PLoS ONE: En Rekombinant Fungal Lectin til mærkning Trunkerede Glykaner på humane cancerceller

Abstrakt

Cell overflade glycokonjugater nuværende ændringer af deres strukturer i kroniske sygdomme og distinkte oligosaccharid epitoper er blevet forbundet med kræft. Blandt dem, trunkerede glycaner tilstedeværende terminale ikke-reducerende β-N-acetylglucosamin (GlcNAc) rester, der er sjældne på sundt væv. Lektiner fra ukonventionelle kilder såsom svampe eller algi tilvejebringe nye markører, der binder specifikt til sådanne epitoper, men deres tilgængelighed kan være udfordrende. En GlcNAc-bindende lectin fra frugtlegemer organ af svampen

Psathyrella velutina

(PVL) er fremstillet med godt udbytte i bakteriekultur. En stærk specificitet for terminal GIcNAc-rester fremgik af glycan array. Affinity værdier opnået ved mikrokalorimetri og overfladeplasmonresonans demonstrerede en mikromolær affinitet for GlcNAcβ1-3Gal epitoper og for biantennær N-glycaner med GlcNAcβ1-2Man capped grene. Crystal struktur PVL kompleks med GlcNAcβ1-3Gal etablerede det strukturelle grundlag af specificitet. Mærkning af flere typer cancerceller og anvendelse af inhibitorer af glycan metabolisme indikerede, at rPVL binder til terminal GIcNAc men også til sialinsyre (Neu5Ac). Analyse af glycosyltransferase ekspression bekræftede højere mængde GlcNAc stede på cancerceller. rPVL binding er specifik for kræft væv og svag eller ingen mærkning observeres for sunde dem, bortset fra mave kirtler, der præsenterer unikke αGlcNAc-præsentere muciner. I lunge-, bryst- og coloncarcinomer, kunne observeres en klar afgrænsning mellem kræft regioner og de omkringliggende raske væv. PVL er derfor et nyttigt værktøj til mærkning agalacto-glycaner i kræft eller andre sygdomme

Henvisning:. Audfray A, Beldjoudi M, Breiman A, Hurbin A, Boos I, Unverzagt C, et al. (2015) En Rekombinant Fungal Lectin til mærkning Trunkerede Glykaner på humane cancerceller. PLoS ONE 10 (6): e0128190. doi: 10,1371 /journal.pone.0128190

Academic Redaktør: Els JM van Damme, Ghent Universitet, BELGIEN

Modtaget: Januar 28, 2015; Accepteret: April 24, 2015; Udgivet: 4 jun 2015

Copyright: © 2015 Audfray et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. PVL /ligand kompleks er blevet deponeret i Protein Data Bank med kode 4UP4

Finansiering:. Agence Natioale de la Recherche: giver NeoLect-11-BSV5 og ANR-11-LabX-003 (http: //www .agence-nationale-recherche.fr /). Europæisk samarbejde om videnskabelig og Teknologi: COST Action CM1102 (https://www.cost.eu/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ændringer i celleoverfladen glycosylering er kendt for at være forbundet med en lang række kroniske sygdomme og kræft glycaner udgør en meget lovende område for biomarkører [1-3]. Korrelation af inflammation eller metastase med overekspression af sialylerede og fucosylerede epitoper, såsom sialyl Lewis x har været genstand for intensiv forskning. Men i andre tilfælde kan den meget aktive stofskifte og Divison af kræftceller resultere i unormal udsættelse af kryptiske epitoper. Denne interne del af glycokonjugater, som ville være blevet dekoreret af andre monosaccharider i normale celler, kan derfor blive eksponeret på celleoverfladen og bliver tilgængelige for påvisning af antistoffer eller lectiner [4].

N-acetylglucosamin (GlcNAc ) er et kulhydrat rest, som er til stede i den indre del af N-glycaner, som kernen chitobiose knyttet til asparaginrest og mere sjældent som β1-4 knyttet til kernen forgrenede mannose i gennemskæres N-glycaner. GlcNAc er også til stede i grene af disse glycokonjugater, enten β1-2-bundet til mannose (Man) på trimannose kerne eller β1-3-bundet til galactose (Gal) som del af polylactosamine forlænget grene (fig 1A). Alligevel grund af aktiviteten af ​​galactosyltransferases og sialyltransferaser, disse GlcNAc rester ikke er i terminale stillinger i normale væv. Tilsvarende glycosphingolipider indeholder GlcNAcβ1-3 eller β1-6 knyttet til Gal, men ikke i udsatte terminale stillinger. Epitoperne er ens i muciner med Gal, sialinsyre (Neu5Ac) eller fucose (Fuc) rester capping de terminale epitoper. Den eneste undtagelse er en sjælden epitop bestående af α1-4 forbundne GlcNAc-terminerede muciner fra glandulær mukøse celler i maven [5] (Fig 1A).

