PLoS ONE: En EGFR /HER2-Bispecifikke og enediyn strømløse Fusion Protein Shows High Effekt mod esophageal kræft

Abstrakt

Kræft i spiserøret er en af ​​de mest almindelige kræftformer, og 5-års overlevelse er mindre end 10% på grund af manglen på effektive terapeutiske midler. Denne undersøgelse var at evaluere antitumoraktivitet af Ec-LDP-Hr-AE, et nyligt udviklet bispecifikt enediyn strømløs fusionsprotein målrettet både epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2), om kræft i spiserøret. Fusionsproteinet Ec-LDP-HR-AE består af to oligopeptid ligander og et enediyn antibiotikum lidamycin (LDM) for receptorbinding og celledrab hhv. Den aktuelle undersøgelse viste, at Ec-LDP-Hr havde høj affinitet til at binde til esophageal planocellulært karcinom (ESCC) celler, og enediyn strømløs fusionsprotein Ec-LDP-Hr-AE viste potent cytotoksicitet til ESCC celler med differentieret udtryk for EGFR og HER2. Ec-LDP-Hr-AE kan forårsage betydelig G2-M anholdelse i EC9706 og KYSE150 celler, og det også induceret apoptose i ESCC celler i en dosis-afhængig måde. Western blot-analyser viste, at Ec-LDP-Hr-AE fremmet caspase-3 og caspase-7 aktiviteter samt PARP spaltning. Desuden Ec-LDP-HR-AE inhiberede celleproliferation via faldende phosphorylering af EGFR og HER2, og længere udøves inhibering af aktiveringen af ​​deres downstream signalmolekyler.

In vivo

ved en tolereret dosis, Ec-LDP-Hr-AE hæmmede tumorvækst med 88%, når det blev administreret til nøgne mus med human ESCC celle KYSE150 implanteret. Disse resultater viste, at Ec-LDP-Hr-AE udviste potent anti-caner effekt på ESCC, hvilket tyder på det kunne være en lovende kandidat til målrettet terapi af kræft i spiserøret

Henvisning:. Guo XF, Zhu XF, Yang WC Zhang SH, Zhen YS (2014) En EGFR /HER2-Bispecifikke og enediyn strømløse Fusion Protein Shows High Effekt mod esophageal kræft. PLoS ONE 9 (3): e92986. doi: 10,1371 /journal.pone.0092986

Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA

Modtaget: November 29, 2013; Accepteret: 27 februar 2014; Udgivet: Marts 24, 2014

Copyright: © 2014 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes delvist af Natural Science Research Project of Education Department of Henan-provinsen, Kina (nr 12B350004 til XFG), National Natural Science Foundation of China (nr 81.202.447 til XFG, https://www.nsfc.gov. cn /Portal0 /default152.htm), og en bevilling fra USCACA (nr USCACA-TIGM-001 til WCY). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i spiserøret er et af de mest almindelige cancere, såvel som den sjette mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald i verden. De nordlige regioner i Henan provinsen i Kina har den højeste forekomst af kræft i spiserøret, især esophageal pladecellekræft (ESCC) [1], [2]. Selvom mange behandlingsmuligheder er nu tilgængelige, herunder kirurgi, kombineret modalitet strategier såsom før eller efter operation kemoterapi med eller uden strålebehandling, og endelig chemoradiation, prognosen for kræft i spiserøret er dårlig med en 5-års overlevelse mindre end 10% [3] – [5]. På grund af ulemperne ved kemoterapi agenter, såsom alvorlige toksiske bivirkninger, den høje forekomst af lægemiddel-resistens, og små effekter på overlevelse, er der et presserende behov for udvikling af nye effektive terapeutiske midler rettet mod specifikke molekylære abnormiteter i spiserøret . carcinomer, især dem i den humane epidermale vækstfaktorreceptor (HER) familie [6]

HER-familien af ​​tyrosinkinasereceptorer indeholder fire medlemmer: HER1 /EGFR, HER2 /neu, HER3 og HER4. Ligandbinding til receptorerne resulterer i receptordimerisering, initierer derefter en række intracellulære hændelser, der til sidst fremmer cellevækst, proliferation, differentiering og migration [7]. Overekspression af epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) og human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) er blevet observeret i mange humane cancere, såsom lunge, hoved og hals, bryst, ovarie, og de har vist sig at spille en vigtig rolle i både dannelse og fremadskriden af ​​mange almindeligt forekommende cancere [8]. I kræft i spiserøret, EGFR overekspression forekommer i 30% -90% [9], [10], og HER2 overekspression spænder fra 19% -43% [11]. Endvidere overekspression af både EGFR og HER2 blev observeret i 18% -25% af patienter med kræft i spiserøret [12], [13]. Derfor vil en agent målrette både EGFR og HER2 udviser mere effektive terapeutiske virkninger på esophageal kræftpatienter.

