PLoS ONE: RalGPS2 er afgørende for overlevelse og cellecyklusprogression af Lung Cancer Cells uafhængigt af sine Etablerede Substrater Ral GTPases

Abstrakt

Det menneskelige genom indeholder seks gener, der koder for proteiner valideret

in vitro

som specifikke aktivatorer af de små GTPaser “Ras-relateret protein Ral-A” og “Ras-relateret protein Ral-B”, generisk navngivne Ral-guanin nukleotid exchange faktorer (RalGEF). Ral proteiner er vigtige bidragydere til Ras onkogen signalering, og

RAS

onkogener er vigtige i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Derfor vil der i dette arbejde, RalGEF bidrag til onkogene og ikke-onkogene funktioner i humane NSCLC cellelinier, som forankringsafhængige og uafhængig vækst, celleoverlevelse og proliferation blev undersøgt. Blandt al menneskelig RalGEF, lyddæmpning af

RGL1

RALGPS1

havde ingen påviselig effekt. Men nedregulering af enten

RGL2

,

RGL3

,

RalGDS

eller, i højere grad,

RALGPS2

hæmmede celle befolkningstilvækst i forankring afhængige og uafhængige forhold (op til 90 og 80%, henholdsvis).

RALGPS2

silencing også forårsaget en stigning i antallet af apoptotiske celler, op til 45% af cellepopulationen i transformerede bronchiale BZR celler. I H1299 og A549, to NSCLC cellelinjer,

RALGPS2

lyddæmpning forårsagede en anholdelse af celler i G0 /G1-fasen af ​​cellecyklus. Det blev endvidere associeret med modulationen af ​​vigtige cellecyklus regulatorer: E3 ubiquitinprotein Ligase S-fase kinase-associeret protein 2 (Skp2) blev kraftigt nedreguleret (både ved mRNA og protein niveauer), og dets mål, cellens cyklus-hæmmere p27 og p21, blev opreguleret. Disse molekylære virkninger blev ikke efterlignes ved at lukke munden på

Rala

,

RALB

, eller begge dele. Men

RALB

lyddæmpning forårsagede en beskeden hæmning af cellecyklus, som i H1299 celler var forbundet med cyclin D1 regulering. Afslutningsvis

RALGPS2

er impliceret i kontrollen af ​​cellecyklusprogression og overlevelse i

in vitro

væksten af ​​NSCLC-cellelinier. Denne funktion er stort set uafhængig af Ral GTPaser og forbundet med modulering af Skp2, P27 og p21 cellecyklus regulatorer

Henvisning:. O. Santos A, Parrini MC, Camonis J (2016) RalGPS2 er afgørende for overlevelse og celle Cycle Progression af Lung Cancer Cells uafhængigt af sine Etablerede Typiske materialer Ral GTPaser. PLoS ONE 11 (5): e0154840. doi: 10,1371 /journal.pone.0154840

Redaktør: David J. Reiner, Texas A M University Health Science Center, UNITED STATES

