PLoS ONE: MicroRNA-22 Regulerer Hypoxi signalering i Colon Cancer Cells

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) er korte, ikke-kodende RNA, der regulerer en række cellulære funktioner ved at undertrykke målprotein udtryk. Vi antager, at et sæt af microRNA regulere tumor responser for hypoxi ved at hæmme komponenter af hypoxi signalvejen. Vi fandt, at MIR-22-ekspression i human coloncancer er lavere end i den normale colon væv. Vi fandt også, MIR-22 styrer hypoxi inducerbar faktor 1α (HIF-1α) ekspression i HCT116 coloncancer cellelinie. Over-ekspressionen af ​​miR-22 hæmmer HIF-1α udtryk, undertrykke vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) produktion i hypoxi. Omvendt knockdown af endogent MIR-22 øger hypoksi-induceret ekspression af HIF-1α og VEGF. De konditionerede medier fra celler, der overudtrykker MIR-22 indeholder mindre VEGF protein end kontrolceller, og også fremkalde mindre endotelcellevækst og invasion, hvilket tyder MIR-22 i tilstødende celler påvirkninger endotelcellefunktion. Tilsammen vore data antyder, at MIR-22 kan have en antiangiogen virkning i tyktarmskræft

Henvisning:. Yamakuchi M, Yagi S, Ito T, Lowenstein CJ (2011) MicroRNA-22 Regulerer Hypoxi signalering i Colon kræftceller. PLoS ONE 6 (5): e20291. doi: 10,1371 /journal.pone.0020291

Redaktør: Costanza Emanueli, University of Bristol, England

Modtaget: Januar 18, 2011; Accepteret: April 24, 2011; Udgivet: 23. maj 2011

Copyright: © 2011 Yamakuchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af American Heart Association tilskud (0835446N) (MY) og NIH tilskud (CJL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er korte ikke-kodende RNA’er (18-22 nt), der inhiberer genekspression. Modne miRNA produceres af RNase III-enzymer drosha og Dicer, derefter indarbejde RNA-inducerede silencing kompleks (RISC), og endelig binde til 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af deres målgenprodukter mRNA’er, inhibering deres ekspression [1], [2]. Det menes, at fortløbende baseparring på mindst 7 nukleotider mellem miRNA sekvens (seed sekvens) og elementet miRNA anerkendelse (MRE) er nødvendig for at undertrykke protein oversættelse [3], [4], [5], [6], [7]. Desuden er nogle undersøgelser tyder på, at ufuldkommen bindende såsom slingringer eller buler i frøet sekvensen inhiberer proteintranslation [8], [9].

miRNA har en række fysiologiske og patologiske funktioner, herunder kontrol af tumorigenese [ ,,,0],10], [11], [12]. Transkriptionsfaktoren hyppigst muteret i cancer, p53, regulerer et sæt af miRNA. Aktivering af p53 øger miR-34a produktion, og overekspression af miR-34a inducerer cellecyklusstop, ældning og apoptose. En anden transkriptionsfaktor i kræft, c-myc, regulerer et separat sæt miRNA. C-myc nedsætter ekspressionen af ​​adskillige miRNA herunder MIR-22 i cancercellelinier [13]. Nylige undersøgelser viste, at MIR-22 mål adskillige proteiner såsom østrogenreceptor a (ERa), c-myc protein (MYCBP), Myc associeret faktor X (MAX), og PTEN, hvilket antyder, at MIR-22 kan være impliceret i tumorigenese. Men funktionen af ​​MIR-22 i cancerceller fortsat ukendt.

Hypoxi inducerbar faktor 1 (HIF-1) er et heterodimert transskriptionsfaktor, som regulerer transkription af gener, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og basisk fibroblast vækstfaktor (bFGF) [14], [15], [16]. HIF-1 er en heterodimer bestående af to underenheder, HIF-1a og HIF-1 p (Arnt). Hypoxi eller hypoksi mimetika stabilisere HIF-1α ved at hæmme dets prolyl hydroxylering. HIF-1 er involveret i angiogenese, invasion, metastase, glucoseoptagelse og metabolisme i cancerceller [17]. Hypoxi i tumorer kan fungere som en udløser for angiogenese til at levere øget ilt til kræft. HIF-1α ekspression er associeret med dårlig prognose i colorektal cancer og pancreascancer [17], [18], [19].

