PLoS ONE: En WKYMVm-indeholdende Kombination fremkalder potent anti-tumor aktivitet i Heterotop Cancer Animal Model

Abstrakt

Udviklingen af ​​effektive anti-cancer terapi har været et emne for intens interesse i flere årtier. Kombineret administration af visse molekyler og immunceller har vist sig at være en effektiv form for anti-cancer terapi. Her har vi undersøgt virkningerne af at administrere en immunstimulerende peptid (WKYMVm), 5-fluor-uracil (5-FU), og modne dendritiske celler (MDC’er) mod heterotopisk cancer dyremodel. Administration af den tredobbelte kombination stærkt reduceret tumorvolumen i CT-26-inokuleret heterotopisk cancer dyremodel. Den inducerede anti-tumor-aktiviteten blev godt korreleret med FAS udtrykkelse, caspase-3 aktivering, og kræft celle apoptose. Den tredobbelte kombination behandling forårsagede rekruttering af CD8 T-lymfocytter og naturlige dræberceller (NK) celler i tumoren. Produktionen af ​​to cytokiner, IFN-γ og IL-12, blev kraftigt stimuleret ved indgivelse af den tredobbelte kombination. Udtømning af CD8-T-lymfocytter eller NK-celler ved administration af anti-CD8 eller anti-asialoGM1 antistof inhiberede anti-tumor aktivitet og cytokinproduktion af den tredobbelte kombination. Den tredobbelte kombination inhiberede kraftigt metastase af colon cancerceller i en heterotopisk cancer dyremodel samt i en metastatisk cancer dyremodel, og øget overlevelsesraten for musene model. Adoptiv overførsel af CD8 T-lymfocytter og NK-celler yderligere øget overlevelsesraten. Tilsammen foreslår vi, at brugen af ​​tredobbelte kombinationsbehandling af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er kan have konsekvenser i fast tumor og metastase behandling

Henvisning:. Kim SD, Lee HY, Shim JW, Kim HJ , Baek SH, Zabel BA, et al. (2012) En WKYMVm-indeholdende Kombination fremkalder potent anti-tumor aktivitet i Heterotop Cancer Animal Model. PLoS ONE 7 (1): e30522. doi: 10,1371 /journal.pone.0030522

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: August 12, 2011; Accepteret: 18. december 2011; Udgivet: 25 januar, 2012 |

Copyright: © 2012 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en bevilling fra National Research Udviklingsprogram for Cancer Control Ministeriet for sundhed, velfærd og Familie anliggender, Republikken Korea (0920220) (Y-SB); Grundforskningsfond Korea yder støtte finansieret af Sydkorea regering (2009 0093198) (Y-SB); og National Institutes of Health give AI-079.320 (BZ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Udvikling af anti-cancer behandling har været et vigtigt emne i flere årtier [1], [2]. Behandling med anticancermidler er en af ​​de mest udbredte anvendte former for antitumorterapi. Forskellige anticancermidler er blevet udviklet, herunder 5-fluor-uracil (5-FU) [3]. Mekanistisk er anticancermidler blevet rapporteret at forårsage apoptose af cancerceller, som inducerer initiering af anti-cancer immunresponser [4]. I værtens immunsystem, dendritiske celler (DC’er) synes at spille en central rolle i anti-tumor aktivitet. DC’er genkende og optagelse tumorantigener, og præsentere de forarbejdede antigener på de større histokompatibilitetskompleks molekyler [5], [6], [7]. Således kan DC’er stimulere T-lymfocytter, hvilket resulterer i cytotoksisk T-lymfocyt-aktivitet. DC’er også udskiller adskillige cytokiner der er vigtige i effektiv anti-tumor-aktivitet [7].

WKYMVm blev identificeret som et immunstimulerende syntetisk peptid fra et peptidbibliotek screening [8], [9]. WKYMVm stimulerer leukocytiske celler, såsom monocytter, neutrofiler, naturlige dræberceller (NK) -celler, og DCS [9], [10], [11], [12]. På grund af monocyt- og neutrofil stimulering, kemotaktisk migration, superoxid anion produktion, og produktionen af ​​visse inflammatoriske mediatorer, såsom leukotrien B

4 induceres af WKYMVm [9], [13], [14]. NK-celle-stimulering med WKYMVm resulterer i cytolytisk aktivitet og kemotaktisk migration [11]. Peptidet stimulerede kemotaktisk migration af DC’er [12]. Tre medlemmer af formylpeptidreceptor (FPR) familie er blevet rapporteret at være kognitive celleoverfladereceptorer for WKYMVm i mennesker [15], [16]. Mus FPR er også blevet rapporteret til at fungere som en WKYMVm receptor [17]. Selv WKYMVm er blevet rapporteret til at stimulere leukocytter som spiller vigtige roller mod kræft-antigener, er lidt kendt om den rolle, WKYMVm i anti-cancer aktivitet.