Modtaget: Januar 13, 2016 Accepteret: 20. april, 2016 Udgivet: 5 maj 2016

Copyright: © 2016 O. Santos et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. AOS løn blev støttet af en bevilling fra “Fondation de France” (Ref Engt 2008005019, https://www.fondationdefrance.org/) og en fellowship fra “Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale” (INSERM, https://www.inserm.fr/), Frankrig, som “Soutien pour la formation à la recherche translationnelle en cancérologie” (konventionen n ° 201103) . arbejdet blev støttet af tilskud fra “Fondation de France” (JC: Ref Engt 2008005019), “Foreningen pour la Recherche sur le Cancer” (JC: SFI20111203931; MCP: SFI20121205710, https://www.fondation-arc.org /), “Ligue nationale contre le Cancer” (JC: RS12 /75-62, MCP: RS14 /75-54, https://www.ligue-cancer.net/), og af Association Christelle BOUILLOT (http: //bouillot-christelle.fr/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ras-proteiner er små GTPaser hyppigt muteret i human cancer. De har mange nedstrømseffektorer, herunder de små GTPaser “Ras-relateret protein Ral-A” (Rala) og “Ras-relateret protein Ral-B” (RalB), som aktiveres af guaninnukleotid Exchange Faktorer (RalGEF). Den RalGEF-Ral vej fået særlig opmærksomhed efter konstateringen af, at ekspressionen af ​​en mutant form af det GTPase HRas, der specifikt og udelukkende aktiverer denne signalvej er tilstrækkelig til Ras-induceret transformation af humane celler [1]. Der er seks Ral-specifikke guaninnukleotid exchange faktorer. Fire af dem, den Ral guanin nukleotid dissociation stimulator (RalGDS), RAL guanin nukleotid dissociation stimulatorer-lignende 1, -lignende 2 og -lignende 3 (RalGDS-like 1, -lignende 2 og -lignende 3 eller alternativt RGL1, RGL2 og RGL3), havnen Ras-bindende domæner og kan derfor direkte signalere nedstrøms de Ras proto-onkogener mod RAL GTPaser. Derudover Ral guanin nukleotid udveksling faktor med PH-domæne og SH3 domæne-bindende motiv 1 (RalGPS1) og Ral guaninnukleotid udveksling faktor med PH-domæne og SH3 domæne-bindende motiv 2 (RalGPS2) er to Ras-uafhængig RalGEF [2] . Ras-afhængige RalGEF (anmeldt i [3]) er blevet mere studeret end Ras-uafhængig RalGEF, som kendte funktioner er begrænset til cytokinese af HeLa-celler [4] og rotte fæokromocytom differentiering under Nerve Growth Factor stimulus [5]. Derudover trods omfattende arbejde på Rala og RalB GTPaser bidrag til human cancer [6], først for nylig deres rolle i lungekræft, ofte huser Ras onkogene mutationer, er blevet rapporteret [7,8]. Ikke desto mindre, RalGEF rolle i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er fortsat ukendt.

I dette arbejde, blev bidraget fra de seks RalGEF gener for menneskers NSCLC celleoverlevelse, proliferation og transformerede funktioner undersøgt. Den vigtigste strategi var at systematisk tavshed hver RalGEF i NSCLC cellelinjer der bærer forskellige Ras-mutationer (tabel 1) og til at studere de funktionelle bidrag hver RalGEF gen. På den måde kunne vi afdække uanede funktioner i en bestemt RalGEF, den RalGPS2 protein i celle overlevelse og G1-S cellecyklus faseovergang.

Materialer og metoder

Cell linier og kultur

HeLa og det humane NSCLC-cellelinjer H23, H1299, A549, og H838, var fra American Type Culture Collection (ATCC, katalognumre CCL-2, CRL-5800, CRL-5803, CCL -185, CRL-5844, henholdsvis) og blev dyrket i henhold til leverandørens anbefalinger. Den humane HeLa cellelinie blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (GIBCO, ref. 41.966-029 Invitrogen) suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS og 2 mM L-Glutamin. NSCLC cellelinjer blev dyrket i RPMI-Glutamax (GIBCO, ref. 61.870-010, Invitrogen) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, MP Biomedicals, ref. 092.910.154), 4,5 g /l glucose (ref. G8769 , Sigma) og 1 mM natriumpyruvat (ref.15070-063, Invitrogen). Alle celler blev holdt i eksponentielle vækstbetingelser ved 37 ° C i en fugtig atmosfære (90%), indeholdende 5% CO

2. Rutinemæssigt blev der ikke antibiotika tilsat til dyrkningsmedium og kulturer blev bekræftet at være fri for forurening med mycoplasma ved polymerasekædereaktion (PCR) (VenorGeM Classic, ref. 11-1100).

Humane embryoniske nyreceller stabilt udtrykker tidlige område af SV40, den katalytiske subunit af telomerase hTERT HEK-HT (HekHT) og HEK-HT-Ras

G12V (HekRasV12) -celler blev venligst leveret af Christopher Counter [9,10] og blev dyrket i DMEM suppleret med 10 % varmeinaktiveret FBS, 2 mM L-glutamin og antibiotika selektion (hygromycin 100 ug /ml neomycin 400 ug /ml, og i tilfælde af HekRasV12 også puromycin 0,5 ug /ml).

BEAS -2B og BZR blev indkøbt fra ATCC (katalognumre CRL-9609 og CRL-9483, henholdsvis) og blev dyrket i LHC-9-medium (GIBCO, ref. 12.680-013, Invitrogen) i belagte plader (uden nogen tilsætning BSA) . Belægningsopløsningen blev sammensat af 0,01 mg /ml fibronectin (Sigma, ref. F0895, Sigma-Aldrich) og 0,03 mg /ml collagen type I (ref. 207.050.357, Institut de Biotech., Frankrig) i LHC Basal medium med 0,01 mg /ml BSA (Sigma). For at opdele celler, eller plating til eksperimenter blev cellerne fritliggende hjælp Accutase Solution (SIGMA, ref. A6964, Sigma-Aldrich), centrifugeres og resuspenderes i frisk medium.