Ec-LDP-Hr-AE, et bispecifikt fusionsprotein bestående af to oligopeptider (EF, 22 aminosyrer af EGF og Hr, VH CDR3-regionen af ​​anti-HER2 C6.5 antistof) specifikt for EGFR og HER2, og en enediyn antibiotisk lidamycin (LDM) blev konstrueret og rapporteret i vores tidligere undersøgelse [14]. Den viste potent cytotoksicitet til en række af carcinomceller

in vitro

, og var meget effektive til at inhibere væksten af ​​humane ovarie caner SK-OV-3 xenotransplantater

in vivo

. Imidlertid er antitumor effekt af Ec-LDP-Hr-AE på kræft i spiserøret ikke godt undersøgt. I denne undersøgelse, vi ikke kun målt bindingsaffiniteten af ​​Ec-LDP-Hr fusionsprotein til esophageal Caner celler, men også vurderet styrken af ​​energi fusion proteiner

in vitro

in vivo

. Virkningerne af Ec-LDP-Hr-AE på cellecyklus distribution og apoptose blev også analyseret. For at belyse de mekanismer, der er involveret i cytotoksicitet og apoptose-induktion af Ec-LDP-Hr-AE, udtryk for apoptose relaterede molekyler og centrale molekyler i HER signalveje blev analyseret som godt.

Materialer og metoder

Etik erklæring

BALB /c nøgne mus (6-8 uger), der anvendes i forsøgene blev købt fra Institut for forsøgsdyr Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, og var vært under specifik patogen -fri forhold. Den eksperimentelle protokol blev godkendt af Dyreforsøgstilsynet etiske komité af Institut for Medicinalkemi Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences.

cellelinjer og kultur

Menneskelig esophageal carcinoma cellelinier EC1, ECa109, EC9706 og KYSE150 og muse fibroblast cellelinie NIH 3T3 blev opnået fra Cell center of Peking Union Medical College, Kina, og dyrkes under en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum ( FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 2 mmol /l glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.

Reagenser og antistoffer

(3- (4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2, 5-dipheny-ltetrazolium (MTT), fluoresceinisothiocyanat (FITC) og isoprophyl-β-D-thiogalactopranoside (IPTG) blev erhvervet fra Sigma Chemical Aldrench Inc. (St. Louis, MO, USA). Alle de antistoffer, herunder phosphoryleret-HER2, -EGFR, -Akt, -extracellular reguleret proteinkinase (ERK), -p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), -C-Jun N-terminal kinase ( JNK) monoklonale antistoffer og anti-EGFR, -HER2, -Akt, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -caspase 3, -caspase 7 blev -cleaved PARP antistoffer fås fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-β-actin-antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Peberrod peroxidase (HRP) -konjugeret gede anti-kanin /mus antistoffer blev også købt fra ved Cell Signaling Technology.

Udarbejdelse af strømførende fusionsproteiner

Udarbejdelsen af ​​bispecifikt fusionsprotein Ec-LDP- hr-AE og dens tilsvarende monospecifikke fusionsproteiner Ec-LDP-AE og LDP-hR-AE blev beskrevet i vores tidligere undersøgelse [14]. Kort fortalt blev DNA-fragmenter, der koder for Ec-LDP-HR, Ec-LDP og LDP-Hr opnået ved PCR og DNA-kloningsteknikker, og så blev de indsat i pET30a vektor for at generere ekspressionsplasmiderne PET-

Ec-LDP- hr

, PET-

Ec-LDP

PET-

LDP-hR

. Disse plasmider blev derefter transformeret ind i

Escherichia coli BL21

(

DE3

), og fusionsproteinerne blev udtrykt ved tilsætning af IPTG. Fusionsproteinerne blev udvundet fra det periplasmiske rum af

E.coli

ved osmotisk chok metode (PET-system manual, 9

udgave, Novagen) og renses ved affinitetskromatografi (HisTrap HP søjle, GE Healthcare) . De strømførende fusionsproteiner Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE og LDP-Hr-AE blev konstrueret ved at integrere den aktive enediyn kromofor (AE) i lidamycin til EF-LDP-HR, Ec-LDP og LDP- Hr proteiner, henholdsvis.