A. Eksempler på normale og afkortede oligosaccharider, der kan findes på normale eller kræft væv. Kodende for skematisk repræsentation af monosaccharider er i den nederste del af figuren. Den heptasaccharide anvendt i bindende eksperimenter er angivet som “hepta”. B. Syntese af heptasaccharide azid 2 svarende til oligosaccharid “hepta” i panel A.

Forekomsten af ​​afvigende βGlcNAc-afslutning epitoper er blevet observeret i et begrænset antal kræfttilfælde, herunder menneskelige leukæmi celler [6 ]. IgG’er med afkortede N-glycaner er blevet rapporteret i serum af patienter med prostatacancer [7]. Altered muciner med terminale GlcNAc motiver blev foreslået at danne Tk epitop, et kolon tumorassocieret antigen [8]. Den mest præcise karakterisering af ændringer af glycosylering med eksponering af interne GlcNAc blev udført ved glycome analyse af forskellige carcinom, peger på forekomsten af ​​korte trunkerede N-glycaner termineret med GlcNAβ1-2Man på både antenne og af GlcNAc-termineret lineære og forgrenede glycosphingolipider , især i lungen småcellet carcinom og adenocarcinom, men også i nyre, bryst og ovarie carcinom [9] (fig 1A).

Lectiner, generelt afledt af planter, har vist sig at være meget effektive til at detektere aberrerende glycosylering i biologiske prøver. En ny teknologi er anvendelsen af ​​lectin arrays, som kan indeholde lectiner med stort spektre af specificitet og derfor karakterisere variation af glycosylering [10]. Brugen af ​​lektiner udvundet fra naturlige organismer kan være tidskrævende og kan generere problemer med forurening eller variationer mellem batches. Derfor er rekombinant lektin teknologi begynder at blive udviklet [11]. Lektiner, som er klassisk bruges til GlcNAc-binding, er udvundet af planter såsom hvede (WGA), tomat (SLT) og

Griffonia simplicifola

(GSL-II). En ny GlcNAc-specifik lectin (PVL) blev oprenset fra frugtlegemer og mycelium af en svamp,

Psathyrella velutina

[12] og derefter strukturelt karakteriseret [13]. Et nært beslægtet protein, lectin 2 fra champignon

Agrocybe aegerita

(AAL-2) er for nylig blevet klonet og påvist at binde til hepatomceller [14]. Den PVL struktur indeholder nye fold blandt lectiner, med syv p-sheets arrangeret i en β-propel fold. Lektinet indtager derfor en doughnut form med seks GlcNAc bindingssteder, og forventes at præsentere stærk aviditet for celleoverflader frembyder høj densitet af terminale GlcNAc rester.

Formålet med det foreliggende arbejde var at producere en rekombinant form af PVL og at beskrive sin fine specificitet mod de forskellige GIcNAc-termineret epitoper, der kunne være til stede på patologi-relaterede afkortede former af menneskelige glycokonjugater. Aviditeten af ​​lectinet for GlcNAc-dekoreret overflade blev vurderet på arrays. Endelig blev evne lektin at mærke kræftceller og carcinoma væv også beskrevet.

Materialer og metoder

Materiale

GlcNAc er blevet købt fra Sigma-Aldrich. Disaccharid GlcNAcβ1-3Gal, lacto-N-tetraose (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), lacto-N-triose (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) chitobiose (GlcNAcβ1-4GlcNAc), chitopentaose (GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc ) er blevet købt fra ELICITYL (Crolles, Frankrig). Sialidase fra

Clostridium perfringens

er blevet købt fra Sigma-Aldrich (ref. N2876) eller New England Biolabs (Ipswich, MA). ß-D-N-acetyl-hexosaminidase

f fra

Streptomyces plicatus

blev købt fra New England Biloabs. Biotin-mærkede sialinsyre-specifik lectin MAH blev indkøbt fra Vector Labs (Burlingame, CA)