siRNA oligonukleotider og transfektion af celler

SiRNA meste indkøbt fra Eurogentec SA (Belgien) i form af afsaltet udglødet duplekser, enten tørre eller i opløsning. Kontrol siRNA sekvens (ON-TARGETplus Non-targeting siRNA # 1, opkaldt Sint i forkortet form) blev altid købt fra Dharmacon, (Thermo Fisher Scientific, USA). Target sekvenser er beskrevet i tabel 2. -siRNA lager koncentrationer blev altid bekræftet ved at måle løsning absorbans ved 260 nm, ved hjælp af ekstinktionskoefficienten som beregnet af Dharmacon hjemmeside for hver siRNA hybrid (https://www.thermoscientificbio.com/custom- modificeret-siRNA /), fortyndet i siRNA puffer (300 mM KCI, 30 mM HEPES, pH 7,5, 1,0 mM MgCl

2 -fra 5x pufferopløsning indkøbt fra Dharmacon, USA) og opdelt i prøver at minimere gentagen frysning /optøning-cykler. I nogle eksperimenter puljer af siRNA’er blev anvendt, som bestod i blandinger af ækvimolære mængder af 3 oligonucleotider.

siRNA oligonukleotider blev tilsat til celler i form af 5X lipoplekser fremstillet i OPTIMEM (Invitrogen) med en kommercielle transfektionsreagens (lipofectamin RNAiMAX, ref. 13.778.030, Invitrogen), opnå den endelige koncentration optimeres for hver cellelinie (sædvanligvis 10 nM eller 12 nM). Forholdet mellem transfektionsreagens til siRNA var enten 1 pi: 10 pmol eller 1 pi: 12 pmol, i alle andre aspekter fremstillet ifølge producentens anvisninger. Eksperimentelle faktorer blev optimeret til hver cellelinie for at have minimal transfektion toksicitet (forskellen mellem ubehandlede og Sint-behandlede celler) og maksimal positiv kontrol effekt (siPLK1). Salg

Resazurin reduktion assay

Celler blev udpladet aftenen før transfektion i 96 brønds-plader ved optimeret vægtfylde for hver cellelinie, der garanteret under-konfluens på det endelige tidspunkt. Ubehandlede, Sint og siPLK1 kontroller var til stede ved hver plade. Optimale betingelser var dem, hvor i gennemsnit den relative resazurin reduktion af celler behandlet med Sint (Non-Targeting kontrolsekvens) var over 75%, og af celler behandlet med siPLK1 var 10% eller mindre. Til transfektion blev mediet erstattet med 64 pi frisk komplet medium uden antibiotika og siRNA: Lipofectamin RNAiMax lipoplekser blev tilsat i 16 pi, til brønde i fire eksemplarer. Frisk medium blev tilsat til brønde på 24 eller 48 timer efter transfektion. Ved den afsluttende tidspunkt (72 h for Hela, 96h for A549, H1299, HekHT og HekRasV12, og 120h for H23-celler) blev mediet erstattet med 200 pi RPMI uden phenolrødt indeholdende resazurin (SIGMA

®, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) ved 10 ug /ml og inkuberet ved 37 ° C i 2 h-4 timer. Fluorescens blev læst med en pladelæser ved de bølgelængder af 540 nm (excitation) og 620 nm (emission), og resultaterne blev udtrykt som procent af fluorescenssignalet af ubehandlede celler efter baggrundssubtraktion.

Western blots

Celler blev udpladet i 6-brønds plader over-nat og før transfektion blev mediet udskiftet med 2 ml frisk komplet vækstmedium (uden antibiotika). Cellerne blev behandlet med 0,5 ml 5X siRNA lipoplekser som beskrevet i det foregående afsnit. 48 timer til 96 timer efter transfektion blev celler vasket med phosphatbuffer saltvand uden calcium og lyseret med Triton lysepuffer (1% Triton X-100, 5 mM MgC

2, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4) suppleret med proteasehæmmere cocktail tablet (ref. 11873580001 Roche) ifølge standardprocedurer, eller direkte lyseret med 2X Laemmli puffer (Tris-HCI 62,5 mM, glycerol 15%, SDS 4%, bromphenolblåt 0,01%, DTT 200 mM, pH 6,8) suppleret med phosphataseinhibitorer og kogt. Opløselige proteinprøver fra Triton lysater blev kvantificeret under anvendelse af BCA protein assay kit (Pierce, ref. 23225, Thermo Scientific), derefter fortyndet i lysepuffer til samme koncentration blandt rør, Laemmli puffer tilsat til 1X koncentration, og kogt. Laemmli buffer-lysater blev kvantificeret under anvendelse af et turbidimetrisk Protein Kvantificering Assay (ref. 740967,250, Machery-Nagel) og fortyndet til ækvivalente koncentrationer. Prøver blev påført på præfabrikerede (4-15% eller “ethvert kD” gradient polyacrylamidgeler, Bio-Rad) eller på nystøbt 10 eller 12% polyacrylamidgeler. Efter elektroforese blev proteinerne overført til en 0,2 uM nitrocellulose transfer-membran (Whatman). Følgende primære antistoffer og fortyndinger blev anvendt: muse-anti-Adaptin α (ref 610.502, BD Biosciences, 1:. 1000), muse-anti-Rala (ref 610.222, BD Biosciences, 1:. 1000), muse-anti-Actin (ref . A5441, Sigma-Aldrich, 1: 10000), kanin-anti-RalB (ref 3523, Cell Signaling, 1:. 500), muse-anti spaltet PARP (ref 552.597, BD Pharmingen, 1:. 1000), kanin-anti-cyklin D1 (ref 2922, Cell Signalling, 1:. 1000), muse-anti-cyclin D3 (ref 2936, Cell Signalling, 1:. 2000), muse-anti-p21 (ref 2946, Cell Signalling, 1:. 1000), kanin anti-p27 (ref. sc-527, Santa Cruz, 1: 1000) (ref. sc-7164, Santa Cruz, 1: 1000), kanin-anti-Skp2. Passende konjugerede sekundære antistoffer blev anvendt enten til visualisering af klatter ved forøget kemiluminescensdetektion (vestlige Lightning

® Plus-ECL, PerkinElmer) eller LICOR Odyssey Infrarød Imaging System (LI-COR Biosciences).

Kvantitativ real tid revers-transskription PCR

Celler blev udpladet aftenen før transfektion og transficeret som beskrevet for Western blot-analyse. På det angivne tidspunkt, blev supernatanten fjernet, og celler blev lyseret med 350 pi RTL buffer fra RNeasy

® mini kit (QIAGEN GmbH, Hildon, Tyskland) med ekstemporalt tilsat beta-mercaptoethanol og holdt ved -80 ° C. Totalt RNA blev isoleret med RNeasy

® mini kit, ifølge producentens anvisninger, herunder genomisk DNA elimination. Absorbansen ved 260 nm, og 260 /230-260 /280 nm-forhold, blev anvendt til at kvantificere og bestemme kvaliteten af ​​det isolerede RNA. 1 ug RNA blev revers transkriberet under anvendelse af iScript

™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories) ifølge producentens protokol. Kvantitativ revers-transkription real-time PCR (qPCR) blev udført under anvendelse af enten specifikke primere (købt hos Sigma Proligo, tabel 3) og SYBR Green PCR Master Mix (ref. 4.367.659, Applied Biosystems), eller Taqman probesæt (Applied Biosystems, tabel 4) og Taqman PCR Master Mix (Applied Biosystems). Reaktioner blev udført i 25 pi (SYBR green) eller 20 pi (Taqman) af slutvolumen hjælp af Chromo4 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories). Annealing og forlængelse temperaturen var 60 ° C, og primere var på 300 nM. I SYBR Green analyser blev startet smeltekurveanalyse protokol den umiddelbart efter amplifikation at bekræfte specificiteten af ​​reaktionen. Den procentdel af hver mRNA blev beregnet af Pfaffl metoden [11] ved hjælp af

Beta-2-mikroglobulin

som reference gen. Primer effektivitet blev eksperimentelt bestemt ud fra kalibreringskurver indgår i det mindste i de første tre reaktioner, og en gennemsnitlig effektivitet værdi blev brugt de andre gange.

trypanblå udelukkelse assay

celler blev udpladet i 6-brønds plader og transficeret med siRNA’er som beskrevet ovenfor. Ved hvert 24 timer interval blev begge supernatanter og celler fritliggende med trypsin og opsamlet i koniske rør, centrifugeret, derefter blev cellerne resuspenderet i ca. 0,7 ml frisk medium. Levedygtige og ikke-levedygtige celler blev automatisk talt under anvendelse Vi-Cell celletæller (Backman), som bestemmer cellelevedygtighed ved trypan blå-udelukkelse.