Vi har nu identificere HIF-1α som et mål for MIR-22 i en coloncancer cellelinie. Vi finder, at MIR-22-niveauer i human coloncancer er lavere end i den normale colon væv. Da tyktarmskræft prøver med lavere miR-22 viser højere VEGF udtryk, vi hypotesen, at miR-22 regulerer hypoxi signalering i tyktarmskræft cellelinjer.

Resultater

Angivelse af miR-22 i tyktarmskræft

Vi bruges først Northern blotting for at måle mIR-22-ekspression i humane væv, og fandt, at mIR-22 udtrykkes i de fleste væv, men relativt rigelige i hjertet, glat muskulatur, blære, og fedtvæv (fig. 1A). Vi undersøgte dernæst ekspressionen af ​​MIR-22 i flere cancercellelinier. Vi kunne opdage MIR-22 i tre colon cancer cellelinjer, HCT116, HCT116 p53 KO og HT29, og også i en epitelcancer cellelinie HeLa (fig. 1B). For at undersøge niveauet af miR-22 i tyktarmskræft, målt vi miR-22-ekspression af qPCR i 9 humane coloncancer prøver og 9 normale colon væv fra patienter på The Johns Hopkins Hospital. Ekspression af MIR-22 er lavere i tyktarmskræft prøver (P = 0,02) (fig. 1c). Da vi er interesseret i at studere, hvordan microRNA regulere tumor angiogenese, målte vi også VEGF-mRNA-ekspression i de samme prøver og fandt, at VEGF mRNA-ekspression i tyktarmskræft prøver er højere end i normale colon prøver (P = 0,03) (Fig.1C) . Vi fandt også, at RNA-niveauer af MIR-22 og VEGF er negativt korreleret (P 0,05) (fig 1D.)

(A) MIR-22-ekspression i normale humane væv.. En kommerciel membran indeholdende RNA fra normale humane væv blev probet for MIR-22 under anvendelse af Northern analyse. (B) MIR-22 ekspression i cellelinjer. Cellelysater blev probet for MIR-22 ved Northern blotting. (C) MIR-22 og VEGF-ekspression i normalt humant colon væv og human coloncancer. RNA blev ekstraheret fra 9 normale humane colon prøver (hvid) og fra 9 humane coloncancer prøver (sort), og analyseret ved qPCR for MIR-22 og VEGF-ekspression (n = 9 ± S.D.). Tyktarmskræft prøver indeholder mindre miR-22 og mere VEGF end normale kolon prøver. (D) Foreningen af ​​miR-22 og VEGF i human tyktarmskræft. Naturlig log transformation af relative forhold af RNA for miR-22 og VEGF blev anvendt til statistisk analyse (n = 30).

HIF-1α er et mål for miR-22

da HIF-1α er en del af en større ilt sensing vej, vi søgte efter potentielle miRNA, der kan styre HIF-1α oversættelse ved hjælp af beregningsmæssige analyse (human miRNA Mål på Memorial Sloan-Kettering Cancer center Computational Biology hjemmeside http: //cbio. mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl), og fandt, at mIR-22 frø sekvens matcher 3’UTR af HIF-1α (7 nukleotider kampe herunder en wobble match). Vi undersøgte, hvordan MIR-22 regulerer HIF-1 og hypoxi signalering under anvendelse HCT116 colon cancerceller som en in vitro model for, hvordan tumorceller svare hypoxi. For at undersøge, om MIR-22 regulerer HIF-1α proteinekspression, transficerede vi HCT116-celler med præ-MIR-22 til overekspression af MIR-22 og med anti-sense-MIR-22 til knockdown af MIR-22. Transfektion af præ-MIR-22 ind HCT116 øget MIR-22 niveauer mere end 10 gange (fig. 2A). Knockdown af MIR-22 ved transfektion med anti-sense-MIR-22 faldt MIR-22 niveauer ned til 40% (fig. 2A). Hypoxi øget HIF-1α ekspression i HCT116, som forventet (fig. 2B). Men over-ekspression af MIR-22 inhiberede hypoxi-induceret HIF-1α ekspression i HCT116 og HT29 (fig. 2B-D). I modsætning hertil knockdown af MIR-22 forbedrede HIF-1α ekspression under hypoxi (fig. 2C-D). Over-ekspression af MIR-22 ændrede ikke niveauet af HIF-1β, dimeriseringen partner HIF-1α (fig S1). Disse undersøgelser viser, at endogene miR-22 hæmmer HIF-1α.