Syntese af N-glycan 2

Nonasaccharide azid 1 (fig 1B) blev fremstillet fra æggeblomme efterfulgt af enzymatisk hydrolyse og azidering [15, 16]. 5,1 mg (3,1 pmol) af nonasaccharide 1, blev opløst i 203 pi phosphatbuffer (100 mM, pH 6,8, 1 mM MgCl

2). 10 enheder af lyofiliseret β-galactosidase (EC 3.2.1.23) blev tilsat til opløsningen. Blandingen blev inkuberet ved 37 ° C i 3 dage (TLC: 2-propanol, 1 M ammoniumacetat, 2: 1). Efter lyofilisering blev resten oprenset ved gelfiltrering (Superdex 30, 1,6 x 60 cm, 0,1 m NH

4HCO

3, 0,9 ml min

-1). Toppen, der eluerede ved 86 min blev lyofiliseret og afsaltet ved gelfiltrering (Sephadex G-25, 2,5 x 15,5 cm, 5% ethanol i vand, 0,6 ml min

-1). Toppen, der eluerede ved 75 min, blev lyofiliseret, hvilket gav 2,9 mg (2,2 pmol) heptasaccharide 2 (70%). [Α]

D

22 = -9,0 (c = 0,5, H

2O). Renheden blev bekræftet af 360 MHz

1H NMR i D

2O (S1 Fig)

1 H-NMR (360 MHz, D

2O): δ = 5,03 (d,

J

1,2 1 Hz, 1 H, H-1

4), 4,83 (d,

J

1,2 1 Hz, 1 H, H- 1

4′), 4,68-4,64 (m, 2H, H-1

1, H-1

3), 4,53 (d,

J

1,2 = 7,7 Hz, 1 H, H-1

2), 4,47 (d,

J

1,2 = 8,3 Hz, 2H, H-1

5, H-1

5 ‘), 4,18-4,15 (m, 1 H, H-2

3), 4,12-4,09 (m, 1 H, H-2

4), 4,04-4,01 (m, 1H, H- 2

4 ‘), 1,99 (s, 3H, NAc), 1,97 (s, 9H, NAc). ESI-MS: m /z beregnet for C

50H

83N

7O

35: 1341,49; fundet 1342,62 (M + H)

+, 1365,86 (M + Na)

+

Produktion af rekombinante PVL

En nukleotidsekvens der koder for peptidsekvensen af ​​lectin fra frugtsætning kroppen af ​​champignon

P

.

velutina

(GenBank, accessionsnummer DQ232759) [13] suppleret ved N-terminal position med aminosyrerne MSVVVIS blev syntetiseret efter kodonoptimering til ekspression i

Escherichia coli

(genscript, Piscataway, NJ). Den blev indført i ekspressionsvektoren pET25b hjælp Ndel og Xhol restriktionssteder. Den pET25-rPVL vektor blev omdannet til

E

.

coli

BL21 (DE3) (Novagen), og celler indeholdende pET25-rPVL plasmid blev dyrket i LB-bouillon indeholdende 100 ug ml

-1 ampicillin ved 37 ° C, indtil A600 nåede 0,7. Cellerne blev derefter dyrket i 16 timer efter tilsætning af 0,5 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid. Efter centrifugering (7000 x g i 15 minutter), blev bakterierne resuspenderet i ækvilibreringsbuffer (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl) og brydes af celleødelæggelse ved et tryk på 1,7 kilobar (Constant Systems Ltd). Efter centrifugering (50000 x g, 30 min ved 4 ° C) og filtrering, affinitetschromatografi på en GlcNAc-agarose-søjle (EY laboratorier inc.) Blev udført på supernatanten. rPVL fik lov til at binde til immobiliseret GlcNAc i ækvilibreringsbuffer, og efter vask (20 mM Tris /HCl pH 7,5, 1 M NaCl), blev det elueret med 200 mM af frie GIcNAc i ækvilibreringsbuffer. Oprensede protein blev dialyseret omfattende mod ultrarent vand i 7 dage, frysetørret og opbevaret ved 4 ° C.

Glycan matrix

Oprenset rPVL blev mærket med Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger og genoprenset på en D-Salt polyacrylamid afsaltning søjle (Pierce). Alexa-mærket rPVL blev brugt til glycan vifte screening med standard procedure af protein-Glycan Interaction Core (H) af konsortiet for Funktionelle Glycomics.