Forankringsuafhængig vækst

H1299-celler blev udpladet i 6-brønds plader og transficeret med siRNA som beskrevet ovenfor. Den følgende dag (ca. 20 timer senere), ikke-vedhæftende 6-brønds plader (ubehandlede plastik yderligere overtrukket med 0,01% pluronic, Sigma-Aldrich), blev belagt med 2 ml 0,75% lavtsmeltende agarose (Sigma-Aldrich), fremstillet ved at blande lige volumener af 1,5% agarose fremstilles i vand og 2X komplet medium uden phenolrødt, og venstre at størkne ved stuetemperatur. Før brug ekstra smeltetemperatur lav agarose på 0,75% blev fremstillet og holdt i et vandbad ved 37 ° C. Celler blev opsamlet med Accutase, talt, fortyndet til den samme koncentration (25000 /ml) og fordeles i 5 ml polypropylenrør (0,8 ml pr rør). En portion af den samme cellesuspension blev fordelt i parallel til at replikere brønde af hvide plader med 96 brønde for at bekræfte input af CellTiter Glo-assay (ref. G7571, Promega). 3,2 ml 0,75% agarose blev grundigt men omhyggeligt blandet med celler og 1 ml /brønd blev straks udpladet i tre eksemplarer. Efter størkning af agarose, blev ekstra medium (uden phenolrødt) tilsat til brøndene blev pladerne overført til cellen inkubatoren og flydende medium på toppen omhyggeligt erstattet hver 2-3 dage.

Efter 14 dage mediet var fjernet, og 0,3 ml af en 0,05% MTT-opløsning i PBS blev sat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i 30 min til 1 time ved 37 ° C og derefter scannet ved høj opløsning (Epson Perfection V700 Photo), og kolonier tælles ved hjælp af softwaren ImageJ.

cellecyklusfordeling og aktiv caspase-3 evaluering ved flow cytometri

Celler blev udpladet i plader med 12 brønde og transficeret med siRNA’er som beskrevet ovenfor. Ved 72 timer efter transfektion blev supernatanterne opsamlet i 15 ml rør og anbragt på is. Celler blev høstet med Accutase og sat til hver respektiv supernatant rør. Rør blev centrifugeret ved 4 ° C, og cellepellets blev resuspenderet i PBS indeholdende 0,05% BSA. Celler blev fikseret og permeabiliseret ved tilsætning forafkølet -20 ° C 70% ethanol dråbevis til celler, derefter holdt i is i mindst 30 min. Celler blev vasket med PBS, derefter med PBS indeholdende 0,05% BSA, og resuspenderes i 0,25 til 0,4 ml PBS indeholdende 0,05% BSA plus propidiumiodid (50 ug /ml). RNase (5 pi af en bestand koncentration på 10 mg /ml) og 6 pi anti-aktiv caspase-3-antistof (Ref 559.341, BD Biosciences) blev tilsat til 0,2 ml propidiumiodid-farvede celler i 5 ml FACS rør, inkuberet beskyttet mod lys ved stuetemperatur i mindst ca. 15 minutter og analyseret ved flowcytometri (BD ™ LSRII, BD Biosciences), eller holdt ved 4 ° C og erhvervet sidstnævnte samme dag. Data blev udført i forbindelse med Active Caspase-3 med FlowJo Software (Flojo, LLC), eller i tilfælde af cellecyklus distribution med ModFit LT ™ (Verity Software hus).

Ral-GTP pull ned

Celler blev udpladet i 15 cm plader, og høstet mens cellemonolaget var mindre end 70-80% sammenflydende. Én plade hver gang, i kølerum, på is, blev cellerne vasket en gang med iskold PBS. Cellerne blev lyseret med lysepuffer (1 ml, Tris.HCI 50 mM, pH 7,4, NP40 1%, glycerol 15%, NaCl 200 mM, MgCI2 5 mM, suppleret med proteaseinhibitorer) og lysater blev klaret ved centrifugering (2 min ved 10000 rpm, i kølerum). Supernatanterne blev alikvoteret i 3 rør (for protein kvantificering, input Western blots og træk-down eksperimenter), derefter straks lynfrosset i flydende nitrogen.

glutathion magnetiske perler (Pierce # 88.822) blev vasket 3 gange med 3 fold deres volumen af ​​vaskebuffer a (Tris.HCI 125 mM, pH 8, NaCl 150 mM, suppleret før brug med proteasehæmmere), inkuberet 30 min til 1 time i den samme buffer på et roterende hjul ved 4 ° C med lysater fra

E

.

coli

celler, der udtrykker GST-fusionerede Ral bindingsdomæne fra Sec5 (GST-Sec5-RBD, RBD er den N-terminale 1-99 aa af Sec5) [12,13], og igen vasket 3 gange med Vask puffer A. Derefter blev perlerne resuspenderet i lysepuffer og opdelt i forskellige mikrorør (40 pi perler seng per mikrorør).