bindingsaffinitet assay

En strøm-cytometri-baserede immunfluorescens-assay blev anvendt til at måle bindingsaffiniteten af ​​fusionsprotein Ec-LDP-HR til esophageal cancerceller [15] . EF-LDP-Hr protein blev FITC mærket i 16 timer i en carbonat bufferopløsning (100 mmol /l NaHCO

3, 10 mmol /l Na

2CO

3, pH 9,0) ved 4 ° C . Mærket protein blev separeret fra ubundet FITC ved anvendelse af Sephadex G-25 søjle (GE Healthcare). Derefter FITC-mærket Ec-LDP-HR-protein blev inkuberet med 10

6 EC9706 celler, KYSE150 celler eller NIH 3T3 celler i et 100 pi volumen buffer (PBS + 2% FBS) i 2 timer ved stuetemperatur. Efter tre gange vask med 500 pi puffer blev celler analyseret med flowcytometer (BD Company). Dataene blev analyseret med Prism 5 software (GraphPad Software). Salg

MTT assay

Celler blev løsnet ved trypsinisering og udpladet i 96-brønds fladbundede plader, dyrket i 24 timer før eksponering for forskellige koncentrationer af LDM, Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE eller LDP-Hr-AE i 48 timer. MTT-opløsning (5 mg /ml, 20 pi) blev tilsat til hver brønd og inkuberes i yderligere 4 timer ved 37 ° C. Supernatanten blev fjernet og 150 pi DMSO blev sat til hver brønd. Absorbansen ved 570 nm blev målt under anvendelse af et Multiskan Spectrum instrument (Thermo Labsystems, Rochford, IL, USA). Absorbansværdier blev udtrykt som en procentdel af tiden for ubehandlede celler, og koncentrationerne af testede midler resulterer i 50% væksthæmning (IC

50) blev beregnet.

cellecyklusfordeling analyse

virkningerne af bispecifikt fusionsprotein Ec-LDP-Hr-AE på cellecyklus blev evalueret ved hjælp af propidiumiodid (PI) farvning. Efter behandling med 0,1 nmol /l, 0,5 nmol /l og 1 nmol /L Ec-LDP-HR-AE i 48 timer, EC9706 og KYSE150 celler blev spaltet med trypsin-EDTA og vasket med PBS. Cellerne blev derefter resuspenderet i 500 pi PBS med 50 ug /ml PI og 100 ug /ml RNase A. Efter inkubering ved 37 ° C i 30 minutter blev cellerne analyseret for fluorescens med et flowcytometer (BD Company).

Cell apoptose assay

virkningerne af bispecifikt fusionsprotein Ec-LDP-Hr-AE på at inducere apoptose i ESCC celler blev målt ved hjælp af Hoechst farvning og Annexin V-FITC /PI farvning. For Hoechst farvning blev KYSE150 celler dyrket på coverslides og inkuberet i 24 timer, derefter 0,1 nmol /l, 0,5 nmol /l og 1 nmol /L Ec-LDP-HR-AE blev tilsat og inkuberet i yderligere 48 timer. Celler i coverslides blev fikseret med methanol, vasket med PBS og farvet med 1 mg /ml Hoechst 33342 i 15 minutter. Billederne blev observeret under et fluorescensmikroskop (Nikon TE 2000 u). For Annexin V-FITC /PI farvning blev de apoptotiske celler målt med en Annexin V-FITC /PI-farvning kit (Biosea teknologi). Efter 0,1 nmol /l, 0,5 nmol /l og 1 nmol /l af Ec-LDP-HR-AE behandling i 48 timer blev cellerne høstet, vasket to gange med PBS og centrifugeret ved 1.000 rpm i 5 min. Cellepellets blev resuspenderet i 500 pi bindingsbuffer indeholdende 10 pi Annexin V-FITC og 5 pi PI, inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter, og derefter analyseres for fluorescens med et flowcytometer (BD Company).