Termisk skift analyse

Termiske skift assays var udført under anvendelse af en Mini Opticon, Real Time PCR-maskine (Bio-Rad Laboratories) med 0,5 mg ml

-1 af protein fortyndet i 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 100 uM CaCl

2, med eller uden oligosaccharid i et totalt reaktionsvolumen på 25 pi. SYPRO Orange (Molecular Probes, CA) blev anvendt som en fluorescerende probe detekteret ved 530 nm. Temperaturen blev hævet ved anvendelse af 1 ° C /minut trin fra 25 ° C til 100 ° aflæsninger C og fluorescens blev taget ved hvert interval. En positiv ATm værdi indikerer, at liganden stabiliserer proteinet fra denaturering, og derfor binder til proteinet. Et minimum af to uafhængige målinger blev udført for hver betingelse

mikrocalorimetri

Rekombinant lyofiliseret rPVL blev opløst i buffer (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, NaCI 150 mM, 100 uM CaCl

2) og afgasset. Proteinkoncentrationen blev kontrolleret ved måling af A280 ved anvendelse af en teoretisk molær ekstinktionskoefficient på 65.890 M

-1 cm

-1. Carbohydratligander blev opløst i den samme puffer, afgasset, og indlæst i injektionssprøjten. ITC blev udført med en ITC200 mikrokalorimetret (GE Healthcare). Den rPVL opløsning blev anbragt i en 200 pi prøve celle ved 25 ° C. Titrering blev udført med 20 injektioner med 2 pi carbohydratligander hver 120 s. De eksperimentelle data blev monteret på en teoretisk titreringskurve hjælp Origin software leveret af GE Healthcare, med AH (enthalpi ændring), Ka (forening konstant) og n (antal bindingssteder pr monomer) som justerbare parametre. Gratis energi skift (AG) og entropi bidrag (TΔS) blev afledt fra ligningen AG = AH – TΔS = Rt ln Ka (med T som den absolutte temperatur og R = 8,314 J mol

-1 K

– 1). To uafhængige titreringer blev udført for hver testet ligand.

overfladeplasmonresonans

Alle SPR eksperimenter blev udført på et Biacore X100 instrument (GE Healthcare) ved 25 ° C i HBS (10 mM Hepes /NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) suppleret med 100 uM af CaCl

2 ved en strømningshastighed på 30 pi min

-1. Binding blev målt som resonansenheder over tid efter blank subtraktion, og data blev derefter bedømt ved hjælp af Biacore X100 evaluering software, version 2.0. Dissociationskonstanter blev bestemt ved at afbilde respons ved ligevægt (Req, 10 s før udgangen af ​​injektion) mod analytkoncentrationen. For protein overtrukket chip, 3500 resonansenheder af rPVL (100 ug ml

-1, 10 mM acetatpuffer pH 6,2) er blevet immobiliseret på strømningskanalen 2 af en forskningskvalitet CM5 chip ved anvendelse af standard aminkobling procedurer. Flow kanal 1 er blevet aktiveret /deaktiveret. Eksperimenter består af injektion (foreningens 360 s, dissociation 400 s) af forskellige koncentrationer af oligosaccharider (2 fold kaskade fortyndinger, fra 0 til 10 uM) på begge kanaler.

Protein krystallografi

Krystaller af rPVL kompleksdannet med GlcNAcβ1-3Gal blev opnået ved den hængende dråbe ved 20 ° C. Lyofiliseret protein blev opløst ved 2,5 mg ml