Hver lysat blev optøet og det ønskede protein beløb blev inkuberet i 45 minutter til 1 time med GST -Sec5-RBD-perler på det roterende hjul ved 4 ° C. Perlerne blev derefter hurtigt vasket to gange med 0,5 ml vaskebuffer B (Tris.HCI 25 mM, NaCl 40 mM, MgCI2 30 mM, pH 7,5). Så 15 pi 2X Laemmli prøvebuffer blev sat til perler, som derefter blev kogt 2 minutter, og straks frosne eller indlæst på gel.

Resultater og Diskussion

RGL2, RGL3, RalGDS og RalGPS2 er kræves til in vitro forankringsafhængige og forankringsuafhængig vækst cellepopulation

Vi startede med at evaluere nødvendigheden af ​​hver af de seks RalGEF for

in vitro

proliferation og /eller overlevelse af fire humane NSCLC cellelinjer huser forskellige Ras-mutationer (A549, H23, H1299, H838), sammenlignet med andre cellelinjer hvor Ral og RalGEF proteiner er blevet undersøgt i fortiden: HeLa (livmoderhals kræft), HEK-HT-HRas

G12V (transformeret cellelinie, fra nu af navngivne HekRasV12) og dens isogene par HEK-HT (immortaliserede cellelinie, heri også kaldet HekHT) [10]. Nærmere oplysninger om væv histologi og Ras mutation status cellelinier der anvendes i dette arbejde er angivet i tabel 1.

Efficiencies af siRNA oligonukleotider mod RalGEF (to til tre siRNAs pr gen) blev bekræftet ved qPCR (S1 Fig ): mål-mRNA-ekspressionen var under 30% af endogent niveau for alle siRNA-sekvenser, ved 72 h efter transfektion bekræftes i mindst to uafhængige cellelinjer

den metaboliske reduktion resazurin assay blev anvendt til måling celle. befolkningstilvæksten. For hver cellelinie blev betingelserne og varigheden af ​​cellen dyrkningsperioden transfektions- valgt ved at sikre: 1- at celler ikke nåede sammenflydning under assay; 2-, at væksten inhibitoriske virkning af et ikke-targeting siRNA (Sint, den negative kontrol) blev minimal ( 15-20%) sammenlignet med celler, der ikke afgives til transfektion (ubehandlede celler); og 3-, at vækstinhiberende virkning af en siRNA mod en positiv kontrol (vi valgte polo-lignende kinase 1) var maksimal (≥ 90%). Anvendelse af dette assay, observerede vi, at

RGL1

RalGPS1

mRNA silencing havde ingen påviselig virkning på cellepopulation vækst (Fig 1A og 1E, henholdsvis), hvilket antyder, at de er undværlige for vækst cellepopulation , påvirker væsentligt hverken overlevelse eller proliferation i disse celler. Imidlertid kan den fortsatte eksistens af disse to proteiner på grund af høj proteinstabilitet ikke udelukkes, da vi ikke kunne følge protein henfald over tid på grund af manglende tilgængelighed af specifikke antistoffer. Udtømning af RGL2, RGL3 eller RalGDS inducerede partiel væksthæmning (varierende fra 12 til 70% i forhold til sint, Fig 1B, 1C og 1D). Interessant silencing af Ras-uafhængig RalGEF genet

RALGPS2

inducerede en meget stærk inhibering af cellepopulationen vækst i alle de NSCLC cell afprøvet (op til 90%, Fig 1F) linjer. Desuden er denne effekt var ikke specifik for NSCLC cellelinier, da det blev observeret også i cellelinier med oprindelse i nyre (HekHT /HekRrasV12) og livmoderhalsen (HeLa-celler), og i en ikke-transformeret cellelinie (HekHT). Uafhængighed fra tilstedeværelsen af ​​et aktiveret ras-gen kunne forventes for en Ras-uafhængig RalGEF.