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i 30 minutter i radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer indeholdt adskillige proteaseinhibitorer (f.eks 1 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin, 1 mmol /l phenylmethylsulfonylfluorid, 2 mmol /L Navo

4, og 50 mmol /l NaF). Protein ekstraheret fra celler blev kvantificeret under anvendelse af bicinchoninsyre-kit (Pierce Biochemicals), og 30 pg af hvert totalt protein blev påført på 10% SDS-PAGE og derefter elektroblottet på polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore). Membranerne blev inkuberet med 1% BSA i 2 timer ved stuetemperatur inden inkubering natten over ved 4 ° C med primære antistoffer (fortyndet 1:1000 med TBST-buffer, Cell Signaling Technology). Derefter blev membranerne inkuberet med sekundære HRP-konjugeret antistoffer (1:5000 fortynding; Cell Signaling Technology) i 1 time efter vask tre gange med TBST-buffer. De specifikke bånd blev visualiseret med Immobilon vestlige Chemiluminescent HRP Substrat kit (Millipore) og taget til fange af ChemiImager 5500 imaging system (Alpha Innotech Corp.).

In vivo

effekt assay

In vivo

effekten af ​​strømførende fusionsproteiner blev evalueret i et KYSE150 xenotransplantater nøgen musemodel. 1 × 10

7 KYSE150 celler suspenderet i 200 pi PBS blev inokuleret s.c. i højre armhule af nøgne mus. Efter 3 uger blev tumorer udtaget fra nøgne mus og dissekeret aseptisk i sterilt saltvand. Stykker af tumorvæv (2 mm

3 i størrelse) blev derefter transplanteret ind i højre armhule af nøgne mus ved en trokar, og såret blev forseglet af collodium. Tumorbærende mus blev tilfældigt inddelt i 3 grupper (n = 7), når tumorstørrelsen var over 100 mm

3 (omkring 10 dage senere). Lidamycin (0,05 mg /kg) og bispecifikke fusionsprotein Ec-LDP-HR-AE (0,3 mg /kg) blev injiceret i.v. i halevenen og givet i et 200 pi volumen af ​​PBS på dag 11 og dag 21, hhv. Kontrolgruppe af mus modtog 200 pi PBS behandling på samme tid som fusionsproteiner. Tumor størrelse blev målt hver 3 dag og tumor volumen blev bestemt ved længde × bredde

2/2. De hæmning satser blev beregnet ved en -. Tumor volumen (behandlet) /tumor volumen (kontrol) × 100%

Statistisk analyse

Resultater af kvantitative data i denne undersøgelse blev præsenteret som den gennemsnitlige ± SD. Forskelle mellem grupper blev statistisk analyseret med uparrede to-halet t-test, og P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Udarbejdelse af strømførende fusionsproteiner

Ifølge vores tidligere tilgang, blev gener, der koder for fusionsproteiner Ec-LDP-HR, Ec-LDP, og LDP-HR konstrueret og de kodede proteiner blev udtrykt i det periplasmiske rum af

E.coli

. Fusionsproteiner blev oprenset ved Ni

2+ affinitetskromatografi og renheden af ​​fusionsproteiner var over 90% som bestemt ved SDS-PAGE og højtydende-væske-chromatografi (HPLC). Den aktive enediyn kromofor (AE) i LDM og tre fusionsproteiner blev rekonstitueret

in vitro

at generere de strømførende fusionsproteiner Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE og LDP-Hr-AE. Resultaterne fra omvendt fase-HPLC viste, at tre strømførende fusionsproteiner blev samlet med succes.

Bindende affinitet Ec-LDP-Hr protein til kræft i spiserøret celler

EC9706 celler, KYSE150 celler og NIH 3T3 celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af FITC-mærket Ec-LDP-HR, og fluorescensintensiteterne blev målt ved flowcytometer. De gennemsnitlige fluorescensintensiteter (MFI’er) i EC9706 celler og KYSE150 celler både signifikant forøget (P 0,05), som angivet Ec-LDP-Hr havde stærk binding aktivitet til kræft i spiserøret celler (Fig 1A, 1C). Men MFI’erne om NIH 3T3-celler ikke viser signifikant stigning, hvilket betød Ec-LDP-Hr ikke var i stand til at binde til EGFR og HER2 negative NIH 3T3-celler (Fig 1E). Ifølge MFI’er og EF-LDP-HR-koncentrationer, bindingsaffiniteten (K

d) værdier blev beregnet med Prism 5-softwaren. K

d værdier for Ec-LDP-Hr bundet til EC9706 og KYSE150 celler var 5,283 mmol /l og 3,562 mmol /l, henholdsvis (fig. 1B, 1D).

