PLoS ONE: Evaluering af Medicinal Herb Graptopetalum paraguayense som behandling for Lever Cancer

Abstrakt

Baggrund

hepatocellulært carcinom (HCC) er den femte mest almindelige malignitet og den tredje mest almindelige årsag af cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. Sorafenib er det eneste lægemiddel til patienter med fremskreden fase hepatocellulært carcinom (HCC), som har vist sig at give en overlevelse fordel for patienter med HCC; men det har mange bivirkninger. Således bør udvikles alternative terapeutiske strategier med forbedret sikkerhed og terapeutiske virkning for forvaltningen af ​​HCC.

Metoder og Resultater

Vi viser, at et ekstrakt af

Graptopetalum paraguayense

( GP) nedreguleret ekspressionsniveauerne af flere kræftpsykologisk proteiner, herunder AURKA, AURKB, og FLJ10540, i HCC-celler. For at isolere de aktive komponenter i GP ekstrakter, vi forberedt ekstrakter fraktioner og vurderet deres virkninger på ekspressionen af ​​kræftpsykologisk proteiner i HCC celler. Den udpegede HH-F3 fraktion blev beriget med aktive ingredienser, udstillet cytotoksiske virkninger, og undertrykt udtryk for de kræftpsykologisk proteiner i HCC celler. Strukturen af ​​den vigtigste aktive forbindelse i HH-F3 blev fundet at svare til de proanthocyanidin forbindelser afledt af

Rosenrod

. Desuden blev en distinkt ny forbindelse rig på 3, 4, 5-trihydroxy benzyliske grupper identificeret i HH-F3 præparater. Mekanistiske undersøgelser indikerede, at HH-F3 induceret apoptose i HCC-celler ved at fremme tabet af mitochondriemembranpotential og produktionen af ​​reaktive oxygenspecies. HH-F3 forbedret også PTEN udtryk og faldt AKT-fosforylering på Ser473 i en koncentrationsafhængig måde i HCC celler. Desuden kombination af GP eller HH-F3 og sorafenib synergistisk hæmmer spredning af Huh7 celler. Behandling af en rottemodel med diethylnitrosamin (DEN) -induceret leverkræft med ekstrakter af GP og HH-F3 faldt hepatiske kollagen indhold og inhiberede tumorvækst.

Konklusioner

Disse resultater indikerer, at GP ekstrakter og HH-F3 kan beskytte leveren ved at undertrykke tumorvækst; en konsekvens heraf kan disse forbindelser overvejes til behandling af HCC

Henvisning:. Hsu W-H, Chang C-C, Huang K-W, Chen Y-C, Hsu S-L, Wu L-C, et al. (2015) Evaluering af Medicinal Herb

Graptopetalum paraguayense

som en behandling for leverkræft. PLoS ONE 10 (4): e0121298. doi: 10,1371 /journal.pone.0121298

Academic Redaktør: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, TAIWAN

Modtaget: August 19, 2014 Accepteret: 29 januar 2015; Udgivet: April 7, 2015

Copyright: © 2015 Hsu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Taiwan National Science Rådet under tilskud nummer NSC102-2627-B-010-001-, MOST103-2627-B-010- 001- og MOST103-2627-B-030-001-; Taiwan Økonomiministeriet giver numrene 99-EF-17-A-S1-152, 100-EF-17-A-S1-152, og 101-EF-17-A-S1-152); og af en bevilling fra Undervisningsministeriet, Sigt efter Top University Plan (103AC-T503). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Alkoholisme, viral hepatitis og ikke-alkoholiske steatohepatitis er de tre hyppigste årsager til kronisk leverbetændelse og skade. Kronisk leverbetændelse kan føre til lever-fibrose, cirrose og hepatocellulært carcinom (HCC), som er den mest almindelige form for leverkræft og tegner sig for 70% til 85% af de primære hepatiske maligniteter hos voksne. Mere end 80% af patienter med HCC er diagnosticeret på et fremskredent stadium af sygdommen, hvor kirurgisk behandling ikke længere er indiceret. Generelt patienter med inoperabel HCC har en dårlig prognose og sjældent gavn af ikke-kirurgiske behandlinger såsom systematisk kemoterapi eller chemoembolization [1, 2].