(A-F) cellepopulation vækst i adhærens blev målt under anvendelse reduktionen resazurin assay og udtrykkes som procent af ubehandlede (ikke-transficerede) celler (gennemsnit ± SEM,). Det blev vurderet fra 72 til 120 timer efter celletransfektion, afhængigt af den optimerede betingelse for hver enkelt cellelinje. Hvert panel viser effekten af ​​tavshed én RalGEF med to eller tre uafhængige siRNA oligonukleotider: (A)

RGL1

; (B)

RGL2

; (C)

RGL3

; (D)

RalGDS

; (E)

RALGPS1

; (F)

RALGPS2

. Effekten af ​​hver siRNA blev statistisk sammenlignet med effekten opnås med sint med to-vejs ANOVA og Bonferroni posttests (*

s

≤ 0,05, **

s

≤ 0,01, ***

s

≤ 0,001;

n

= 2 til 4 middelværdier fra uafhængige forsøg, der hver udført i firdobbelte brønde). (G) forankringsuafhængig vækst af H1299-celler blev evalueret over 14 dage, og er udtrykt som gennemsnit relative koloni nummer i forhold til Sint-behandlede celler. Data blev indsamlet fra uafhængige forsøg, hvor siPLK1 (positiv kontrol) stammer ingen eller meget få kolonier. (H) Illustrative billeder af H1299 kolonier i agarose på 14 dages vækst efter Sint, siPLK1, siRalGPS2 # 231, og siRalGPS2 pool, som angivet. Statistisk sammenligning blev gjort ved En-vejs ANOVA med Dunnetts posttest. (*

s

≤ 0,05, **

s

≤ 0,01, ***

s

≤ 0,001;

n

= 2 (siRGL1 og siRALGPS1 ), 3 (siRalGPS1 og siRalGPS2) eller 4 (siRGL2, siRGL3 og siRalGDS) uafhængige eksperimenter, hver udført i tredobbelte brønde.

i modsætning til immortaliserede celler, transformerede celler udviser evnen til at overleve og formere sig i forankringsuafhængige vækstbetingelser. virkningen af ​​RalGEF udtynding i forankringsuafhængig vækst blev testet ved at score antallet af kolonier af H1299-celler i agarose vingummi medium. Mens

RGL1

RALGPS1

silencing havde ingen påviselig effekt,

RGL2

,

RGL3

,

RalGDS

og

RALGPS2

forbigående tavshed væsentligt hæmmet forankringsuafhængig vækst af H1299 celler, parallelt observationerne fremstillet i adhærens betingelser (fig 1G). Interessant nok den inhiberende virkning af

RGL3

RalGDS

nedregulering i forankringsuafhængig vækst blev mere udtalt (ca. 75% inhibering) end virkningen observeret på vedhængende celler (ca. 45% og 35% vækstinhibering). Da

RALGPS2

lyddæmpning vises den stærkeste fænotype, alt videre arbejde med fokus på RalGPS2.

RalGPS2 er nødvendig for in vitro celle overlevelse

Ved udtømning af RalGPS2 en høj procentdel af den cellepopulation viste fænotypiske tegn af celledød: celler oprunding, løsgøre og blæredannelse (S2 fig). Endvidere trypanblåt -eksklusionsassay påvist, at den stærke vækstinhibering på dag 3 og 4 efter transfektion af H1299-celler (fig 2A) var i det mindste delvist skyldes en reduktion på 10 til 20% af cellelevedygtighed (figur 2B). Derfor er RalGPS2 påkrævet for celleoverlevelse. Desuden blev celler sandsynligvis dø gennem apoptose, som indikeret ved stigningen på 10 til 15% i antallet af celler med aktiverede caspase-3 som analyseret ved flowcytometri i H1299 celler (Fig 2C), og detektering af spaltet Poly [ADP-ribose ] polymeraser (PARP) i Western blots af A549-celler (S3 fig). Den RalGPS2 udtømning-effekt på apoptose blev yderligere udforsket i en HRas

G12V onkogen kontekst ved at lukke munden på sit udtryk i isogene par bronchiale cellelinjer BEAS-2B (udødeliggjort) og BZR (BEAS-2B udtrykker HRas

G12V) . Interessant Caspase-3-aktivering ved RalGPS2 depletion i BZR celler var ca. 2 gange mere hyppigt end i isogene immortaliseret human bronchial epitelcelle BEAS-2B (Fig 2D). Dette resultat antyder HRas

GV12 onkogen-induceret sensibilisering af celler til RalGPS2 for overlevelse, selv om den globale virkning på cellepopulation, som vurderet ved resazurin reduktion assay, var ens (S4 Fig), som for de øvrige isogene par ( HekHT og HekRasV12, figur 1).

