ​​hybridiseringspuffer og hybridiseret til Illumina Menneske-6 v3 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) ved 58 ° C i 16 timer. Efter hybridisering blev BeadChip vasket og farvet med streptavidin-Cy3 farvestof. Intensiteten af ​​perlens fluorescens blev detekteret af Illumina BeadArray Reader, og resultaterne blev analyseret ved anvendelse BeadStudio v3.1 software. Alle data er MIAME kompatibel og at den rå data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database. Microarray data af denne undersøgelse er blevet forelagt for GEO (Gene Expression Omnibus) database (tiltrædelse nummer GSE30019).

Data mining og statistisk analyse

Efter scanning, data fra Illumina Human- intensitet 6 v3 BeadChips blev analyseret af kommerciel software Partek® (Partek, St. Charles, MO) til mRNA-ekspression analyse. Baggrund justeret signaler blev normaliseret ved en fraktil normalisering algoritme, som normaliseret sonden intensiteter baseret på intensiteten fordeling blandt alle dias. Efter normalisering, Principal Component Analysis (PCA), som reducerer høje dimensionelle data i en 2D graf, blev anvendt til at vurdere ligheden mellem genekspressionsprofilerne. For at identificere differentielt udtrykte gener, t-tests undersøger ekspressionsniveauerne af hver gang punkt efter reoxygenering versus den for tiden nul blev anvendt. Gener, hvis

P

-værdi af tre gentagelser på et eller flere tidspunkter var 10

-4 blev identificeret og defineret som O

2-responsive gener. Genesis programmet [36] blev anvendt til at generere en visuel repræsentation af udtryk profiler. Desuden NCI-Nature Pathway Interaction Database [17] blev anvendt til at identificere de biologiske funktioner af de differentielt udtrykte gener.

Overekspression af

NDRG1

i MCF-7

menneskelig

NDRG1

genet blev indsat mellem

EcoR i

og

BamHl

steder i eukaryote ekspressionsvektor pcDNA3.1 + (Invitrogen, Carlsbad, CA). MCF-7 /NDRG1 celler blev skabt ved transfektion af MCF-7-celler med pCDNA3.1 + koder for

NDRG1

gen under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). MCF-7 /NDRG1 celler blev derefter udvalgt af 200 ug /ml zeocin i to uger. MRNA ekspression af

NDRG1

blev undersøgt ved kvantitativ realtids-PCR, og NDRG1 proteinekspression blev undersøgt ved western blotting.

Kvantitativ revers-transkription PCR

Totalt RNA blev ekstraheret ved anvendelse TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Revers transkription af totalt RNA blev udført med en høj kapacitet cDNA RT Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) under anvendelse af tilfældige primere og 1 ug totalt RNA som template. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 25 ° C i 10 minutter, 37 ° C i 2 timer og 85 ° C i 5 sek. Real time PCR blev detekteret ved SYBR Green (Sigma) og blev udført under anvendelse af ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reaktionerne blev udført under anvendelse af følgende program: 40 cyklusser af denaturering ved 95 ° C i 15 sek og 1 min af annealing og forlængede ved 60 ° C. For hver cDNA prøve, en intern kontrol, 18s rRNA, blev også målt ved SYBR Green sonde for at sikre sammenlignelige mængder af cDNA i alle brønde. Relativ ekspression af NDRG1 forhold til 18s rRNA i hver prøve blev beregnet (△ Ct) og den relative ekspression af NDRG1 blandt prøver blev bestemt ved at beregne forskellen i △ Ct mellem prøver (△△ Ct). Alle målinger blev udført i tre eksemplarer (5 ng totalt RNA pr brønd).

Western blotting

Hele celleekstrakter blev fremstillet under anvendelse RIPA-lysepuffer suppleret med 1% Nonidet P-40 (NP 40) og Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche, Mannheim, Tyskland). Cellerester blev opsamlet ved centrifugering ved 8000 x g ved 4 ° C i 20 minutter. Proteinkoncentration blev målt ved bicinchoninsyre-metoden (BCA assay), og 20-50 ug protein blev fyldt på en 10% denaturerende natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel. Efter elektroforese blev proteinet elektroforetisk overført til PVDF-membraner natten over ved 55 mA. Membranerne blev blokeret med Tris-saltvand Tween-20 (TBST) med 5% fedtfri mælkepulver ved stuetemperatur i en time. Påvisning af specifikke proteiner blev udført ved at probe membraner med primære antistoffer i TBS med 0,1% Tween-20 i 1,5 time ved stuetemperatur. Disse antistof inkluderet NDRG1 (Abcam, 1:500), HIF1α (Millipore, 1:1000), C-MYC (Millipore, 1:1000), N-MYC (Millipore, 1:250), og ladningskontrol GAPDH (GeneTex, 1:10000) eller β-actin (1:5000). Efter inkubering med peberrodsperoxidasekonjugeret IgG sekundære antistoffer (1:5000) blev immunoreaktiviteten visualiseret ved forøget kemiluminescens med Luminol Reagent (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA).

cellemigrationsassay

migration analyser blev udført ved hjælp af 24-godt Transwell migration kamre (Corning, Corning, New York, USA) med 8 um pore polyethylen størrelse membraner. Celler blev først sultet 24 timer og blev høstet ved Accutase (PAA Laboratories, Linz, Østrig). De øvre kamre blev podet med 5 x 10

4 celler /brønd i 0,1 ml serumfrit DMEM-celle-opløsning og nedre kamre blev fyldt med 0,6 ml DMEM indeholdende 10% FBS som kemoattraktant. Cellerne fik lov til at migrere i 24 timer ved 37 ° C. Til måling af de migrerede celler, 2 ug /ml Calcein-AM (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) /Cell Dissociation Solution (Trevigen) blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubation ved 37 ° C i 60 minutter, blev inserter fjernet og pladerne blev aflæst ved 485 nm for excitation og 520 nm for emission. Celleantal blev beregnet ved at sammenligne absorbansen med standardkurven. MCF-7 celler transficeret med tom vektor, blev anvendt som kontrol for hvert forsøg.

I silico

analyse af

NDRG1

For at identificere potentielle binding motiver af MYC-associerede transkriptionsfaktorer i promoteren af ​​

NDRG1

, den Matlnspector programmet blev udnyttet [37]. To foruddefinerede grupper af transkriptionsfaktorer, herunder generel core promotorelementer og hvirveldyr, blev analyseret i matrixen biblioteksversion 8.3 anvendelse af følgende parametre: (1) matrix familier blev matchet i stedet for individuelle sekvenser; (2) kerne lighed var mindst 0,75; (3) matrix lighed blev optimeret. Kerneområdet blev defineret som fire konsekutive nukleotider med den højeste bevaring scorer [38]. Kernen og matrix ligheden blev beregnet ved at sammenligne søgesekvensen med den mest konserverede nukleotid i matrixen. Efter at have identificeret de potentielle transskription faktor kandidater, blev yderligere udvalgt myc-associerede transkriptionsfaktorer baseret på en litteraturgennemgang.

For at identificere de bindingssteder af hypoxi-relaterede miRNA,

NDRG1

3 ‘ UTR sekvens blev hentet fra UCSC genom browser (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway; GRCh37 /hg19 samling), og blev justeret til hypoxi-relaterede miRNA. Kriterierne for at søge bindingssteder af frø regionen blev tillader en mismatch, wobble, sletning eller kløften mellem anden og syvende nukleotider af hypoxi-relaterede miRNA.

Støtte oplysninger

tabel S1.