(A) Ændring af miR-22-ekspression ved transfektion. HCT116-celler blev transficeret med præ-MIR-22 eller anti-sense-MIR-22 eller kontrol- oligonukleotider, og niveauer af MIR-22 blev målt ved qPCR. (B) Over-ekspressionen af ​​miR-22 hæmmer HIF-1α udtryk. HCT116-celler blev transficeret med kontrol oligonukleotider eller præ-MIR-22, og derefter udsat for normoxi eller hypoksi i 16 timer. Cellelysater blev immunblottet for HIF-1α. Hypoxi inducerer HIF-1α, men MIR-22 undertrykker HIF-1α. (C) To coloncancer-cellelinjer, HCT116 (to øvre paneler) og HT29 (to bundpaneler), blev transficeret med præ-MIR-22 eller anti-sense-MIR-22, udsat for hypoxi, og cellelysater blev immunoblottedes for HIF-1α. (D) Kvantificering ved densitometri af immunoblotting for HIF-1α i HCT116-celler transficeret som ovenfor (n = 3 ± S.D.).

microRNA kan regulere genekspression ved at undertrykke translation. Over-ekspression eller knockdown af MIR-22 ændrede ikke ekspressionen af ​​HIF-1α mRNA, hvilket tyder på, at MIR-22 regulerer HIF-1α oversættelse men ikke transkription (fig. 3A). Human HIF-1α 3’UTR har et potentiale bindingssted for MIR-22 (fig. 3B). At undersøge den mekanisme, hvormed MIR-22 regulerer HIF-1α, vi foretaget en luciferase reporter vektor, som indeholder et fragment af 3’UTR af HIF-1α (udvidelse efter stopkodonen 0-401 bp), der omfatter en miR -22 bindingssted. Vi co-transficeret HCT116-celler med denne reporter vektor og med præ-MIR-22 eller kontrol. Over-ekspression af MIR-22 faldt luciferaseaktivitet (fig. 3C venstre). Men MIR-22 ikke påvirke ekspressionen af ​​luciferase med en muteret MIR-22 bindende elementer (fig. 3C højre), hvilket antyder, at MIR-22 inhiberer HIF-1α ekspression via interaktion med 3’UTR af HIF-1α.

(A) MIR-22 påvirker ikke HIF-1α mRNA. HCT116-celler blev transficeret med Pre-MIR-22 eller anti-sense-MIR-22 eller kontrol. Totalt RNA blev høstet og analyseret for HIF-1α mRNA ved qPCR (n = 3 ± S.D.). (B) Humant HIF-1α 3’UTR indeholder et bindingssted for MIR-22. (C) MIR-22 undertrykker transaktivering af HIF-1α 3’UTR. HCT116-celler blev transficeret med en luciferase reporter vektor (MiRreport) indeholdende 3’UTR af HIF-1α (venstre panel) eller en muteret 3’UTR af HIF-1α (højre panel) og med præ-MIR-22 eller præ-miR -kontrol. Celler blev høstet og luciferaseaktiviteten blev målt (n = 3 ± SD).

MIR-22 kontroller VEGF udtryk i HCT116

For at undersøge betydningen af ​​miR-22 i VEGF-ekspression , transficerede vi HCT116 med præ-mIR-22 eller anti-sense-mIR-22 eller kontrol, og derefter målt VEGF-mRNA-ekspression ved qPCR. Hypoxi og hypoxi mimetiske desferioxamin (DFX) øgede ekspression af VEGF-mRNA (fig. 4A, hvide søjler). Over-ekspression af MIR-22 faldt hypoxi eller DFX induceret VEGF-ekspression (fig. 4A, sorte søjler). Omvendt knockdown af MIR-22 steg DFX induceret VEGF-ekspression (fig. 4B). Næste målte vi koncentrationen af ​​VEGF i medierne. DFX forøgede sekretionen af ​​VEGF fra HCT116 celler. Over-ekspression af MIR-22 undertrykte sekretionen af ​​VEGF. I modsætning hertil knockdown af MIR-22 forstærkede VEGF frigivelse (fig. 4C-D). Derudover undersøgte vi effekten af ​​miR-22 ved ekspression af angiopoietin 2 (ANGPT2) og stamcelletransplantation (SCF), fordi ANGPT2 og SCF er angiogene vækstfaktorer, som er reguleret af HIF-1 [20]. Hypoxi induceret ANGPT2 og SCF, og overekspression af MIR-22 inhiberede hypoxi induceret ekspression af ANGPT2 og SCF (figur S2).