(A) antallet af levedygtige H1299 celler og (B) procentdelen af ​​levedygtigheden efter induktion af RalGPS2-depletion blev opnået dagligt i fire dage med trypanblåt -eksklusionsassay og statistisk sammenlignet med to-vejs ANOVA og Bonferroni posttests (*

s

≤ 0,05, ***

s

≤ 0,001;

n

= 2 uafhængige forsøg, hver i tre eksemplarer ). (C) Andelen af ​​celler, der indeholder aktive caspase-3 blev evalueret 72 timer efter transfektion med siRalGPS2, ved flowcytometri analyse, i H1299 celler og (D) i isogene par af den udødeliggjort BEAS-2B og HRas

G12V transformerede BZR celler. Statistisk signifikans blev vurderet henholdsvis envejs ANOVA med Dunnetts posttest, **

s

≤ 0,01 og ***

s

≤ 0,001,

n

= 4 eller 5 uafhængige forsøg (C); og to-vejs ANOVA med Bonferroni posttest,

### p ≤ 0,001,

n

= 2 eller 3 uafhængige forsøg (D).

RALGPS2-tavshed effekter går ud over Rala og RalB

Dernæst spurgte vi, i hvilket omfang Ral proteiner er impliceret nedstrøms RalGPS2 i cellevækst befolkning og overlevelse.

Rala

nedregulering havde ingen effekt på cellepopulation vækst (bortset fra en delvis 20% vækstinhibering i én cellelinje, H1299, ud af den testede seks), mens upon RalB depletion var der en delvis hæmning af vækst i fem ud af seks testede cellelinier (24 til 38% betyde forskel fra Sint, fig 3A), selv om mindre omfattende end det, der blev observeret af tavshed

RALGPS2

i de samme celler (61 til 96% gennemsnitlig forskel fra Sint i lungekræft-cellelinjer 41 til 62% gennemsnitlig forskel fra Sint i ikke-lunge cancer cellelinjer, fig 1F). Derudover, i modsætning til den etablerede rolle RalB i celleoverlevelse [14], vi ikke observere apoptose ved RalB depletion i hverken A549 eller H1299 lunge cellelinjer, som analyseret ved caspase-3-aktivering (fig 3B) og spaltes PARP (Fig 3C). Disse resultater viste, at befolkningstilvæksten hæmning induceret af

RALB

lyddæmpning ikke skyldtes celledød, i hvert fald i disse to NSCLC cellelinjer, og rejste den mulighed, at

RALB

lyddæmpning kan påvirke celle cyklus progression, som behandles i det følgende afsnit.

(A) Cell befolkningstilvækst blev vurderet i cellelinjer, der er angivet i grafen ved resazurin reduktion 72-120 timer efter transfektion, og udtrykkes som procentvise nedbringelse resazurin relativt til ubehandlede celler. Effekten af ​​hver siRNA blev statistisk sammenlignet med effekten opnås med sint (negativ kontrol) ved to-vejs ANOVA og Bonferroni posttests (*

s

≤ 0,05, **

s

≤ 0,01, ***

s

≤ 0,001;

n

= 2 eller 3 uafhængige forsøg, hver middelværdien opnået fra firdobbelte brønde). (B) Caspase-3-aktivering blev bedømt ved flowcytometrianalyse 72 timer efter transfektion og udtrykkes som procentdelen af ​​cellepopulationen med positiv staning. Statistisk signifikans blev vurderet ved envejs ANOVA med Dunnetts posttest men ingen betydning blev opnået (

n

= 3 uafhængige forsøg). (C) Western blots af den angivne cellelinjer og tidspunkter viser Rala og RalB protein nedregulering, kløvet Poly [ADP-ribose] polymeraser (kl. PARP) immundetektion og Actin eller Adaptin lastning kontrol.

Seneste Theodorescu laboratorium arbejde viste, at i lungekræft-cellelinjer effekten af ​​lyddæmpende

Rala

og /eller

RALB

er cellelinje afhængig, og sandsynligvis afhængig af typen af ​​Ras mutation til stede [7] . I overensstemmelse med denne celletype-variabilitet, kan vi observere en moderat stigning i spaltet PARP på Western blots med HeLa og lungekræft H23 cellelinier, men ikke med A549 og H1299 cellelinjer (fig 3C), hvilket antyder, at celledød kan faktisk bidrage til