Unormal signalering i PI3K /PTEN /AKT pathway bidrager til udviklingen af en række leversygdomme, herunder ikke-alkoholisk fedtlever sygdom (NAFLD), ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH), alkoholisk leversygdom (ALD), viral hepatitis og HCC [3]. PI3K /PTEN /AKT pathway aktiveres ved den epigenetiske undertrykkelse af PTEN og /eller mutationer i eller amplifikation af individuelle komponenter af vejen i ca. 40-50% af patienter med HCC [4-6]. Eksperimentelt, sletning af PTEN eller overekspression af AKT i lever fra mus resulterer i steatose og tumor udvikling [7, 8]. Disse eksperimentelle observationer tyder på, at PI3K /PTEN /AKT-vejen spiller en vigtig rolle i hepatotumorigenesis.

Sorafenib, en multi-target-hæmmer, der blev godkendt til behandling af HCC i 2007 [9], er det kun standard kemoterapeutisk lægemiddel til patienter med fremskreden fase HCC [10]. Dette stof har vist sig at inhibere tumorcelleproliferation ved at blokere Ras /Raf /MAPK-vejen og angiogenese ved at blokere både VEGFR og PDGFR signalering, således at bremse væksten af ​​nye blodkar i tumoren [11]. I et dobbeltblindt, randomiseret, kontrolleret klinisk forsøg (RCT) med et primært endepunkt samlet overlevelse [12], sorafenib øgede overlevelsestiden af ​​HCC patienter fra 7,9 til 10,7 måneder [13]. Sorafenib er det eneste stof, der har vist sig at give en overlevelse fordel for patienter med HCC; men det har mange bivirkninger. I øjeblikket behandlingsmuligheder for patienter med fremskreden HCC er begrænsede. Således bør udvikles alternative terapeutiske strategier med forbedret sikkerhed og terapeutiske virkning for forvaltningen af ​​HCC.

Naturlægemidler har været anvendt i tusinder af år til at behandle en lang række sygdomme, herunder inflammatoriske sygdomme og kroniske leversygdomme (herunder hepatitis, hepatisk fibrose og HCC). I denne undersøgelse har vi fokuseret på

Graptopetalum paraguayense

(GP), en traditionel kinesisk urt, der besidder flere sundhedsmæssige fordele. Ifølge dets arkaiske kinesisk recept, GP er i stand til at lindre leversygdomme, lavere blodtryk, blege hud, lindre smerter, behandling af infektioner, hæmmer betændelse og forbedre hjernens funktion [14-16].

In vitro

undersøgelser har vist, at ekstrakter fra bladene af GP hæmme tyrosinase og angiotensin-konverterende enzym og bekæmper frie radikaler [14-16]. Uddrag fra stammen af ​​GP dyrket med celler fra den humane HCC HepG2-cellelinie er også blevet vist at udvise antioxiderende og anti-proliferative egenskaber [17]. Vandbaserede ekstrakter af GP har også vist sig at have antioxiderende og antiinflammatoriske egenskaber, der beskytter celler mod CCl

4-induceret oxidativ leverskade [18]. Data fra vores tidligere microarray profilering undersøgelse viste, at ekspression af forskellige gener relateret til metabolisme, cellevækst og /eller vedligeholdelse blev genoprettet til nær-normale niveauer i DMN-behandlede rotter behandlet med GP [19]. Vores tidligere undersøgelse viste også, at administrationen af ​​GP afbødes kemisk induceret leverskade og fibrose

in vivo

og undertrykt hepatisk stjerneformet celle (HSC) og Kupffer-celle-aktivering

in vitro

.

De ovennævnte resultater antyder, at GP kan repræsentere en terapeutisk mulighed for at behandle hepatisk inflammation og fibrose [20]. I denne undersøgelse viser vi, at GP og dets HH-F3 fraktion har anti-cancer effekt i rottemodellen af ​​diethylnitrosamin (DEN) -induceret leverkræft. Vi viser efterfølgende, at ekstrakter af GP og HH-F3 inducere apoptotisk celledød i HCC-celler, hvilket antyder, at GP og HH-F3 kan anvendes til forebyggelse eller behandling af HCC.