EC9706 celler (A) , KYSE150 celler (C) eller NIH 3T3 celler (E) blev inkuberet med FITC-mærket Ec-LDP-HR protein ved angivne koncentrationer, og middelværdien fluorescensintensiteter de (MFI’er) blev analyseret ved flowcytometer. Forhøjede koncentrationer af FITC-mærkede Ec-LDP-HR proteiner blev inkuberet med EC9706 celler (B) eller KYSE150 celler (D). Efter FACS blev MFIer plottet versus proteinkoncentrationer.

cytotoksicitet strømførende fusionsproteiner

in vitro

cytotoksicitet af bispecifikke aktiveret fusionsprotein Ec-LDP- HR-AE blev udført på fire humane esophageal pladecellecarcinom (ESCC) cellelinier, som udtrykker forskellige niveauer af EGFR og HER2 og EGFR /HER2 negative NIH 3T3 celler ved anvendelse af MTT-assays (fig. 2A). LDM og monospecifikke energiforsynes fusionsproteiner Ec-LDP-AE og LDP-HR-AE blev også testet til sammenligning. Som vist i fig. 2B, det bispecifikke strømførende fusionsproteinet Ec-LDP-HR-AE dræbte både ESCC-celler og NIH 3T3-celler med meget høj styrke. IC

50 værdier af Ec-LDP-Hr-AE for 4 ESCC celler lå under 10

-10 mol /L-niveau (Fig. 2C). Men det bispecifikke Ec-LDP-HR-AE-proteinet var ikke altid mere potent end de monospecifikke modparter og LDM. Resultater fra statistisk analyse viste, at forskellene i IC

50 værdier af LDM, Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE og LDP-Hr-AE for EF-1, ECa109 og EC9706 celler ikke var statistisk signifikante . Men forskellene i IC

50 værdier for KYSE150 celler var signifikant (P 0,05). Desuden IC

50 værdien af ​​Ec-LDP-Hr-AE for NIH 3T3-celler viste ikke signifikante forskelle i forhold til de fire ESCC celler.

(A) Ekspression af EGFR og HER2 på forskellige esophageal cancerceller og NIH 3T3-celler analyseredes ved Western blot. (B) Den celledræbende virkninger af Ec-LDP-Hr-AE på esophageal cancer cellelinjer KYSE150, EC9706, ECa109 og EF-1 og mus fibroblast cellelinje NIH 3T3 blev testet ved MTT-assays. Celler blev eksponeret for forskellige koncentrationer af Ec-LDP-HR-AE i 48 timer, og resultaterne blev opnået fra tre uafhængige forsøg. (C) IC

50 værdier af lidamycin (LDM), Ec-LDP-Hr-AE, Ec-LDP-AE, og LDP-Hr-AE mod 4 slags esophageal kræftceller og NIH 3T3-celler blev målt ved MTT-assayet. Kolonner, gennemsnit af tredobbeltforsøg, barer, SD.

Virkninger af bispecifikt fusionsprotein Ec-LDP-Hr-AE på cellecyklusfordeling

EC9706 og KYSE150 celler blev udsat for 0,1 , 0,5 og 1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE i 48 h, og fordelingen cellecyklus blev evalueret ved PI farvning og flowcytometri analyse. Kontrol celler (EC9706 og KYSE150) fordelt i G2-M-fasen var 10,51% ± 0,98% og 6,26% ± 1,96%, mens celler behandlet med 0,1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE distribueres i G2-M fase blev 86.00% ± 0,98% og 89,36% ± 0,71% hhv. Disse data viste, at en betydelig G2-M anholdelse skyldtes Ec-LDP-Hr-AE behandling (fig. 3). Selv om der var en stor forskydning (ca. 12,84% ~31.53% stigninger) i G2-M fase efter udsættelse for 0,5 nmol /l og 1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE, cellerne fordelt i G2-M fase var mindre end behandlet med 0,1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE, som indikeret fase celler de G2-M nået toppen med 0,1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE behandling (fig. 3).

EC9706 celler eller KYSE150 celler blev udsat for Ec-LDP-Hr-AE i 48 timer ved de angivne koncentrationer og cellecyklusfordeling blev bestemt ved flowcytometri efter PI farvning. Kolonner, gennemsnit af tredobbeltforsøg, barer, SD.