Kombineret administration af visse molekyler kan fremkalde effektiv anti-cancer aktivitet. Selvom forskellige anti-cancer midler eller anti-cancer behandlinger er blevet rapporteret, udvikling af nye anti-cancer behandlinger, der er effektive og specifikke med lav toksicitet er stadig nødvendigt. I dette studie undersøgte vi den terapeutiske aktivitet af WKYMVm når det blev administreret med et anti-cancermiddel (5-FU) og en naturlig vaccineadjuvans (modne DC’er, MDC’er). Virkningsmekanismen af ​​den tredobbelte kombinationsbehandling var også præget.

Resultater

Kombineret administration af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er forårsager anti-tumor aktivitet i heterotopisk kræft dyremodel

Det formodede anti-tumor aktiviteten af ​​WKYMVm, 5-FU, eller MDC’er blev undersøgt. WKYMVm, 5-FU, eller MDC’er blev først administreret enkeltvis. For eksempel som vist i fig. 1A, blev WKYMVm (100 ug /hoved) injiceret fire gange med 12 timers intervaller. Enkelt administration forårsagede et mindre fald i tumor volumen (fig. 1B). Når midlerne blev testet i par (WKYMVm + 5-FU; WKYMVm + MDC’er; MDC’er + 5-FU) mod en dyremodel, antitumoraktivitet blev forøget (fig 1B.). Tilstedeværelsen af ​​5-FU viste sig yderligere at forstærke antitumor-aktivitet (fig. 1B, 5-FU + WKYMVm og 5-FU + MDC’er). Desuden, når den tredobbelte kombination (WKYMVm + 5-FU + MDC’er) blev administreret til heterotopisk kræft dyremodel, blev den mest potente anti-tumor aktivitet observeret (fig. 1B).

(A) Protokol til studiet af antitumoraktiviteten af ​​WKYMVm, 5-FU, og MDC’er. (B) Den tredobbelte kombination af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er har den mest potente anti-tumor aktivitet. CT-26-celler (5 x 10

5-celler i 100 pi PBS) blev injiceret s.c. i den højre flanke af Balb /c-mus (n = 8) på dag -3. Musene blev behandlet ifølge protokollen i (A). Tumorvolumen blev målt, og data er vist som middelværdien ± SEM (n = 8).

***,

P

. 0,001 sammenlignet med kontrolgruppen

Kombineret administration af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er fremkalder tumor apoptose

Da tumor apoptose er nært beslægtet med antitumoraktivitet, blev virkningen af ​​hver administration på tumor apoptose målt. Som vist i fig. 2, enkelt administration af WKYMVm, 5-FU, eller MDC’er inducerede lave niveauer af tumor celledød, og dobbelt kombinationer viste yderligere stigning i celledød, med den tredobbelte kombination resulterer i dramatisk forøget tumor celledød i heterotopisk cancer dyr model (Fig . 2). Tunel-positive celler faldt sammen med FAS udtrykkelse, hvilket indikerer, at tumorcelledød observeret skyldes apoptose (fig. 2). Caspase-3-aktivitet efter behandling blev bestemt ved immunfluorescensfarvning ved anvendelse af anti-phospho-caspase-3-antistof. I overensstemmelse med TUNEL farvning og FAS udtrykkelse resultater, caspase-3-aktivering øges som antallet af kombinerede midler forøget med den tredobbelte kombination WKYMVm + 5-FU + MDC’er inducere en dramatisk stigning i caspase-3-aktivitet (fig. 2). Niveauerne af tumorcelle apoptose og caspase-3-aktivitet korrelerer godt med data tumorvolumenet i fig. 1B.