Materialer og Metoder

cellelinjer

Huh7 og PLC5 cellelinjer blev opnået fra Dr. Zhong-Zhe Lin, National Taiwan University Hospital, Taiwan. HepG2-cellelinje blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, https://www.atcc.org/en.aspx). Mahlavu cellelinjer blev leveret af Dr. Muh-Hwa Yang, Klinisk Institut, National Yang-Ming University, Taiwan. Menneskelig hepatocyt blev købt fra ScienCell Research Laboratories (https://www.sciencellonline.com/~~number=plural).

GP og

Rosenrod

ekstraktion, oprensning og karakterisering

GP blade blev formalet og lyofiliseres til et pulver ved -20 ° C og lagres i en fugt buster ved 25 ° C før ekstraktion. Først blev 1,5 g GP pulver vortexet med 10 ml 100% methanol (MeOH) i 5 min og centrifugeret ved 1.500

g

i 5 min. Supernatanten blev fjernet og forskellige ekstrakter blev fremstillet ved at resuspendere pillerne i 10 ml H

2O, 100% acetone, 100% methanol, 100% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, 100% DMSO eller 30 % DMSO. Suspensionen blev hvirvelbehandlet i 5 min, centrifugeret to gange ved 1500

g

i 5 min, centrifugeret igen ved 9.300

g

i 5 minutter og filtreres gennem et 0,45 um filter i en laminær strømning ved stuetemperatur. 30% DMSO supernatant blev enten opbevaret ved -20 ° C som en 150 mg /ml stamopløsning (benævnt 30% DMSO GP-ekstrakter) eller fraktioneret i fire fraktioner (F1-F4) ved anvendelse af en Sephadex LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sverige) søjle (fremgangsmåde I). For at forenkle forberedelse protokoller, blev direkte dialyse af de 30% DMSO GP ekstrakter mod vand også forpligtet sig (metode II). Kolorimetriske assays på 30% DMSO GP ekstrakter til identifikation af hydrolyserbare og kondenserede tanniner blev udført [21]. HCC-celler blev behandlet med ekstrakterne, og AURKA, AURKB og FLJ10540 proteinniveauer blev analyseret ved Western blot; aktive molekyler i F3 fraktion (benævnt HH-F3 fraktion) blev identificeret. fraktion HH-F3 blev yderligere analyseret ved HPLC med en UV-detektor (Shimadzu SPD-M10A), en normal fase-HPLC-søjle (Phenomenex Luna 5u Silica (2) 100A, 4,6 x 250 mm) og

1H- og

13C-NMR-spektre for at identificere strukturen af ​​de aktive molekyler. GP ekstrakter og HH-F3 fraktionen blev også udsat for dialyse mod vand under anvendelse af en dialysemembran (MWCO 12-14.000) (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) til opnåelse af aktive forbindelser.

Rosenrod

planter blev lyofiliseret til et pulver og opbevaret i et fugt buster ved 25 ° C før ekstraktion. En 1,5 g prøve af

Rosenrod

pulver blev opløst i 10 ml H

2O, centrifugeret ved 1.500

g

i 5 minutter og filtreres gennem et 0,45 um filter i det laminare flow hætte ved stuetemperatur. Prøverne blev opbevaret ved -20 ° C som 150 mg /ml stamopløsninger.

Western blot

Lysaterne af HCC-celler blev underkastet SDS-PAGE for at løse de udtrykte proteiner og overføres til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner ved anvendelse af et Bio-Rad transfersystemet. Efter overførsel blev membranerne farvet med Ponceau S for at bekræfte effektiviteten og ensartetheden af ​​proteinet overførsel. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri skummetmælk ved stuetemperatur i 30 minutter og inkuberet med det primære antistof ved 4 ° C natten over. Efterfølgende blev membranerne vasket tre gange (10 min hver) med 1x Tris-pufret saltvand indeholdende Tween-20 (TBST) og inkuberet med HRP-konjugeret sekundære antistoffer i 2 timer. HRP substrat peroxidopløsning /luminol reagenser (Immobilon Western Chemiluminescent Substrate, Millipore, blandet i et 1: 1 forhold) blev tilsat, og det sekundære antistof signaler på membranerne blev visualiseret med en Fujifilm LAS4000 luminescerende billedanalysesystem. De følgende primære antistoffer blev anvendt: anti-PTEN, anti-AKT, anti-p70S6k, anti-caspase 3 og anti-PARP (Cell Signaling); anti-BCL2, anti-Bd-XL og anti-caspase 9 (GeneTex); anti-AURKA og anti-AURKB (BD Biosciences); og anti-FLJ10540 (Abnova). Alle antistoffer blev anvendt i en fortynding på 1:. 1.000

levedygtighedsassay

Cellerne blev podet i 24-brønds plader (4.000-5.000 celler /brønd) natten over og derefter behandlet med 30% DMSO GP ekstrakter eller HH-F3 fraktion til 0, 24, 48, eller 72 timer. Efter behandling blev cellerne forsigtigt vasket 3 gange med 1 x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na