Virkninger af bispecifikt fusionsprotein Ec-LDP-Hr-AE på apoptose

Resultaterne fra Hoechst 33342 farvning og Annexin V- FITC /PI farvning analyser afslørede, at apoptotiske celler (EC9706 og KYSE150) steg markant i en dosis-afhængig måde efter behandling med Ec-LDP-Hr-AE. Hoechst 33342-farvning blev anvendt til at detektere ændringerne i cellekernemorfologi. Kernerne i ubehandlede celler var normale i udseende og udviste diffunderet farvning af kromatin. Efter eksponering for forskellige koncentrationer af Ec-LDP-Hr-AE i 48 h, KYSE150 celler præsenteres typiske morfologiske ændringer af apoptose såsom chromatinkondensation eller en indskrumpet kerne (fig. 4A). Som vist i fig. 4B, forholdene mellem apoptotiske EC9706 celler efter behandling med 0,1, 0,5 og 1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE var 15,06% ± 0,29%, 38,10% ± 0,64% og 50,00% ± 0,39% henholdsvis, som viste signifikant stiger sammenlignet med kontrol-celler (P 0,01). De apoptotiske celler steg også en masse for KYSE150 celler efter udsættelse for 0,1, 0,5 og 1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE, med apoptose forhold på 16,29% ± 0,35%, 21,54% ± 0,51% og 32,99% ± 0,38% henholdsvis (P 0,01 versus kontrol, fig 4C.). Desuden Ec-LDP-Hr-AE-induceret apoptose i EGFR /HER2 negativ NIH 3T3-celler, og forholdene mellem apoptotiske celler efter behandling med 0,1, 0,5 og 1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE var 16,47% ± 0,44%, 15,28% ± 0,45% og 19,90% ± 0,12% hhv. De apoptotiske NIH 3T3-celler var signifikant mindre end for EC9706 celler og KYSE150 celler i de anvendte doser eksponering på 0,5 nmol /l og 1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE (P . 0,05, figur 4D).

(a) KYSE150 celler blev behandlet ved Ec-LDP-HR-AE ved angivne koncentrationer i 48 timer og derefter farvet ved Hoechst 33342. billederne blev observeret under et fluorescensmikroskop ved × 200. EC9706 celler (B), KYSE150 celler (C) eller NIH 3T3-celler (D) blev udsat for de angivne koncentrationer af Ec-LDP-Hr-AE i 48 timer. Celler blev høstet og farvet med en kombination af FITC-Annexin V og PI. De lavere venstre kvadranter (FITC

– /PI

-) angav de levedygtige celler, og det nederste højre kvadranter (FITC

+ /PI

-) angav de tidlige apoptotiske celler. Den øverste højre kvadranter (FITC

+ /PI

+) angivet de sene apoptotiske celler, og det øverste venstre kvadranter (FITC

– /PI

+) angav de døde celler

Virkninger af bispecifikt fusionsprotein Ec-LDP-Hr-AE på EGFR /HER2 signalveje aktivering

for at karakterisere de molekylære mekanismer involveret i cytotoksicitet og apoptose-induktion af Ec-LDP-Hr- AE, vi undersøgte dens virkninger på ekspressionen af ​​apoptose relaterede molekyler og flere vigtige molekyler i EGFR /HER2 signalveje. Som vist i fig. 5, Ec-LDP-HR-AE fremmet caspase-3 og caspase-7 aktiviteter såvel som PARP-spaltning, hvilket viser, at EC-LDP-HR-AE-induceret apoptose kan være forbundet med mitochondriale veje. Desuden behandling med Ec-LDP-Hr-AE blyholdig til betydelig reduceret phosphorylering af EGFR og HER2, mens ekspressionen af ​​inaktiverede EGFR og HER2 ikke blev ændret. Phosphorylering af nedstrøms signalmolekyler af EGFR /HER2-vejen, såsom AKT, ERK, p38MAPK og JNK blev yderligere hæmmet af behandlingen af ​​Ec-LDP-Hr-AE (fig. 5). De densitometridata viste, at det phosphorylerede HER2 og p38MAPK faldt betydeligt med alle angivne koncentrationer af Ec-LDP-Hr-AE behandling (data ikke vist, P 0,05). Phosphoryleret EGFR, AKT og JNK faldt betydeligt med 0,5 nmol /l og 1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE behandling (P 0,05) og phosphoryleret ERK faldt betydeligt med en nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE behandling (data ikke vist, P 0,05). Niveauerne af total AKT, blev ERK, p38MAPK og JNK ikke påvirket af behandlingen af ​​Ec-LDP-Hr-AE, og densitometridata støttede denne konklusion (data ikke vist).