Balb /c-mus blev inokuleret med CT-26-celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og MDC’er ifølge protokollen i fig. 1A. Mus blev aflivet 42 dage efter inokulation af tumor og tumorer blev kirurgisk fjernet, og forarbejdet til hematoxylin og eosin-farvning, immunhistokemi for FAS-farvning, caspase-3-farvning, og TUNEL-farvning, som beskrevet i Materialer og Metoder. De præsenterede data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Administration af den tredobbelte kombination forårsager rekruttering af CD8 T-celler og NK-celler ind i tumoren

For at indlede en anti-tumor immune reaktion, behøver leukocytiske celler, der skal rekrutteres til tumorområdet [18]. Da administration af den tredobbelte kombination (WKYMVm + 5-FU + MDC’er) fremkaldte kraftig anti-tumor-aktivitet mod heterotopisk cancer dyremodel, undersøgte vi, hvilke typer af celler rekrutteres ind i tumoren ved immunhistokemi under anvendelse af anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD11 eller anti-DX5-antistof. Administration af den tredobbelte kombination forårsagede dramatisk rekruttering af CD8 T-lymfocytter og NK-celler i tumoren området, samt mindre rekruttering af CD4 T-lymfocytter (Fig. 3A).

(A) Balb /c-mus blev inokuleret med CT-26 celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og MDC’er henhold til protokollen i fig. 1A. CD8 T-celler, CD4 T-celler eller NK-celler blev depleteret ved i.p. injektion af 100 ug af anti-CD8 (B), anti-CD4 (C) eller anti-asialoGM1 antistof (D) ind i Balb /c mus. Mus blev aflivet 42 dage efter inokulation af tumor og tumorer blev kirurgisk fjernet, og forarbejdet til immunfarvning under anvendelse af anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, og anti-asialoGM1 antistoffer, som beskrevet i Materialer og Metoder. CD3

+ CD8

+ -celler, CD3

+ CD4

+ -celler, og CD11b

+ DX5

+ -celler indikerer CD8 T-lymfocytter, CD4 T-lymfocytter og NK-celler, henholdsvis . De præsenterede data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Administration af anti-CD8 monoklonalt antistof før den tredobbelte kombination forårsagede dramatisk hæmning af CD8 T-lymfocyt rekruttering til tumorområdet, uden at påvirke NK-celle rekruttering ( fig. 3B). Når anti-asialoGM1 antistof blev administreret før injektion af den tredobbelte kombination, blev NK-celle rekruttering ind i tumoren området stærkt blokeret, men CD8 T-lymfocyt rekruttering blev ikke påvirket (fig. 3D). Anti-CD4-antistof administrering før injektion af den tredobbelte kombination påvirkede ikke CD8 T-lymfocyt eller NK-celle rekruttering (fig. 3C).

CD8 T-celler og NK-celler spiller vigtige roller i antitumoraktiviteten af den tredobbelte kombinationsbehandling

til effektiv aktivering af anti-cancer-aktivitet i et forsøgsdyr, flere leukocyt typer kommunikere med hinanden og handle samordnet for. Vi undersøgte det relative bidrag af individuelle leukocyt typer på antitumoraktiviteten induceret af tripel kombinationsbehandling, ved administration af antistoffer mod hver leukocyt. Når anti-CD8-antistof blev administreret til heterotopisk cancer dyremodel, anti-tumor aktiviteten af ​​den tredobbelte kombination var næsten fuldstændig hæmmet (fig. 4A). Administration af anti-asialoGM1 antistof fremkaldte partiel inhibering af anti-tumor aktiviteten af ​​den tredobbelte kombinationsbehandling (fig. 4B). Men administration af anti-CD4-antistof ikke påvirke antitumoraktivitet af den tredobbelte kombination (data ikke vist). Disse resultater indikerer, at CD8 T-celler og NK-celler spiller vigtige roller i anti-tumor aktivitet af den tredobbelte kombination af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er.

Balb /c-mus blev inokuleret med CT-26-celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og MDC’er henhold til protokollen i fig. 1A. CD8 T-celler eller NK-celler blev depleteret ved i.p. injektion af 100 ug af anti-CD8 (A) eller anti-asialoGM1 antistof (B) i Balb /c mus. Tumorvolumen blev målt, og data er vist som middelværdien ± SEM (n = 8).