2HPO

4, 2 mM KH

2PO

4) og derefter inkuberet med 0,5 ug /ml 3- (4,5-cimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT, Sigma-Aldrich) i 2 timer. Mediet blev fjernet, og de dybe blå krystaller blev opløst med 100% DMSO ved stuetemperatur i 10 minutter. OD-værdierne blev målt ved 570 nm med en ELISA-læser.

celletælling

Cellerne blev podet i plader med 12 brønde (10.000-20.000 celler /brønd) og inkuberet natten over. Den næste dag blev cellerne behandlet med HH-F3 fraktionen i 0, 24, 48 eller 72 timer. Cellerne blev derefter trypsiniseret, behandlet med 0,4% trypanblåt og talt.

Cellecyklusanalyse og flowcytometri

Efter at cellerne var blevet trypsineret og vasket tre gange med PBS, blev de centrifugeret ved 800

g

i 5 min. Cellerne blev derefter resuspenderet i 70% ethanol i PBS og opbevares ved -20 ° C i mere end 16 timer. Cellerne blev centrifugeret ved 800

g

i 5 minutter, og cellepellets blev resuspenderet i kold PBS indeholdende 100 ug /ml RNAse A (Sigma-Aldrich) i 20 min. Cellerne blev derefter farvet med 20 pg /ml propidiumiodid (PI, Sigma-Aldrich) i 20-30 min, og DNA-indholdet blev målt og analyseret under anvendelse af en BD FACSCanto og Flow Jo analyse software hhv.

mitokondrie membranpotentiale assay

mitochondriemembranpotential blev analyseret under anvendelse af 5, 5 ‘, 6, 6′-tetrachlor-l, 1′, 3, 3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodid (JC-1) indkøbt fra Cayman Chemical Co. de dyrkede celler blev podet i 96-brønds sorte plader ved en densitet på 7.000 celler /brønd, inkuberet natten over og behandlet med eller uden HH-F3 fraktion i 48 timer. JC-1-farvning opløsning blev tilsat til hver brønd og blandet forsigtigt ved 37 ° C i 15-30 minutter i mørke. Pladerne blev centrifugeret ved 400

g

ved stuetemperatur i 5 min, og supernatanten blev fjernet fra hver brønd. JC-1 assaybuffer blev tilsat til hver brønd blev pladerne centrifugeret i 5 minutter ved 400

g

ved stuetemperatur, og supernatanten blev fjernet fra hver brønd. Endelig JC-1 assaybuffer blev tilsat til hver brønd, og pladerne blev analyseret ved anvendelse af en fluorescerende pladelæser.

Måling af ROS-niveauer

Den intracellulære generation af superoxidradikaler (O

2

-) blev bedømt ved hydroethidine fluorescens (AAT Bioquest, Inc.). Cellerne blev behandlet med eller uden HH-F3 fraktion i 48 timer. Hydroethidine (10 uM) blev tilsat til hver brønd og blandet forsigtigt i 30-60 min ved 37 ° C i mørke. Cellulær fluorescens blev monitoreret ved en excitationsbølgelængde på 520 nm og en emissionsbølgelængde på 610 nm. Intracellulære peroxid-niveauer blev målt under anvendelse af dichlorfluorescein (DCFH) diacetat (markørgen Technologies, Inc.). Efter at cellerne var blevet behandlet med HH-F3 fraktionen i 48 timer blev mediet aspireret, og cellerne blev vasket to gange med PBS. Cellerne blev derefter inkuberet med DCFH ved en slutkoncentration på 20 uM i serum-frit medium i 30-60 min ved 37 ° C i mørke, igen vasket med PBS og holdt i 200 pi kulturmedium. Cellular fluorescens blev overvåget ved en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emission bølgelængde på 528 nm.