Udtrykket af apoptose relaterede molekyler (f.eks caspase 3, caspase 7 og PARP) og de vigtigste molekyler i EGFR /HER2 signalveje (f.eks phosphoryleret-EGFR, -HER2, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -Akt) blev bestemt ved Western blot analyse. β-actin blev serveret som en belastning kontrol.

In vivo

effekten af ​​strømførende fusionsproteiner

In vivo

antitumor virkninger af energi fusionsproteiner blev vurderet i en KYSE150 xenotransplantater nøgen musemodel. Som vist i figur 6A, LDM undertrykte væksten af ​​KYSE150 xenotransplantater med 61,4% ved den maksimalt tolererede dosis (0,05 mg /kg), og det bispecifikke fusionsproteinet Ec-LDP-HR-AE i en dosis på 0,3 mg /kg inhiberede vækst af KYSE150 xenotransplantater med 88%, som viste statistisk signifikante forskelle (P 0,05) sammenlignet med LDM-behandlede gruppe ved 0,05 mg /kg. Ingen dødsfald dyr blev fundet i de behandlede grupper, og kurverne i legemsvægt viste, at dyrene veltolereret til den indgivne dosis af Ec-LDP-HR-AE (fig. 6B).

nøgne mus (n = 7), der bærer human esophageal carcinoma KYSE150 xenografter blev behandlet med LDM eller Ec-LDP-Hr-AE på dag 11 og dag 21 efter podning med tumoren ved halevenen injektion. De gennemsnitlige tumorvolumener (A) og de gennemsnitlige kropsvægte for mus (B) i hver gruppe er vist. Ec-LDP-HR-AE i en dosis på 0,3 mg /kg hæmmede væksten af ​​KYSE150 xenotransplantater med 88%, som viste statistisk signifikante forskelle sammenlignet med LDM behandlede gruppe ved den maksimale tolererede dosis (0,05 mg /kg) (P 0,05 ).

diskussion

Kirurgi, strålebehandling og kemoterapi er stadig grundpillen i behandling for kræft i spiserøret, men for nylig, er en række målrettede behandlinger, der undersøges med det formål at forbedre respons sats og overlevelse hos patienter med kræft i spiserøret [6], [16], [17]. Som det er kendt, har overekspression af EGFR og HER2 blevet observeret i over 30% af esophageal carcinomer, og deres overekspression er korreleret med reduceret overlevelse, forøget risiko for tilbagefald, fjernmetastaser, og modstand mod strålebehandling [18]. Derfor er effekten af ​​nogle monospecifikke antistoffer og tyrosinkinaseinhibitorer som blokerer EGFR eller HER2-funktion, såsom cetuximab, trastuzumab, gefitinib, og erlotinib på esophageal carcinoma blevet undersøgt, men effektiviteten er beskedne [19] – [22] . Forskellig fra monoklonale antistoffer og tyrosinkinaseinhibitorer, er immuntoksiner anses for at være yderst effektiv på cancerterapi med fordelen ved specificiteten af ​​antistoffer eller ligander og cytotoksiciteten af ​​toksiner [23]. Imidlertid har kliniske data om immuntoksinerne vist inkonsistente resultater. Adskillige immunotoxiner var meget effektiv mod hæmatologiske maligniteter. For eksempel i den fase III forsøg med patienter med kutant T-celle lymfom (CTCL), 30% af de 71 patienter behandlet med denileukin diftitox (DAB

389IL2, Ontak) havde et objektivt respons, herunder 10% komplet remission. Og i et fase I forsøg i 31 patienter med hårcelleleukæmi, BL22 inducerede 19 komplette responser (61%) og 5 partielle responser (19%) [24], [25]. Men for faste tumorer, viste immunotoksiner begrænset antitumorvirkning. Årsagerne til mislykket behandling af solide tumorer omfattede dårlig indtrængning i tumorer og de alvorlige immunreaktioner [26] – [28]. Vallera og medarbejdere har udviklet hidtil ukendte bispecifikke molekyler ved at fusionere to forskellige ligander målrettet til en enkelt toksin med det formål at forbedre specificitet, og resultaterne viste, at bispecifikke molekyler udviste enten forøget antitumoraktivitet eller bredere spektrum af reaktivitet end de monospecifikke molekyler [15 ], [29], [30] – [34]. Fusionsproteinet Ec-LDP-Hr-AE vi konstrueret tidligere er et bispecifikt molekyle, der målrettet både EGFR og HER2. Ec-LDP-Hr-AE anvender to oligopeptider for receptorbinding og efterfølgende intracellulære levering af en enediyn antibiotisk lidamycin for celle drab. I denne undersøgelse blev antitumoraktiviteten af ​​Ec-LDP-Hr-AE på kræft i spiserøret undersøgt, fordi co-overexpresssion af EGFR og HER2 blev observeret i et flertal af esophageal planocellulære karcinomer.