*,

P

0,05,

***,

P

. 0,001 sammenlignet med kontrolgruppen

administration WKYMVm, 5-FU, og MDC’er tredobbelt kombination fremkalder en ændring af cytokin profil i en heterotopisk kræft dyremodel

Vi testede, om administration af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er i forskellige kombinationer forårsager ændringer i cytokin profil sammenlignet til kontrol tumor lysat. Som vist i fig. 5A, administration af den tredobbelte kombination forårsagede dramatiske ændringer i niveauerne af IFN-γ og IL-12 fremstilles af tumorlysater i heterotopisk cancer dyremodel. Produktionen af ​​IFN-γ i tumoren gradvist som antallet af kombinerede midler forøget med dobbelte kombinationer generelt udviser mere IFN-γ produktion end enkelt administration, og den tredobbelte kombination viser det højeste niveau af IFN-γ-produktion (fig. 5A ). Når IL-12-niveauer blev målt, fandt vi, at enkelt indgivelse af hvert middel ikke inducerede produktion af IL-12, og blandt de dobbelte kombinationer, kun kombinationen af ​​WKYMVm + MDC’er forbedret IL-12-produktion i dyremodellen (fig. 5B). Administration af den tredobbelte kombination (WKYMVm + MDC’er + 5-FU) dramatisk forøget IL-12 produktionen til et niveau, der var to gange højere end den WKYMVm + MDC’er dobbelt kombination (fig. 5B).

Balb /c-mus blev inokuleret med CT-26-celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og MDC’er ifølge protokollen i fig. 1A. (A, B) IFN-γ og IL-12-niveauer blev målt fra tumorvæv lysat. (C-F) IFN-y og IL-12 niveauer i perifert blod ved tredobbelt kombinationsbehandling blev målt. 100 ug anti-CD8 (C, D) eller anti-asialoGM1 antistof (E, F) blev injiceret i.p. til Balb /c mus. Data er vist som middelværdi ± SEM (n = 8).

*,

P

0,05,

***,

P

0,001, sammenlignet med kontrolgruppen værdi;

#,

P

. 0,05, signifikant forskellig fra WKYMVm + 5-FU + MDC’er-behandlet kontrol

Administration af den tredobbelte kombination blev også observeret at forbedre produktion af IFN-γ og IL-12 i det perifere blod (fig. 5C-5F). For at undersøge rollen af ​​CD8 T-lymfocytter og NK-celler i produktionen af ​​disse to cytokiner ved tredobbelt kombination administration blev anti-CD8 eller anti-asialoGM1 antistof indgives før tredobbelt kombinationsbehandling. Administration af anti-CD8 eller anti-asialoGM1 antistof blokerede tredobbelt kombination-induceret IFN-γ og IL-12-produktion i perifert blod (fig. 5C-5F). Disse resultater viser, at CD8 T-lymfocytter og NK-celler spiller en rolle i IFN-γ og IL-12-produktion induceret af tredobbelt kombinationsbehandling.

Anti-metastase aktivitet af kombineret administration af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er

Ved udvikling af en effektiv anti-tumor-terapeutiske middel, er det vigtigt at udvikle midler, der inhiberer tumor tilbagefald [19]. Den metastatiske evne af cancerceller til at migrere fra deres oprindelse til andre målvæv er en af ​​de vigtigste årsager, der gør det vanskeligt at udvikle en effektiv anticancermiddel [20], [21]. I vores heterotopisk cancer dyremodel observerede vi, at subkutan inokulation af CT-26 coloncancer-celler forårsaget spontan metastase af cellerne ind i lungevævet (fig. 6A). Administration af den tredobbelte WKYMVm + MDC’er + 5-FU kombination næsten helt blokeret metastase af colon cancerceller til lungerne (fig. 6A). Denne tredobbelte kombination-induceret anti-metastase-aktivitet blev blokeret ved indgivelse af anti-CD8 eller anti-asialoGM1 antistof (fig. 6A), hvilket indikerer, at anti-metastase-aktivitet medieres af CD8 T-lymfocyt og NK-celle aktivitet.

(A) Balb /c-mus blev inokuleret med CT-26-celler og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og MDC’er ifølge protokollen i fig. 1A. CD8 T-celler eller NK-celler blev depleteret ved injektion 100 ug anti-CD8 eller anti-asialoGM1 antistof i.p. i Balb /c mus. På dag 42 blev musene aflivet, og tumorknuder på overfladen af ​​lungerne blev observeret. (B) CT-26-celler (2 x 10

5-celler i 100 pi PBS) blev injiceret i halevenen af ​​Balb /c mus. Efter 14 dage blev musene aflivet, og hematoxylin og eosin-farvning blev udført under anvendelse af de isolerede lunger. De viste billeder er repræsentative for otte uafhængige forsøg.