-1 i 10 mM Hepes /NaOH-buffer, pH 7,5, NaCI 150 mM, 100 uM CaCl

2 og inkuberet med 1 mM GlcNAcβ1-3Gal under 1 time ved stuetemperatur før co-krystallisation. Én stor rektangulær-lignende krystaller blev opnået fra 20% PEG3350, 0,2 M natriumformiat og 0,1 M diammoniumphosphat efter flere måneder. Ét stykke blev direkte monteret i en cryoloop og flash-fryses i flydende nitrogen. Diffraktionsdataene blev indsamlet ved 100 K på ESRF (Grenoble, Frankrig) på stationen BM30A bruge en ADSC Q315r CCD-detektor [17]. Dataene blev behandlet under anvendelse XDS [18]. Alle yderligere computing blev udført ved hjælp af CCP4 suite [19] data kvalitet statistik er opsummeret i S1 tabel. Den molekylære udskiftning teknik blev anvendt til at opklare strukturen med PHASER [20], og koordinaterne for det native PVL (Protein Data Bank kode 2C4D) [13]. Strukturen blev forfinet af behersket maksimal sandsynlighed raffinement hjælp REFMAC 5.8 [21] gentog med manuel ombygning i Coot [22]. Inkorporering af liganden blev udført efter inspektion af MFO-DFC vægtede kort. Vandmolekyler, der blev indført automatisk ved hjælp Coot, blev inspiceret manuelt. Den stereokemiske kvalitet af modellerne blev vurderet med programmet Molprobity [23], og koordinaterne blev deponeret i Protein Data Bank under kode 4UP4.

Cells linjer

Menneskelig ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) (H358, A549, H441 og H322), bronkial epitel (HBEC-3KT), brystcancer (MCF-7, MDA-MB-231), ovariecancer (OVCAR3), prostatacancer (DU-145), hud pladecellecarcinom (A431), melanom (A375, Colo829 og SKMel28), og coloncancer (HT-29) cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den M119 melanom cellelinje var en gave fra Dr. Nathalie Labarrière (Inserm U892, Nantes, Frankrig). Cellerne blev holdt i RPMI-1640 medium (Gibco, Cergy Pontoise, Frankrig), undtagen MDA-MB-231 og HT-29, som blev dyrket i DMEM 4,5 gl

-1 glucose (Gibco), og HBEC-3KT , som blev holdt i keratinocyt-SFM-medium (Gibco). Alle dyrkningsmedier blev suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (5% for MDA-MB-231), og celler blev holdt i en fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C.

Flow cytometri Salg

Celler blev trypsiniseret, opdelt i prøver og derefter vasket to gange i PBS (med Ca

2+ og Mg

2+). Efter inkubation med rPVL-Alexa488 (5 og 10 pg ml

-1) blev cellerne vasket to gange og analyse blev udført på en Accuri C6 flowcytometer ved hjælp af CFlow-Plus Software (BD Biosciences). Alternativt biotinyleret rPVL eller MAH blev anvendt, efterfulgt af Streptavidin-phycoerythrin (BD) og analyse blev udført på en FACSCalibur med CellQuest software (BD). Hvor det er angivet, celler blev præ-teated med sialidase (Sigma) eller ß-DN-acetyl-hexosaminidase i 4 timer ved 37 ° C.

Inhibering af glycosylering

A549-celler blev podet i 6 brønd plader og behandlet med forskellige glycosyleringsinhibitorer: en fucosyltransferase inhibitor, 2-fluor-peracetyl fucose (2FF) og en sialyl-transferase-inhibitor, 3-fluor-peracetyl-neuraminsyre (3F-Neu5Ac), der er beskrevet for nylig [24] . Behandling blev udført i 4 dage med 400 uM og 100 uM 2FF og 3F-Neu5Ac hhv. Medium blev udskiftet og inhibitorer blev igen tilsat efter 2 dage.

For at undersøge, hvilken type glycosylerede ligander, der genkendes af rPVL anvendte vi Kifunensin (Sigma), som blokerer ER α-mannosidase I og således behandling af N-glycaner; benzyl-2-acetamido 2 deoxy-a-D-galactopyranosid (benzyl-GaINAc, Sigma), som blokerer O-glycosylering proces- og 1R, 2R – (+) – 1-phenyl-2-palmitoylamino-3-N-morpholin 1-propanol (PPMP; Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA), som hæmmer syntesen af ​​glycolipider. Celler blev behandlet med 5 pM Kifunensin i 4 dage som ovenfor. For benzyl-GaINAc og PPMP blev celler efterlades i kontakt med inhibitorerne, ved 6 mM og 10 uM henholdsvis over en 24 h periode, hvorefter mediet blev ændret, og cellerne blev inkuberet i yderligere 1 dag før analyse. Som 2FF, 3F-Neu5Ac og PPMP fortyndes i DMSO, blev rent DMSO tilsat til mediet af kontrolbrønde for at have samme koncentration af DMSO i hver brønd. Salg