Dyr, den eksperimentelle miljø, og protokol

Animal Care og Brug udvalg af College of Medicine , National Taiwan University, godkendt alle forsøgsprotokoller. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for dyr pleje af universitetet.

Et hundrede og tyve seks uger gamle Wistar albinorotter (150-180 g) blev anvendt. Alle dyr fik lov til at akklimatisere i syv dage, og såfremt standard chow og vand

ad libitum

under forsøgsperioden.

Rotterne blev tilfældigt tildelt til den normale gruppe (N = 10), den diethylnitrosamin (dEN) gruppe (N = 30), lav-dosis GP-gruppe (N = 30) eller højdosis GP-gruppe (N = 30). Fem yderligere rotter blev inkluderet i HH-F3-behandlede gruppe. For alle grupper undtagen normalgruppen, den eneste kilde til drikkevand i 63 dage var en vandig opløsning af 100 ppm (v /v) DEN (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), der blev ændret dagligt; begyndende på dag 64 blev rotterne forsynet med postevand i yderligere 14 dage. Hulen opløsning blev fremstillet hver uge og bestod af en individualiseret dosis beregnet efter den vægtforøgelse /tab oplevet af dyret som respons på den tidligere dosis. blev observeret levertumorer startende på dag 42, og blev observeret leverfibrose startende på dag 63. Under forsøgsperioden blev dyrene vejet ugentligt at beregne vægtforøgelse; Desuden blev den mængde vand, der forbruges af rotterne målt hver uge. Rotterne i lavdosis gruppe modtog 0,6 g /rotte af frysetørret GP pulver; rotterne i højdosis gruppe modtog 1,8 g /rotte af lyofiliseret GP pulver; rotterne i HH-F3 gruppe modtog 0,036 g /rotte af lyofiliseret HH-F3 pulver hver dag i tre uger begyndende på dag 42.

Høst procedure og morfologisk evaluering af leveren

Alle dyrene blev aflivet på dag 84. dyrene blev fastet natten over og aflives ved CO

2 inhalation. Efter rotterne var blevet ofret, blev deres organer, lever og milt vejes; en midterlinjen laparotomi blev udført, og betingelserne for de organer blev noteret ved obduktion. Alle kamre af leveren blev straks høstet og grundigt undersøgt for at beskrive overfladen af ​​leveren og til karakterisering af udviklingen af ​​liver foci, vedvarende knuder (PNS) eller cancer ved hvert tidspunkt. Efterfølgende blev leveren skåret i 5 mm sektioner. Alle makroskopisk synlige knuder på leveren overfladen og i 5 mm snit blev talt og målt.

Tumor byrde vurdering

At etablere forløbet af tumor udvikling i dyr udsat for DEN, alle kamre af leveren blev straks høstet, og alle makroskopisk synlige knuder på leveren overfladen og i 5 mm snit blev talt og målt. Lever tumor byrder blev bestemt ved at anslå summerne af de mængder af alle tumor knuder større end 3 mm i diameter for hvert dyr; de tumorbelastninger blev derefter sammenlignet mellem grupperne.

Bile strømningshastighed

Inden aflivning blev dyrene bedøvet med 80 mg /kg af ketamin og deres galde strømningshastighed blev målt med et PE10 silicium rør anbragt i den fælles galdegang og forbundet til en beregnet polyethylenrør. Bile flow ind i røret blev målt til 5-minutters intervaller.

Histopatologisk evaluering

Efter at blodet var blevet drænet, 5 mm tykke vævssnit indeholder tumorer blev dissekeret fra hver lap af lever. Sektioner (5 um) blev skåret og farvet med hematoxylin og eosin til histopatologisk analyse ved hjælp offentliggjort diagnostiske kriterier.

immunhistokemisk farvning for α-glatmuskelactin (α-SMA)

De leverprøver var fikseret med formalin, indlejret i paraffin og skåret i 5-um snit. Snittene blev deparaffineret, rehydreret og behandlet med 0,03% hydrogenperoxid i 10 min for at standse endogen peroxidaseaktivitet. Efter to gange vask med PBS blev snittene inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med en muse-anti-humant α-SMA monoklonalt antistof (1:50 fortynding, Dako Cytomation, Danmark). For α-SMA-farvning blev sektionerne vasket og inkuberet med et sekundært kanin-anti-muse-IgG-antistof (1: 200 fortynding) ved stuetemperatur i 1 time. Snittene blev derefter fremkaldt på lignende måde. Efter farvning blev snittene kontrastfarvet med hematoxylin til mikroskopi analyser. Procentdelen af ​​α-SMA-positive områder (mm