Binding med tilsvarende receptorer er forudsætningen for Ec-LDP-Hr-AE til at udøve sine tumor celle-selektive cytotoksiske virkninger. Derfor blev bindingskapaciteten af ​​Ec-LDP-HR protein til ESCC celler evalueres ved hjælp af et flow-cytometri-baserede immunofluorescens assay. Resultaterne viste, at Ec-LDP-HR-protein var i stand til at binde til ESCC celler med høj affinitet. , Ec-LDP-Hr undladt at vise bindingsaktivitet til EGFR og HER2 negative NIH 3T3-celler. I celle levedygtighed assay, det bispecifikke og enediyn-energi fusionsprotein Ec-LDP-Hr-AE viste ekstremt potente drab virkninger på esophageal kræftceller med IC

50 værdier ved meget lavt niveau ( 10

-10 mol /L). For KYSE150 celler, der udtrykker både EGFR og HER2, Ec-LDP-Hr-AE var den mest cytotoksisk for esophageal kræftceller, når man sammenligner med LDM og to monospecifikke fusionsproteiner (Ec-LDP-AE og LDP-Hr-AE). Forøget aktivitet af bispecifikt fusionsprotein kan forklares ved, at Ec-LDP-HR-AE bundet til både EGFR og HER2, og gjorde det mindre sandsynligt, at dissociere fra celleoverfladen, hvilket øger chancerne for internalisering af dets cytotoksiske del og udøve celle dræbe effekter. Men den bispecifikke Ec-LDP-Hr-AE protein var ikke altid mere potent end de monospecifikke modparter og LDM da resultaterne af statistiske analyser viste, at forskellene i IC

50 værdier af LDM, Ec-LDP-Hr-AE , Ec-LDP-AE og LDP-Hr-AE for EF-1, ECa109 og EC9706 celler var ikke statistisk signifikante. Desuden fandt vi, at cytotoksicitet strømførende fusionsproteiner at ESCC celler ikke var korreleret godt med EGFR og HER2 ekspressionsniveauerne. For eksempel IC

50 værdien af ​​Ec-LDP-Hr-AE for EC9706 celler med lav HER2 udtryk var 5,12 × 10

-12 mol /l, mens IC

50 værdi for KYSE150 celler med høj EGFR og HER2-niveau var 6,10 × 10

-11 mol /l. De tilsvarende resultater blev også observeret mellem styrken af ​​monospecifikke fusionsproteiner og EGFR /HER2-niveauer. Dette fænomen er blevet observeret i andre studier om målrettede lægemidler, såsom lapatinib [35], [36]. Som et resultat, er klart behov for yderligere undersøgelser, der fokuserer på at afsløre de molekylære mekanismer i følsomhed over for Ec-LDP-Hr-AE, og dette kan give nyttige data til udvælgelse af patienter, der vil drage fordel af EGFR /HER2-bispecifikke agenter.

for at belyse de mekanismer bispecifikke Ec-LDP-Hr-AE udstillet cytotoksicitet på esophageal cancerceller, PI farvning, Hoechst farvning, og Annexin V-FITC /PI farvning blev udført for at undersøge cellecyklusstop og apoptose. Resultater fra cellecyklus analyse viste, at Ec-LDP-Hr-AE forårsagede betydelig G2-M anholdelse, hvor G2-M-fase celler nået toppen med 0,1 nmol /l af Ec-LDP-Hr-AE behandling. Dette resultat var potentielt skyldes de apoptotiske og døde celler steg efter behandling med 0,5 nmol /l og 1 nmol /L Ec-LDP-HR-AE. Derfor er G2-M arrest var mindre signifikant end 0,1 nmol /L Ec-LDP-HR-AE behandling. Ec-LDP-HR-AE også apoptose i EC9706 og KYSE150 celler i en dosis-afhængig måde, og apoptose induceret af Ec-LDP-HR-AE kan være forbundet med mitochondriale veje, fordi caspase-3 og caspase-7 aktiviteter samt PARP-spaltning steget betydeligt som vist ved Western blot analyse.