**,

P

0,01,

**,

P

. 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen

Vi brugte også en kunstig metastase dyremodel for at teste virkningen af ​​forskellige kombinationer af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er mod metastase. Injektion af CT-26 colon cancerceller i halevenen forårsager metastase i lungerne. Lunger blev isoleret 14 dage efter CT-26 celle injektion. Dramatisk lunge metastase blev observeret med vehikel-behandlede mus (fig. 6B). Enkelte eller dobbelte kombinationer af WKYMVm, MDC’er, og 5-FU inhiberede tumormetastase i varierende grad til at reducere lunge metastase, og den mest potente virkning blev observeret med den tredobbelte kombination (fig. 6B).

Kombineret administration af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er øger overlevelsesraten i en heterotopisk kræft dyremodel

overlevelsesraten for den heterotopisk kræft dyremodel på kombineret behandling blev undersøgt. Vi testede kombinationerne, der viste relativt høj antitumoraktivitet i vores tidligere assays ovenfor; 5-FU alene, 5-FU + WKYMVm, 5-FU + MDC’er, og 5-FU + MDC’er + WKYMVm. Indgivelse af 5-FU alene, 5-FU + MDC’er, eller 5-FU + WKYMVm kun let øget overlevelsesrate, men administration af den tredobbelte 5-FU + MDC’er + WKYMVm kombination stærkt forøget overlevelsesrate (fig. 7A). Alle mus i kontrolgruppen blev døde efter 65 dage, hvorimod 80% af den tredobbelte kombination-indgivne gruppe var i live efter 80 dage (fig. 7A).

(A) overlevelsesraten for mus behandlet med kombinationer af WKYMVm, 5-FU, og MDC’er. Balb /c mus blev podet med CT-26-celler (5 x 10

5 celler /hoved) og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og MDC’er henhold til protokollen i fig. 1A. (B) adoptiv overførsel af CD8 T-lymfocytter eller NK-celler kan forbedre overlevelsen af ​​tredobbelte kombination-behandlede heterotopisk cancer dyremodelsystemer mus. Balb /c mus blev podet med CT-26-celler (1 x 10

6 celler /hoved) og behandlet med WKYMVm, 5-FU, og MDC’er henhold til protokollen i fig. 1A, og isolerede CD8 T-lymfocytter (1 × 10

6 celler /dyr) eller NK-celler (1 x 10

6 celler /dyr) blev overført i halevenen. Overlevelse blev overvåget i 80 dage.

**,

P

0,01,

***,

P

. 0,001 sammenlignet med kontrolgruppen

For at teste hvis adoptiv overførsel af CD8 T-lymfocytter og NK-celler kunne forbedre den tredobbelte kombination-induceret overlevelse af heterotop cancer dyremodelsystemer mus, vi inokuleret et øget antal colon cancerceller (1 × 10

6 celler /dyr) i mus. I denne model blev virkningen af ​​tredobbelte kombination faldet, reducere overlevelsesgraden til 40% ved 80 dage (fig. 7B). Under disse betingelser blev udført adoptiv overførsel af CD8 T-lymfocytter eller NK-celler. Adoptiv overførsel af CD8 T-lymfocytter eller NK-celler kun lidt øget overlevelse bedømt forårsaget af tredobbelte kombination administration, hvorimod kombinerede adoptiv overførsel af CD8 T-lymfocytter og NK-celler dramatisk forøget overlevelsesrate (fig. 7B). Disse resultater indikerer, at både CD8 T-lymfocytter og NK-celler kan forbedre overlevelsen induceret af den tredobbelte kombination i heterotopisk cancer dyremodel.