HCT116 blev transficeret med præ-MIR-22 eller anti-sense-MIR-22 eller kontrol, og derefter udsat for normoxi eller hypoksi i 16 timer. Mediet blev analyseret for VEGF ved ELISA og RNA fra cellelysater blev analyseret for VEGF mRNA ved qPCR (n = 3 ± S.D. * P 0,05) (A) Pre-MIR-22 aftager VEGF-mRNA. (B) Anti-sense-miR-22 øges VEGF mRNA. (C) Pre-miR-22 aftager VEGF protein. (D) Anti-sense-MIR-22 øger VEGF protein.

MIR-22 i HCT116 regulerer endotelcellevækst

Da angiogenese involverer endotelcelleproliferation, testede vi virkningen af mIR-22 upon HUVEC proliferation. Vi transficerede HCT116-celler med præ-MIR-22 eller kontrol, eksponeres cellerne for normoxi eller hypoksi, og høstet medierne. Vi har tilføjet dette konditionerede medium til human primær endotelcelle (HUVEC), dyrket i yderligere 3 dage, og derefter målt proliferationen af ​​HVUEC af BrdU-inkorporering assay. Der var ingen signifikant forskel mellem medier fra normoxi celler transficeret pre-MIR-22 og medier fra normoxi celler transficeret kontrol (fig. 5A). Som forventet medier fra hypoxiske celler transficeret med kontrol øget HUVEC proliferation. Imidlertid medier fra hypoxiske celler transficeret pre-MIR-22 blokerede denne stigning i proliferation (fig. 5A).

HCT116-celler blev transficeret med præ-MIR-22 eller kontrol, og medierne blev opsamlet. (A) HUVEC-celler blev dyrket i plader med 12 brønde, blev de konditionerede medier tilsat, og HUVEC blev inkuberet i 3 dage. Proliferation blev overvåget ved BrdU-inkorporering assay (n = 5 ± S.D. * P 0,05). Pre-MIR-22 formindsker evnen hos hypoxiske behandlede celler til at producere faktorer, der stimulerer endotelial proliferation. (B) HUVEC-celler blev ridset, de konditionerede medier blev tilsat, og fotograferet ved 16 timer. (C) Måling af den distance, der hver viklet i forhold til kontrollen eksponeret med normoxi. (* P 0,05)

Da angiogenese involverer også endotel migration, testede vi virkningen af ​​MIR-22 upon HUVEC migration ved hjælp af scratch sårheling assay. Vi hvormed HUVEC-celler Det konditionerede medier fra HCT116 celler, som var blevet transficeret med præ-MIR-22 eller kontrol og havde derefter været udsat for normoxi eller hypoksi. Efter 16 timer målte vi endotel migration fra kanten af ​​bunden såret. Medier fra HCT116 celler eksponeret for hypoksi forøgede endotel migration (fig. 5B-C). Over-ekspression af MIR-22 i HCT116 bremset HUVEC migration (fig. 5B-C). Disse data antydede, at miR-22 i HCT116 påvirker endotel biologi, øget proliferation og migration.

Diskussion

Den største fund af denne undersøgelse er, at miR-22 hæmmer hypoxi signalering. MIR-22 udtrykkes i mange cancerceller, herunder coloncancer HCT116. Endvidere MIR-22 undertrykker HIF-1α oversættelse. Endelig MIR-22 inhiberer VEGF-ekspression ved at undertrykke HIF-1α ekspression. Da andre har vist, at c-myc grænser MIR-22-ekspression, kunne forventes tumorer overudtrykker c-myc at have lavere niveauer af MIR-22, højere niveauer af HIF-1α og VEGF. Derfor er disse data tyder på, at miR-22 kan regulere tumor angiogenese.

Mål af miR-22

Individuel miRNA kan modulere ekspressionen af ​​mange gener. Adskillige rapporter identificerer potentielle mål for miR-22 ved hjælp af software-algoritmer, såsom Targetscan, Miranda og PicTar, i kombination med cellulære undersøgelser. MIR-22 mål for østrogen receptor en (ERA) og undertrykker østrogen signalering i flere brystkræft cellelinjer [21], [22]. MIR-22 også undertrykt c-myc-bindende protein MYCBP [23], c-Myc bindingspartner MAX [24] og tumorsuppressorgen PTEN [25], [26], [27]. PPAR-alfa og BMP7 er også mål for miR-22 [28]. Vi fandt, at HIF-1α er et nyt mål for miR-22. 3’UTR af HIF-1α omfatter en komplementær sekvens for MIR-22 bestående af 7 nukleotider; dette frø sekvens indeholder en wobble bindende nukleotid (G-A). Vores biokemiske data antyder, at miR-22 direkte regulerer HIF-1α udtryk købe undertrykke oversættelsen af ​​HIF-1α.