2 /cm

2 af lever sektion) blev bestemt ved hjælp af en HC-2500 digitalt kamerasystem (Fuji Photo Film), Adobe Photoshop-version 5.0J og Image-Pro plus-versionen 3.0.1J

Assay for hydroxyprolinindholdet i leveren

lever prøver blev vejet, og 20 mg af de frosne prøver blev hydrolyseret i 20 ml 6 N HCI og omhyggeligt jorden.; 6 N HCI blev derefter tilsat til opnåelse af et samlet volumen på 30 ml /mg væv. Det formalede væv blev hydrolyseret ved 120 ° C i 16 timer. Efter en kort periode med afkøling på is og centrifugering ved 8.000

g

i 10 min, supernatanten blev fjernet og anbragt i et nyt rør; volumenet tabte til fordampning blev efterfyldt med vand. Et tilsvarende volumen af ​​6 N NaOH blev tilsat og blandet, og pH af opløsningen blev indstillet til pH 4-9 ved anvendelse af lakmuspapir. Fyrre mikroliter af neutraliserede prøve blev tilsat til brøndene i en 96-brønds ELISA-plade og oxideres ved anvendelse af en opløsning indeholdende 5 ml 7% chloramin T (Sigma-Aldrich) og 20 ml acetat /citratbuffer. Et hundrede og halvtreds milliliter Ehrlichs opløsning blev tilsat. Den endelige blanding blev inkuberet ved 60 ° C i 35 min og ved stuetemperatur i 10 minutter; absorbansen blev derefter bestemt ved 560 nm. Standardopløsninger indeholdende 100, 80, 60, 40, 20 og 0 mg /ml autentisk 4-hydroxy-L-prolin (Sigma-Aldrich), blev behandlet på en lignende måde. Standardkurven var lineær i dette område af koncentrationer (

r

= 0,99). Den hepatiske hydroxyprolin niveau blev udtrykt som mg hydroxyprolin /g våd levervægt. Alle assays blev udført tre gange.

Statistisk analyse

Alle resultater blev udtrykt som middelværdien ± standardfejlen på middelværdien. Signifikansniveauer blev bedømt ved to-halet parrede Students

t

-test eller envejs variansanalyse (ANOVA).

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Anti-proliferative virkninger af forskellige GP præparater på Huh7 og Mahlavu celler

For at teste de potentielle biologiske virkninger af GP, diverse GP ekstrakter blev fremstillet under anvendelse af vand, butanol, acetone, methanol, 100% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, 100% DMSO eller 30% DMSO og anvendt til behandling af humane HCC-celler. Vækstinhiberingen induceret af de forskellige GP ekstrakterne blev undersøgt. Data fra MTT-assays viste, at 30% DMSO ekstrakter signifikant reduceret levedygtighed Huh7 og Mahlavu celler (figur 1A); mere specifikt koncentrationer på 500 og 250 ug /ml resulterede i 50% inhibering af cellelevedygtighed (IC

50) 72 timer efter behandling for Huh7 og Mahlavu celler, (fig 1B).

Huh7 og Mahlavu celler blev behandlet med GP ekstrakter fremstillet i vand, butanol, acetone, methanol, 100% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, 100% DMSO eller 30% DMSO i koncentrationer på 100, 150, 250, 500, 750 , 1000 og 1500 pg /ml i 72 timer. Levedygtigheden af ​​de behandlede celler blev bestemt ved anvendelse MTT-assays. De 30% DMSO GP ekstrakter var forbundet med den største hæmning af væksten af ​​Huh7 og Mahlavu celler efter 72 timer. (B) Huh7 og Mahlavu celler blev behandlet med koncentrationer på 0, 250, 500, 750 og 1000 ug /ml af 30% DMSO GP ekstrakter til 24, 48 og 72 timer, og MTT-assays blev udført. IC koncentrationer af 30% DMSO GP