Immunofluorescensanalyse Salg

Celler blev podet i 4-kammer kultur slides (4×10

4 celler pr kammer). Efter 24, blev cellerne vasket med iskoldt PBS og fikseret med 2% paraformaldehyd i 10 minutter ved 4 ° C. Før og efter inkubering med 1% BSA /PBS (vægt /volumen), cellerne blev vasket med kold PBS tre gange i 5 min hver. Celler blev derefter underkastet immunfluorescensfarvning med rPVL-Alexa488 i 1 time ved stuetemperatur og derefter vasket med koldt PBS tre gange i 3 min hver. Celler blev undersøgt under anvendelse af et BX41 mikroskop udstyret med en DP-70 digitalt kamerasystem (Olympus, Tokyo, Japan) og en pseudo-konfokalt mikroskop ApoTome udstyret med AxioCam MRM (N /B).

Vævssnit

Ethanol-fikserede humane luftrør, spiserør, duodenal junction, jejunum, colon, bugspytkirtel, lever, ovarie, uterus og vagina prøver blev opnået fra organdonorer. 18 vævsprøver fra 10 forskellige individer blev anvendt til at fremstille et væv microarray (TMA) af sunde væv. Ethanol-fikserede colorektale tumor- snit blev opnået efter cancer kirurgi. Formalin-fikserede paraffin-indlejret humant NSCLC prøver (n = 3 skælcellecarcinomer, n = 3 adenocarcinomer) blev også opnået. Et bryst tumor og en lunge tumor TMA (formalin-fikseret, 40 tumorer, 10 parrede metastase og 10 parret tilstødende “normale” væv) blev købt fra SuperBiochip (Seoul, Sydkorea). Formalinfikserede hunde brysttumorer blev opnået fra “laboratorium af animalsk histopatologi af Nantes Veterinary School, ONIRIS) Immunfarvning analyse blev udført på 3 um tykke vævssnit.

Histochemistry

Vævet sektionerne blev deparaffineret, derefter endogene peroxidaser blev blokeret ved inkubering af sektionerne med PBS indeholdende 3% hydrogenperoxid (v /v), for 5 mn. snittene blev derefter blokeret med BSA 5% (w /v) i 30 min ved stuetemperatur efterfulgt af inkubering med 0,7-1 ug ml

-1 biotinyleret rPVL 1 time ved stuetemperatur (Ethanol-fikserede sektioner) eller 2 ug ml

-1 af biotinyleret rPVL i PBS ved 4 ° C i 18 timer ( for formalin-fikserede sektioner). efter vask sektionerne to gange med PBS, en indirekte biotin-streptavidin-system og DAB (Ventana Medical Systems) eller AEC (Vector Laboratories) afsløring kits blev anvendt ifølge producentens instruktioner. de udviklede objektglas blev vasket to gange med PBS og modfarvet med hæmatoxylin. Efter vask med vand, blev sektionerne dehydreret og monteret. Snit blev observeret under et BX41 mikroskop udstyret med en DP-70 digitalt kamerasystem (Olympus, Tokyo, Japan) eller afbildes med en NanoZoomer slide-scanner (Hamamatsu, Hamamatsu City).

I behandling med glycosidaser, sektioner blev inkuberet (efter deparaffination og hydrogenperoxid blokering) med 50 U af sialidase (New England Biolabs) eller 25 U af ß-DN-acetyl-hexosaminidase i 2 timer ved 37 ° C. Friske enzymer blev derefter tilsat, og objektglassene blev yderligere inkuberet natten over ved 37 ° C. Kontrolglas blev fremstillet parallelt med det tilsvarende enzym buffere (natriumcitrat, pH 6 og 4,5 henholdsvis). Efter inkubation natten over blev objektglassene vasket to gange i PBS, blokeret med PBS-5% BSA (vægt /volumen), farvet med rPVL og afbildes som beskrevet ovenfor.