rolle miR-22 i tumor angiogenese

MIR-22 har unikke roller i specifikke celletyper. MIR-22 regulerer differentieringen af ​​en monocyt cellelinie [24]. MIR-22 regulerer PPAR-alfa og BMP7 signalveje i humane chondrocytter [28]. Ved cancer, funktionen af ​​MIR-22 er kontroversiel. Musen MIR-22-genet kortlagt til en cancerassocieret genomiske region, og den humane MIR-22-genet ligger inden for et tab af heterozygositet region (LOH) i flere cancerceller [23], [29], hvilket antyder, at MIR-22 er involveret i at undertrykke tumorvækst. Ektopisk ekspression af MIR-22 inhiberede proliferation og kolonidannelse af MCF-7 celler [23]. Denne tumor suppressor aktivitet af miR-22 indebærer undertrykkelse af MYCBP. Men andre har vist, at knockdown af miR-22 øger apoptose sats i 16HBE-T-celler [26]. Den tilsyneladende modsigelse mellem disse to undersøgelser kan skyldes forskellige cellelinier eller forskellige metoder til ændring MIR-22 niveauer. Vi fandt, at MIR-22 inhiberer VEGF-sekretion, hvilket tyder MIR-22 kan fungere som en anti-angiogenese faktor i kolon cancercellelinier. Vores humane data støtter denne idé: humant prøvemateriale af tyktarmskræft har lavere niveauer af miR-22 og højere niveauer af VEGF, sammenlignet med normalt humant colon væv. Vore data viser en anden mekanisme, gennem hvilken MIR-22 kan virke som en tumor suppressor:. Tab af MIR-22-ekspression ikke kun tillader en stigning i MYCBP men også en stigning i HIF-1α

Hypoxi signalering og miRNA

Lokal tumorvækst er begrænset af hypoxi: som tumoren vokser, bliver dens centrum hypoxisk, overtalelse gener såsom VEGF, som udløser angiogenese [30], [31], [32]. HIF-1 heterodimer spiller en kritisk rolle i hypoxisk signalering i tumorer [15], [33]. Vi og andre har identificeret miRNA, der styrer hypoxi signalering. Vi har tidligere fundet, at MIR-107 inhiberer HIF-1β [34]. Andre har vist, at MIR-20b begrænser HIF-1α ekspression i lunge adenocarcinom og brystcancercellelinier [35], [36], [37]. MIR-17-92 klynge modulerer også tumorvækst ved at hæmme HIF-1α udtryk. Vores nuværende studie tilføjer miR-22 på listen over miRNA, som regulerer HIF-1 protein.

Materialer og metoder

Cell Culture, Hypoxi eksponering og transfektion

Menneskelig navlestrengen vene endotelceller (HUVEC) blev indkøbt fra Lonza (Walkersville, MD). HUVEC (passage 2-5) blev dyrket i endotel basalt medium (EBM2) suppleret med vækstfaktorer (Lonza). HeLa og HEK293 (ATCC, Manassas, VA) blev dyrket i DMEM-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). HCT116 (gave fra Bert Vogelstein, The Johns Hopkins University School of Medicine) og HT29 (ATCC) blev dyrket i McCoys 5A medier suppleret med 10% FBS. Desferrioxamin (DFX) og andre reagenser blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO). At udsætte celler for hypoxi, cellerne blev dyrket i Billups-Rotenburg kammer med 94% N2, 1% O2 og 5% CO2 på 37 C i 24 timer.

Menneskelig Specimen

human colon cancer prøver (n = 9) og parrede ikke-kræft normale colon prøve (n = 9) blev opnået fra patienter på The Johns Hopkins Hospital, Baltimore, MD, med dokumenteret informeret samtykke i hvert enkelt tilfælde. Indsamling og analyse af humane coloncancer eksemplar blev godkendt af The Johns Hopkins University School of Medicine Institutional Review Board. Patienter, der gennemgår operation for tarmkræft leveres skriftligt samtykke til at donere væv til analyse.

transfektion

Precursor miRNA og anti-sense-oligonukleotider til miRNA var fra Applied Biosystems (Foster City, CA). For transfektion af forstadie miRNA blev HCT116-celler transficeret med siPORT NeoFX (Applied Biosystems) med forstadie miRNA 0-20 nM eller med anti-sense miRNA 0-40 nM og høstet 48 timer senere.