50 Ekstrakter til vækstinhibering af Huh7 og Mahlavu celler var ca. 500 og 250 pg /ml efter 72 timers behandling. (C) HepG2 og Huh7 celler blev behandlet med GP ekstrakter fremstillet i 30% DMSO, vand eller butanol (BuOH) i 48 timer. Niveauerne af AURKA, AURKB og FLJ10540 blev målt ved Western blot-analyse. Ekspressionsniveauerne af AURKA, AURKB og FLJ10540 i HepG2 og Huh7 celler blev undertrykt af de 30% DMSO GP ekstrakter, men ikke af de fraktioner, der tilberedes i vand eller butanol. (D) HepG2-celler blev behandlet med 75 ng /ml af den synkroniserende agent nocodazol (NOC) i 18 timer; cellerne blev derefter behandlet med 750 ug /ml af 30% DMSO GP ekstrakter eller vehikelkontrol (30% DMSO) i yderligere 3 timer. Western blotting blev udført ved anvendelse af anti-FLJ10540, anti-AURKA og anti-AURKB antistoffer. (E) HepG2-celler blev behandlet med de 30% DMSO GP ekstrakter og fraktioner deraf (HH-F1, HH-F2, HH-F3 og HH-F4) i 3 timer. AURKA og AURKB ekspressionsniveauerne i HepG2 celler blev undertrykt af HH-F3 fraktionen men ikke af de andre fraktioner. (F) Huh7, Mahlavu og PLC5 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af HH-F3 i 48 timer. Ekspressionen af ​​AURKA og FLJ10540 proteiner blev vurderet ved immunoblotanalyse. HH-F3 reducerede AURKA og FLJ10540 protein niveauer i en koncentrationsafhængig måde.

GP reducerer AURKA, AURKB og FLJ10540 protein udtryk niveauer under både interfase og mitose i aktiverede hepatiske stjerneformige celler og HCC-cellelinjer

AURKA, AURKB og FLJ10540 er onkogener, der er almindeligt overudtrykt i HCC [22-24]. Tilfældigvis, fandt vi, at de 30% DMSO GP ekstrakter hæmmede protein ekspressionsniveauer af FLJ10540, AURKA og AURKB i HCC-cellelinier (HepG2 og Huh7) i en koncentrationsafhængig måde (figur 1C, S1 Fig). I modsætning hertil GP ekstrakter fremstillet i enten vand eller butanol ikke hæmme protein ekspressionsniveauerne af AURKA eller AURKB i HepG2-celler efter 72 timers behandling (Fig 1C). Det er velkendt, at ekspressionsniveauerne af AURKA, AURKB og FLJ10540 er højere under metafase end under interfase [25-27]. Vi undersøgte derfor, om de 30% DMSO GP ekstrakter kunne inhibere ekspressionen af ​​disse proteiner under mitose i HCC-celler. HepG2-celler blev først behandlet med 75 ng /ml nocodazol i 18 timer; disse celler blev derefter behandlet med 30% DMSO GP ekstrakter i 3 timer (uden udvaskning af nocodazol). AURKA, AURKB og FLJ10540 ekspressionsniveauerne var højt under mitose. I celler behandlet med 30% DMSO GP ekstrakter blev protein ekspressionsniveauer af AURKA, AURKB og FLJ10540 faldt i interfase og metafase (figur 1D); derimod blev der ikke observeret nogen signifikante ændringer i ekspressionsniveauerne af andre mitotiske proteiner (PIN1, HURP og PLK) (data ikke vist).

HH-F3 undertrykker AURKA proteinekspression i HCC-cellelinjer

Dernæst anvendelse af en Sephadex LH-20-søjle, vi opnåede fire fraktioner fra de 30% DMSO GP ekstrakter (S2A Fig). Western blot-analyse udført 3 timer efter behandlingen viste, at kun den tredje fraktion (HH-F3) undertrykte ekspressionen af ​​AURKA og AURKB i HepG2-celler (figur 1E). Derefter blev Huh7, Mahlavu og PLC5 celler behandlet uden eller med 25, 50 og 75 ug /ml af HH-F3 fraktion i 48 timer. Ekspressionen af ​​AURKA og FLJ10540 i alle tre HCC-cellelinier blev signifikant undertrykt af HH-F3 (fig 1F). For at undersøge om de hæmmende virkninger af HH-F3 fandt sted på det transkriptionelle niveau, vi undersøgte variationen i genekspression niveauer af