Discussion

I denne undersøgelse har vi vist, at administration af den tredobbelte kombination af det syntetiske peptid WKYMVm, MDC’er, og 5-FU forlener potent anti-cancer immunitet. Enkelt (WKYMVm, MDC’er eller 5-FU) eller dobbelt (WKYMVm + MDC’er, 5-FU + WKYMVm eller 5-FU + MDC’er) behandling af mus faldet lidt tumor volumen, men administrationen af ​​den tredobbelte kombination dramatisk hæmmet tumorvækst (Fig . 1). måleresultater tumorvolumenet blev korrelerede godt med FAS udtrykkelse, caspase-3-aktivitet, og TUNEL farvningsresultater (fig. 1 og 2). Ifølge tidligere rapporter, er IFN-γ vides at inducere ekspressionen af ​​celledød-receptorer såsom FAS [22], [23]. I denne undersøgelse viste vi, at administration af forskellige kombinationer af WKYMVm, 5-FU, eller MDC’er kan inducere IFN-γ-ekspression, med den tredobbelte kombination forårsager mest forbedret IFN-γ-produktion (fig. 5A). Ekspressionsniveauet af IFN-γ var godt korreleret med antitumoraktiviteten af ​​hver kombination, hvilket antyder, at IFN-γ induceret ved indgivelse af hvert middel eller kombination er kritisk involveret i anti-tumor aktivitet i dyremodel.

IL-12 kan prime eller stimulere CD4 T-celler, CD8 T-celler og NK-celler [24], [25], [26]. I denne undersøgelse kunne kun visse kombinationer, nemlig WKYMVm + MDC’er og den tredobbelte kombination inducere IL-12-ekspression i heterotopisk cancer dyremodel (fig. 5B). Enkelt administration af WKYMVm eller MDC’er inducerede ikke IL-12-produktion (fig. 5B). Dette antyder, at stimulering af MDC’er med WKYMVm er ansvarlig for effektiv induktion af IL-12 i dyremodel. Da WKYMVm er en ligand for FPR familien, forekommer det sandsynligt, at aktiveringen af ​​FPR familien inducerer IL-12 ekspression fra MDC’er. I overlevelsesraten eksperiment, tredobbelt administration af WKYMVm + 5-FU + MDC’er inducerede en stærk forøgelse af overlevelsesraten i en heterotopisk cancer dyremodel, men 5-FU + MDC’er behandling havde en meget mindre effekt (fig. 7). Eftersom IL-12-produktion kraftigt induceres af den tredobbelte kombination, men ikke af 5-FU + MDC’er (fig. 5B), kan det være muligt, at den tredobbelte kombination forøger overlevelsesfrekvensen ved at stimulere produktionen af ​​opløselige faktorer, såsom IL-12.

NK og CD8 T-celler blev for nylig rapporteret at være vigtige i cancer regression [27], [28], [29]. Her har vi vist, at CD8 T- og NK-celler blev beriget i tumorer når den tredobbelte kombination blev administreret (fig. 3), og depletion af CD8 T-celler eller NK-celler forøgede tumorvækst (fig. 4). Desuden depletion af CD8 T-celler eller NK-celler reducerede niveauerne af induceret IFN-γ og IL-12 (fig. 5C-5F). Disse resultater indikerer, at CD8 T-celler og NK-celler er involveret i anti-tumor effekt af den tredobbelte kombination. Triple administration af WKYMVm, MDC’er og 5-FU viste ligeledes en anti-metastase effekt i en heterotopisk cancer dyremodel (fig. 6). Intravenøs injektion af ATRA-kationisk liposom /IL-12 pDNA-komplekser blev vist at forøge vækstinhibering af metastatiske lungetumorer i mus [30], støtter vores opfattelse, at IL-12-produktion kan være forbundet med anti-metastase aktivitet af den tredobbelte kombination .

i denne undersøgelse viste vi, at CD8 T-celler og NK-celler spiller en vigtig rolle i anti-tumor aktivitet af den tredobbelte kombination. Tidligere vi rapporterede, at NK-celler udtrykker funktionelt FPR familie, og stimulering af NK-celler med FPR-agonist WKYMVm fremkalder IFN-γ produktion [11]. I denne undersøgelse har vi også fundet, at muse NK celler udtrykker FPR familie, og stimulering af muse NK-celler med WKYMVm fremkalder produktion af IFN-γ (data ikke vist). Dette fund forklarer WKYMVm-induceret NK-celleaktivering er helt nødvendigt for antitumoraktiviteten af ​​den tredobbelte kombination mod heterotopisk cancer dyremodel. Med hensyn til aktiveringen af ​​CD8 T-celler og deres rolle i heterotopisk cancer dyremodel, der tidligere viste vi, at T-celler ikke udtrykker receptorer for WKYMVm [31]. Eftersom CD8-T-celler kan aktiveres ved MDC’er og IL-12 [32], [33], vil det være rimeligt at antage, at administrationen af ​​tredobbelte kombination indeholdende WKYMVm kan inducere aktiveringen af ​​CD8 T-celle vil blive medieret af MDC’er eller IL -12.