Etiske udsagn

Alle human ethanol-faste væv væv blev opsamlet og opbevaret for loven 88-138 EØF af 20. december 1988 om resektion af humane væv efter døden til videnskabelige undersøgelser. Af denne grund, ingen godkendelse fra en Research Ethics Committee gælder. Prøverne blev opnået fra Nantes Universitetshospital Center for biologiske ressourcer (https://relib.fr), under cancerologi godkendt af ministeriet for forskning (godkendelse DC-2011-1399). Tissue bank og forskning adfærd formalinfikserede humane væv blev godkendt af ministeriet for forskning (godkendelse AC-2010-1129) og af de regionale Institutional Review Board Comité de Protection de personnes (CPP) 5-Sud Est (regional bord) . Alle patienter indskrevet i dette forsøg forudsat skriftligt informeret samtykke. Disse specifikke prøver blev tidligere anvendt som beskrevet i litteraturen [25, 26]. Med hensyn til de Tissue microarrays opnået fra Superbiochips Laboratories Ltd (Seoul, Korea), selskabet bekræfter, at den “menneskelige materiale er blevet fjernet eller indsamlet med donorens forudgående samtykke, og at ingen betaling overhovedet er foretaget til sidstnævnte”. Formalin-fikserede væv fra hunde brysttumorer blev opnået fra “laboratorium af animalsk histopatologi” af Nantes Veterinary School (ONIRIS). Sager kommer fra Pathology Laboratory of Veterinary Teaching Hospital of Oniris blev anvendt i denne undersøgelse. Ejernes skriftligt samtykke og godkendelse fra Oniris College of Veterinary Medicine lokale dyrevelfærd Udvalg blev opnået før inklusion. dyret pleje og anvendte protokol overholdes EU-direktivet nummer 2010/063 og den nationale franske lovgivning (dekret nr 2013-118 du 1er février 2013 relatif à la beskyttelse des animaux Udnytter à des finner Scientifiques).

Resultater

Produktion og karakterisering af rPVL

PVL er blevet fremstillet rekombinant (rPVL) i

E

.

coli

og renset i et trin på en GlcNAc-agarose søjle med en endelig udbytte på 1 mg l

-1 kultur. Når analyseret på kanin erythrocytter, lectin viste stærk hæmagglutination aktivitet ned til koncentration på 2,3 nM. Det rekombinante protein er stabilt og udviser en denatureringstemperatur på 56 ° C ved termisk ændring analyse (S2 Fig). Yderligere stabilisering af rPVL kan opnås i nærværelse af GlcNAc-holdige ligander såsom GlcNAcβ1-3Gal eller chitobiose, med en Tm på 60 ° C for begge, men ikke i nærvær af ikke-bindende carbohydrat, såsom galactose og saccharose, bekræfter GlcNAc bindende aktivitet.

rPVL er specifik for oligosaccharider med afslutning GlcNAc rester

specificiteten af ​​rekombinant PVL blev analyseret på pattedyr Trykt Array-version 5.1 med 610 glycaner, hovedsagelig fra pattedyr. Den rPVL koncentrationen blev varierende fra 0,2 mg ml

-1 til 0,2 mg ml

-1 og de fire datasæt er tilgængelige fra CFG site med primscreen_codes 5693, 5695, 5696 og 4697 (http: //www.functionalglycomics .org). Den fluorescens-signalet var fremragende og den laveste koncentration var tilstrækkeligt til bestemmelse af den stærke præference for oligosaccharider bærer en GlcNAc på deres ikke-reducerende ende (figur 2).

Hver hit er farvet i henhold til terminalen disaccharid . Repræsentative oligosaccharider er skematisk vist. Toppe angivet med en *, svarer til mindre mærkning af sialinsyre-syreafsluttet oligosaccharider. Den fulde liste af oligosaccharider med fluorescensintensiteter er tilgængelig fra CFG hjemmeside (https://www.functionalglycomics.org).

lectin bundet effektivt til GlcNAc stede i to forskellige positioner i afkortet N- glycaner: GlcNAcβ1-2Man på de centrale pentasaccharider og endnu stærkere på GlcNAcβ1-3Gal på antenne, der er udvidet med polylactosamine motiver. På grund af multivalens virkning, signalet var maksimal for multiantennary strukturer (2 til 5 antenne) med lactosamin gentagelser, hvis forekomst er relateret til cancer progression [27]. Polylactosamine bi- eller multi-antennære N-glycaner med terminal GlcNAcβ1-3Gal var bundet med fluorescens-signaler højere end 1500 RU, mens dem med terminal Galβ1-4GlcNAc er i baggrundsstøj, under 150 RUC. Ingen binding observeres for den GlcNAcβ1-4Man motiv stede i gennemskæres N-glycaner, men tilstedeværelsen af ​​denne gennemskærende GlcNAc ikke hindrer bindingen af ​​PVL til tilgrænsende GlcNAc-termineret antenne. Den lectin også bundet til mucin motiver, der bærer βGlcNAc på position 3 og 6 i en GalNAc rest (type 4). Det bundet kun svagt til chitobiose motiv (GlcNAcβ1-4GlcNAc) af chitin. Lektinet er ikke selektiv for det anomere konfiguration af GlcNAc og flere oligosaccharider med terminale αGlcNAc rester blev også mærket. Sådanne epitoper er til stede i human heparansulfat (GlcNAc α1-4IdoA) og i muciner af gastriske kirtler (GlcNAc α1-4Gal) [5], men også i klasse III mucin af karcinom væv, der udtrykker en gastrisk fænotype [28]. Den glycan matrix indeholder en række oligosaccharider med terminal GaINAc men PVL binding blev kun observeret til disaccharidet GalNAcβ1-3GalNAc (# 97) med mindre intensitet.

