PLoS ONE: Genetisk variation i drosha 3’UTR Reguleret af HSA-miR-27b er forbundet med blærekræft Risk

Abstrakt

Formål

miRNA kan regulere de biologiske processer, herunder differentiering, spredning og apoptose. DICER og drosha er to medlemmer af RNase III familie, spille afgørende roller i vejen for miRNA biogenese. I denne undersøgelse, vi hypotese, at genetiske variationer af de Dicer og drosha gener var forbundet med risiko for blærekræft.

Eksperimentel Design

Vi udførte en case-kontrol undersøgelse af 685 blærekræft sager og 730 kontroller til at undersøge sammenhængen mellem de syv funktionelle SNPs af

DICER

og

drosha

gener og blærekræft risiko. Vi evaluerede derefter funktionaliteten af ​​de vigtige SNPs

Resultater

Vi fandt, at rs10719T . C polymorfi placeret i 3 ‘utranslaterede område (UTR) af

drosha

gen var forbundet med den forøgede risiko for blærekræft. Stratificeret analyse foreslog, at rs10719TC /CC genotype kan øge risikoen for blærekræft blandt mandlige patienter (Justeret OR = 1,34, 95% CI = 1,05-1,70,

P

= 0,018), og nogensinde rygere (1,56, 1.14- 2,14, 0,006) sammenlignet med TT genotype. Endvidere

drosha

rs10719T C polymorfisme var forudsagt til at regulere bindingsaktiviteten af ​​HSA-MIR-27a /b. Luciferase rapporterede gen assay bekræftede, at rs10719 T til G substitution forstyrret bindingssted for HSA-miR-27b, resulterer den øgede niveauer af drosha protein.

Konklusioner

Tilsammen disse resultater antydede, at

drosha

rs10719T . C polymorfi kan være forbundet med risiko blærekræft i en kinesisk befolkning, og HSA-miR-27b kan påvirke ekspressionen af ​​drosha protein ved at binde med 3’UTR

Henvisning : Yuan L, Chu H, Wang M, Gu X, Shi D, Ma L, et al. (2013) Genetisk variation i

drosha

3’UTR Reguleret af HSA-miR-27b er forbundet med blærekræft Risk. PLoS ONE 8 (11): e81524. doi: 10,1371 /journal.pone.0081524

Redaktør: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, USA

Modtaget: Juni 3, 2013; Accepteret: 14 okt 2013; Udgivet: November 28, 2013 |

Copyright: © 2013 Yuan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af National Natural Science Foundation of China (81230068, 30901166, 81202268 og 81102089), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BK2011773 og BK2011775), Key Program for Basic Research i Jiangsu Provincial Department of Education (11KJB330002, og 12KJA330002) Jiangsu Provincial Six Talent Peaks Project (2012-SWYY-028), Specialized forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse (20123234110001), Jiangsu Provincial Kandidater Innovative Project (CXZZ12_0594), Qing-Lan Projekt i Jiangsu Provincial Department of Education, og Priority Academic Program Udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner (Folkesundhed og forebyggende medicin). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

blærekræft udgør ca. 2% af alle menneskelige maligniteter med en anslået 72,570 nye tilfælde og 15,210 dødsfald i USA i 2013 alene [1]. I Kina, den samlede registrerede blærekræft forekomsten var 7,49 /100.000 i 2008, og forekomsten af ​​blærekræft var stigende i løbet af 1998-2008 (gennemsnitlig vækstrate per år, 4,60%) [2]. Mere end 90% af blærekræft er overgangs- cellecarcinom. Forekomsten af ​​blærecancer er generelt høj i USA og Europa, men lav i Asien. Ligesom andre almindelige kræftformer, blærecancer er en kompleks sygdom forårsaget af både genetiske og miljømæssige risikofaktorer. Cigaretter rygning, erhvervsmæssige og miljømæssige engagementer veletablerede kendte risikofaktorer for blærekræft [3]. Det er blevet rapporteret, at FGFR3 mutation var forbundet med den lave blære tumorklassificering og scene, og mutationer af TP53 og FGFR3 viste et omvendt forhold [4-6]. Senest er flere genom-dækkende forbindelsesundersøgelser (GWAS) med replikationer påpeget, at de almindelige genetiske variationer er forbundet med modtagelighed for blærecancer [7-11]. Tang et al. også identificeret, at en ualmindelig kodning variant af