det kan konkluderes, tredobbelt kombination immunterapi med MDC’er, det syntetiske peptid WKYMVm, og 5-FU var overlegen i forhold til enkelt eller dobbelt behandling til inhibering etablerede primære tumorer og metastaser, samt forlængelse overlevelse. Stigningen i terapeutiske virkning skyldes en effekt, der opstod lokalt (forøgede niveauer af FAS og caspase-3-ekspression) og systemisk (forøget produktion af IFN-γ og IL-12). Derfor kan brug af den tredobbelte kombinationsbehandling have konsekvenser i fast tumor og metastase behandling.

Materialer og metoder

Mus

Institutional Review Committee for Animal Care og Brug ved Dong-A University specifikt godkendt denne undersøgelse (godkendelse ID: DIACUC 07-6). Balb /c-mus (hanner, 6-8 uger gamle) blev opnået fra Jackson Laboratory

Cellekultur og materiale

CT-26-celler (CRL-2638;. ATCC American Type Culture Collection ) er et kolon adenocarcinom cellelinie afledt fra Balb /c mus. CT-26-celler blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og antibiotika ved 37 ° C i en CO 5%

2 befugtet inkubator. Det syntetiske peptid, WKYMVm, blev syntetiseret ved Anygen (Kwangju, Korea). Renheden af ​​syntetiserede WKYMVm var 98%. 5-FU blev indkøbt fra Choongwae, Pharma Co. (Seoul, Korea).

DC forberedelse og modning

Knoglemarvsceller blev dyrket i 5 dage i DC-medium (RPMI 1640-medium med 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, 50 uM β-mercaptoethanol, antibiotika) i nærvær af muse GM-CSF (1.000 U /ml) og IL-4 (500 U /ml), som beskrevet [34]. GM-CSF og IL-4 blev genopfyldes på dag 2 og 4. På dag 5 blev cellerne opsamlet og overført til en ny plade med DC-medium og stimuleret med lipopolysaccharid (100 ng /ml; Sigma), CpG-oligodeoxynukleotid 1826 (10 ug /ml), og CT-26 lysat (100 ug /ml) i 2 dage for at inducere modning. På dag 7 blev DCs indsamlet til brug som vacciner.

vækst Tumor og overlevelse

For at måle tumorvækst, CT-26-celler (5 x 10

5 celler i 100 ul PBS) blev injiceret sc i den højre flanke af Balb /c-mus (n = 8) på dag -3. På dag 0 og 1, blev 5-FU (100 ug /100 ul) injiceret s.c. i Balb /c mus. På dag 2 blev musene behandlet med fire injektioner af WKYMVm (100 ug /100 pi) og MDC’er (1 × 10

6 celler) på 12 h-intervaller. På dag 4 og 5, blev 5-FU (100 ug /100 ul) injiceret s.c. i Balb /c mus. Efterfølgende blev musene behandlet med s.c. injektion af 5-FU, MDC’er og WKYMVm gang om ugen i 4 uger. Tumorvolumen blev bestemt ved følgende formel: tumorvolumener (i mm

3) = længde (mm) x bredde (mm)

2/2 [35]. Foruden overvågning af tumorvækst blev musene observeret for overlevelse efter inokulation af tumor og behandling.

hematoxylin og eosin og immunfluorescensfarvning

Mus blev aflivet 42 dage efter inokulation af tumor, og tumorer blev udskåret kirurgisk , fikseret i 24 timer i 10% neutral phosphatbufret formalin (NBF), indlejret i paraffin og sektioneret og farvet med hematoxylin og eosin til morfologisk analyse. For immunfarvning blev de følgende primære antistoffer anvendt: anti-muse Fas (Santa Cruz), anti-muse spaltet caspase-3 (Cell Signaling), FITC-konjugeret anti-muse CD3 (BD ​​Pharmingen), PE-konjugeret anti-muse CD4 (BD Pharmingen), PE-konjugeret anti-muse CD8 (BD Pharmingen), FITC-konjugeret anti-muse CD11 (BD Pharmingen), og PE-konjugeret anti-muse DX5 (BD Pharmingen) antistof. For konfokal mikroskopi, er fastsat tumorvæv farvet med FITC-konjugeret anti-muse IgG og Alexa 594-konjugeret anti-muse-IgG (BD Pharmingen).