Siden immobiliseret vildtype PVL blev rapporteret at binde til sialylerede glycoproteiner [29], bindingen til oligosaccharider med sialylerede strukturer blev kontrolleret. Faktisk en svag binding kan observeres for biantennær N-glycaner med afslutning Neu5Acα2-3Gal epitoper (# 603 i figur 2). Niveauet af fluorescens var tæt på støjniveauet (12% af maksimums). Ikke desto mindre, når de kontrollerer de glycan array-data opnået med højere koncentration af PVL (0,1 mg ml

-1), bindingen til sialyl-oligosaccharider blev klart synlige.

affinitet rPVL for forskellige GIcNAc-holdige oligosaccharider blev testet for både frie og overfladebundne proteiner under anvendelse titrering mikrokalorimetri og overfladeplasmonresonans (tabel 1 og S3 fig). Den affinitet for GlcNAc er i samme område som der tidligere målt ved ITC med indfødte PVL isoleret fra champignon (Kd ≈200 uM) [13]. Kvantitative målinger bekræftede en stærkere affinitet for GlcNAcβ1-3Gal-terminerede strukturer end for GlcNAc og chitooligosaccharides, med dissociationskonstant på ca. 70 uM til trisaccharidet lacto-N-triose. Der blev observeret en god overensstemmelse mellem værdier målt ved begge metoder. Kun den N-glycan heptasaccharide præsentere to terminale GlcNAcβ1-2Man epitoper viste stærkere affinitet for rPVL i opløsning (Kd på 34 uM) end på SPR chip. Dette kan skyldes den bivalente af dette bestemte interaktion, der lettere kan etableres med proteinet i opløsning end fikseret på en chip. Bindingen af ​​begge terminale GlcNAc rester af det biantennær heptasaccharide blev bekræftet ved at sammenligne støkiometrien af ​​lineære GlcNAcβ1-3Gal (fem ligander pr rPVL) og biantennær heptasaccharide (to ligander pr rPVL). De termodynamik binding var også anderledes, da biantennær glycan er den eneste til at præsentere en gunstig entropi binding (tabel 1), der kunne forklares ved preorientation af de to GlcNAc rester i rummet.

Crystal struktur rPVL /disaccharid

rPVL blev krystalliseret i kompleks med GlcNAcβ1-3Gal disaccharidet der caps afkortet polylactosamine N-glycaner. Strukturen blev løst ved 1,95 Ǻ opløsning (S1 Table) og vises den forventede syv-bladet β-propel fold (Fig 3). To p-propeller er til stede i den asymmetriske enhed, men da de er meget ens, er kun kæden A beskrevet nedenfor. Den overordnede struktur af det rekombinante protein var meget lig den tidligere beskrevet for vildtype-PVL [13]. Den væsentligste forskel var tilstedeværelsen af ​​en yderligere calciumion siden rPVL præsenterer calcium i tre løkker. Klar elektrontæthed blev observeret for GlcNAcβ1-3Gal i fem bindingssteder mens site 2 kun var besat af en GlcNAc rest (Fig 3A og 3B).

A. β-propel fold af rPVL med peptidkæden repræsenteret bånd farvet fra blå (N-terminal) til grøn (C-terminal). Disaccharider er repræsenteret som stick med 2mFo-DFC elektron tæthed maps kontureret ved 1 σ (0,4 ε Å

-3). Calciumioner repræsenteret pink sfære. B. Samme propel med opløsningsmiddel tilgængelige overflade af proteinet. C og D, detaljer af interaktion i stedet en med disaccharid og vandmolekyler.