Northern blotting

Totale RNA’er blev ekstraheret fra celler under anvendelse af Trizol (Invitrogen). Humane væv RNA’er blev opnået fra Applied Biosystems. Northern blotting for MIR-22 blev udført som tidligere beskrevet. Kort beskrevet 10 ug af hvert RNA blev påsat 15% TBU-gel (Invitrogen), overført til nitrocellulosemembran og hybridiseret med

32P-endemærkede prober specifikke for MIR-22 ved 42 ° C i 16 timer. MIR-22 sonde, blev 5′-TAAAGCTTGCCACTGAAGAACT-3 ‘syntetiseret af Integrated DNA Technologies; alle andre reagenser blev købt fra Applied Biosystems.

Kvantitative Real-Time PCR (QRT-PCR)

For at analysere miRNA udtryk, TaqMan miRNA analyser blev anvendt til at kvantificere niveauet af modne miRNA efter producentens instruktioner. Kort fortalt cDNA blev syntetiseret ud fra oprenset lille RNA (10 ng) og udførte Real-Time PCR med iCycler iQ (BioRad). Ekspressionsniveauer blev normaliseret til U6. Primerne til miRNA RT-PCR og PCR-blandingen blev købt fra Applied Biosystems. For at detektere mRNA-ekspression blev cDNA-syntese udføres ved hjælp af High Capacity cDNA syntese kit (Applied Biosystems). Primerne til human VEGF og ß-actin blev købt fra Applied Biosystems.

luciferaseassays Salg

Et fragment af 3’UTR af HIF-1α (begyndende efter TGA stopkodonet og som strækker sig 401 bp) indeholdende mIR-22 responselementet blev klonet ind pMIR-RAPPORT luciferase vektor (Applied Biosystems). Mutation af miR-22 respons element (5′-GTTGACGG-3 ‘→ 5’-G

A

T

C

En

G

GG -3) var lavet af QuikChange steddirigeret mutagenese-kit (Stratagene). HCT116-celler blev udpladet med 5 x 10

4 celler per brønd i 24 brønds plader. Næste dag blev pMIR-RAPPORT Luciferase vektorer herunder 3’UTR af HIF-1α og precursor MIR-22 eller krypterede oligonukleotider transficeret i celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Otteogfyrre timer efter transfektion blev luciferaseassays udført ved anvendelse af dual luciferase reporter assay-systemet (Promega).

Western blotting

Celler blev lyseret i 0,4 ml lysisbuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% NP40, 20 mM NaF, 1 mM orthovanadat og protease inhibitor cocktail). Lysater blev separeret ved elektroforese, blottet på membranen og omsættes med specifikke antistoffer. Antistof til muse HIF-1α var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Alle andre primære antistoffer og passende sekundære antistoffer var fra Santa Cruz.

VEGF Koncentrationer

Et ELISA blev anvendt til at kvantificere VEGF udskilles fra HCT116 celler i medierne. HCT116-celler blev inkuberet i 1 ml medium med 1% FBS i fravær (kontroller) eller tilstedeværelse af DEX eller under normoxi eller hypoksi i 24 timer ved 37 ° C. Supernatanterne blev analyseret for VEGF-produktion under anvendelse af human VEGF ELISA kit ifølge producentens protokol (R 0,05 blev betragtet som signifikant

Støtte Information

Figur S1..

HIF-1β er ikke et mål for miR-22. Beskrivelse: HCT116-celler blev transficeret med præ-MIR-22 eller præ-MIR-kontrol, og udsættes for normoxi eller hypoksi i 16 timer. Cellelysater blev immunblottet for HIF-1a og HIF-1b. Over-ekspressionen af ​​miR-22 hæmmer HIF-1a udtryk, men ikke HIF-1b

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020291.s001

(TIF)

Figur S2.

MIR-22 regulerer udtrykkene for angiogene faktorer. Beskrivelse: HCT116-celler blev transficeret med præ-MIR-22 eller kontrol, og derefter udsat for normoxi eller hypoksi i 8 timer. RNA’er fra cellelysater blev analyseret for angiopoietin 2 (ANGPT-2), stamcellefaktor (SCF), og COX-2 mRNA efter qPCR (n = 3 ± SD * P 0,05) Over-ekspression af MIR-22 faldt udtrykkene af angiogene faktorer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020291.s002

(TIF)

tak

Vi takker Dr. Scott Kern til at forsyne os med human tyktarmskræft prøver.