In situ

TUNEL-farvning

Terminal deoxy-nukleotidyltransferase-medieret digoxigenin-dUTP nick endemærkning (TUNEL) blev udført til påvisning af apoptotiske celler i tumorvæv. Paraffinsnit blev deparaffineret, hydreret, behandlet med 3% H

2O

2 i 5 minutter, og skyllet med PBS i 15 min, og

In situ

Død Detection Kit, POD, blev anvendt (Roche, Penzberg, Tyskland). Kort fortalt blev digoxigenin-dUTP endemærket DNA påvist med anti-digoxigenin-peroxidase antistof efterfulgt af peroxidase påvisning med diaminobenzidin (DAB). Væv blev modfarvet med Mayers hæmatoxylin.

enzymmaerket assay (ELISA)

På dag 42 blev blod opsamlet fra hjertet af mus og klares ved centrifugering. Serummet blev opbevaret ved -80 ° C, indtil klar til cytokinanalyse. Murint IL-12 (p70) og IFN-y koncentrationer blev målt under anvendelse af en standardiseret sandwich-ELISA-metoden (BD Biosciences Pharmingen).

In vivo

immuncelleundergruppe depletion

at depletere CD4, CD8 T-celler og NK-celler blev mus behandlet med det tilsvarende antistof på dag -1, 0 og 5 (hvor dag 0 er den dag i primær tumor inokulation). Det monoklonale rotte-anti-muse CD4 (klon GK1.5), rotte-anti-muse CD8 (klon 53-6.7) og rotte-anti-muse asialoGM1 antistoffer blev anvendt til immunodepletion. I leukocytdepletering undersøgelser, 100 ug anti-CD4, anti-CD8 eller anti-asialoGM1 antistof blev injiceret i.p. i Balb /c mus.

lungemetastase

I den heterotopisk lunge metastase eksperiment, CT-26-celler (5 x 10

5-celler i 100 pi PBS) blev injiceret s.c. i den højre flanke af Balb /c-mus (n = 8) på dag -3. 5-FU, WKYMVm, og MDC’er blev administreret i 3 uger, som beskrevet ovenfor for eksperimentet at måle tumorvolumen. På dag 42 blev musene aflivet, og tumorknuder på overfladen af ​​lungerne blev observeret. For metastatisk cancer dyreforsøg blev CT-26-celler vasket to gange med PBS og injiceret i halevenen af ​​Balb /c mus (2 x 10

5-celler i 100 pi PBS). Efter 14 dage blev musene aflivet, og lungerne blev vejet.

adoptiv overførsel

Til opnåelse CT26 tumor-reaktive CD8 T-celler, blev Balb /c-mus immuniseret tre gange (ved 1-uges intervaller) med 1 × 10

7 CT26 tumorlysater (sc injektion). Den 21. dag blev immuniserede mus aflivet, og CD8 T-celler eller NK-celler blev isoleret ved anvendelse af CD8 T-celle-isolation kit eller NK-celle isolation kit (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland) fra deres milt. For adoptiv terapi blev tumorer oprettet ved subkutan injektion af 5 x 10

6 CT26 tumorceller på højre flanke af Balb /c mus. Tydelige tumorer (-5 mm i diameter) dannes sædvanligvis på injektionsstedet efter 4 til 5 dage. Før tredobbelt kombineret behandling, oprenset CD8 T (1 × 10

6 cell /100 pi) celler eller NK (1 × 10

6 cell /100 pi) overføres cellerne (iv injektion) til CT26 tumor-loaded mus og så begynde med tredobbelt kombineret behandling.

Dataanalyse

Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM for gentagne forsøg. Statistisk signifikans af forskelle blev bestemt ved anvendelse af ANOVA. Overlevelsesdata blev analyseret under anvendelse af log-rank test.

P

. . 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Tak

Vi takker Dr. Min Sung Choi af Sungkyunkwan University til redaktionel assistance