FLJ10540

AURKA

,

AURKB

AURKC

(medlemmer af Aurora kinase familie af gener). HepG2-celler blev behandlet med 50 ug /ml HH-F3 fraktionen i 6 timer, og genekspression og proteinniveauer blev målt ved mikroarray (U133A chip, Affymetrix) og Western blot hhv. Var der næsten ingen ændring i genekspressionsniveauer af nogen af ​​de ovennævnte gener efter behandling med HH-F3; dog fald i proteinniveauer blev observeret (data ikke vist). Disse resultater antyder, at HH-F3 fraktionen reguleres ekspressionen af ​​FLJ10540 og Aurora kinase familien molekyler på det translationelle niveau i stedet for på det transkriptionelle niveau.

Identifikation af de aktive bestanddele i GP

at forenkle udarbejdelsen protokoller, blev anvendt en anden metode (metode II) ved direkte dialyse af 30% DMSO GP ekstrakter mod vand. De fysisk-kemiske egenskaber af forbindelserne opnået ved fremgangsmåde II er anført i S1 tabel, og disse data viste, at de opnåede metode fraktion I (den metode, der oprindelig anvendt til fremstilling af HH-F3) og Metode II var identiske. Efter frysetørring, karakteristisk lyserød farve og delvis sølv metal-lignende glans af HH-F3 fraktionen blev observeret. Ifølge de udvidede aromatiske signaler i

1 H og

13C NMR-spektre blev de vigtigste komponenter i HH-F3 fraktionen identificeret som polyphenolforbindelser; mere specifikt, tanniner. En kolorimetrisk assay (OD

500) til kvantificering af den kondenserede tannin hjælp catechin som standard viste, at det samlede indhold af HH-F3 fraktion tannin var ca. 68% (data ikke vist). HPLC fingeraftryk af HH-F3 fraktion (S2 Fig 2B) viste, at denne fraktion indeholdt to grupper af forbindelser (gruppe A og B) med distinkte områder af molekylvægte; Gruppe B indeholdt en større og en mindre bestanddel. Disse resultater afslørede HH-F3 fraktion var rig på kondenserede tanniner og indeholdt forbindelser med høj molekylvægt.

(A) human hepatocyt blev behandlet med forskellige koncentrationer af 30% DMSO GP ekstrakter /HH-F3 for 72 hrs. Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD) af tre uafhængige forsøg. Huh7, Mahlavu og PLC5 celler blev behandlet med 5, 25, 50 og 75 ug /ml HH-F3 fraktionen på i 24, 48 og 72 timer derefter underkastet MTT-assayet (B) og trypanblåt assay (C). IC

50 koncentrationer af HH-F3 for vækstinhibering af Huh7, Mahlavu og PLC5 celler blev ca. 50, 37,5 og 75 ug /ml, efter 72 timers behandling.

fordi ingen polymere forbindelser endnu er blevet isoleret fra GP, polyphenolforbindelserne fra

Rosenrod

(gylden rod), en anden urt af Crassulaceae familien, blev anvendt som referenceforbindelser for den strukturelle identifikation af forbindelser i HH- F3 fraktion.

R

.

rosea

er blevet rapporteret at indeholde kondenserede tanniner (CTS). De kemiske egenskaber af de vigtigste forbindelser i HH-F3A sub-fraktion, både fra Metode I og II, var meget lig dem af CTS i

R

.

rosea

(golden rod). Hertil kommer, fordi CT-forbindelser ofte findes i mange fælles drue arter,

Vitis vinifera

CT’er blev også brugt som referencestoffer. S1 Tabel resuméer de fysisk-kemiske egenskaber af polymere proanthocyanidin fra

R

.

rosea

og

Vitis vinifera

. Dens høje forhold i 3, 4, 5-trihydroxy benzyliske substituenter af HH-F3A (identificeret ved de

13C kemiske skift ved 105 ppm og 109 ppm for C-2 ‘/6’ og C-2 “/6” af egcg enhed, fig spektre ikke vist) var meget lig den for forbindelsen fundet i

R

.

rosea

, men meget højere end den forbindelse, der findes i drue skind og frø (se S1 tabel). Følgelig CT præsenteret i HH-F3A blev foreslået som et polymert proanthocyanidin med en dominative prodelphinidin gentagelsesenhed og (4 → 8) -bindinger (se S2C Fig).