UGT1A

locus (GWAS relateret) kan påvirke

UGT1A

mRNA ekspression og mindske risikoen for blærekræft [12], men de nøjagtige mekanismer i blæren kræft ikke præciseres.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små ikke-kodende RNA-molekyler af ~ 22 nukleotider, som regulerer genekspression ved post-transkriptionel niveau gennem binding den 3 ‘utranslaterede region (UTR ) af målgener mRNA [13]. miRNA genereres i en to-trinvis processeringsvej medieret af to store enzymer (dicer og drosha): i kernen, er længere forstadier forarbejdes til primære RNA’er (PRI-miRNA) ved RNase II og derefter PRI-miRNA er behandlet af den RNase enzym (drosha) ind forstadier (pre-miRNA) med en hårnåle-struktur [14,15]. De præ-miRNA eksporteres fra kernen til cytoplasmaet ved exportin-5 protein. I cytoplasmaet, er pre-miRNA forarbejdet til modne miRNA ved en anden RNase enzym (DICER). De modne miRNA spille roller ved inkorporering i RNA-inducerede silencing kompleks (RISC) [16]. Det er blevet foreslået, at miRNA forudsiges at regulere 30% af humane gener [17]. For nylig viste flere studier, at miRNA kunne fungere som onkogener og tumor undertrykkere ved at målrette 3’UTR vigtige gener [18,19] og de genetiske varianter i 3’UTR af miRNA målgener ville påvirke miRNA-medieret genregulering, i sidste ende resulterer den øgede risiko for kræft [19,20]. Det er værd at bemærke, at DICER og drosha spille den afgørende rolle i carcinogenese. Akkumulerede beviser har vist, at ubalance

DICER

drosha

ekspressionsniveauerne er forbundet med blærekræft risiko [21-23]. For nylig, Han og hans kolleger fandt også, at

DICER

drosha

udtryk niveauer blev opreguleret i blærekræft væv sammenlignet med den matchede normale blære væv, og tavshed DICER eller drosha kan hæmme celle proliferation og inducere celle apoptose [24]. Her foreslår vi, at det er berettiget at undersøge roller

DICER

og

drosha

i modtagelighed for blærekræft.

Indtil nu har flere undersøgelser undersøgt sammenhængen mellem de genetiske varianter af

DICER

og

drosha

gener og risikoen for sygdomme. Lin et al. rapporterede, at

DICER

drosha

haplotyper var forbundet med den ændrede overlevelse og gentagelse af renalcellecarcinom patient hos kaukasiere [25]. Men den genetiske varianter af

DICER

drosha

ikke var forbundet med udviklingen af ​​renalcellecarcinom [26]. Desuden Yang et al. også observeret lignende resultat af blærecancer i kaukasere [27]. For nylig, Qin et al. viste, at

DICER

drosha

polymorfier kan ændre risikoen for unormale sædparametre og være forbundet med den kinesiske mandlig infertilitet [28]. Tilsammen har vi en hypotese, at de genetiske varianter af

DICER

drosha

også være forbundet med modtagelighed for blærekræft i en kinesiske befolkning.

På baggrund af dette postulat, valgte vi syv polymorfier af

DICER

(rs12323635CT, rs13078TA, rs1057035TC, og rs3742330AG) og

drosha

(rs2291109AT, rs10719TC, og rs642321CT) til at vurdere sammenhængen mellem de genetiske varianter af

DICER

og

drosha

gener og risiko for blærekræft. I denne undersøgelse fandt vi, at

drosha

3’UTR polymorfi rs10719TC kan øge risikoen for blærekræft i en kinesisk befolkning, som var placeret i nærheden af ​​en miRNA bindingssted. Derudover har vi gennemført en række funktionelle assays på

drosha

3’UTR polymorfier til at afsløre sin molekylære mekanisme. Salg

Materialer og metoder

Undersøgelse emner

I den foreliggende undersøgelse, vi indgår 685 histopatologisk bekræftet blære overgangsordning celle karcinom og 730 kræft-fri kontrol. Inkluderet undersøgelsespersoner blev rekrutteret fra First Affiliated Hospital og Huai-An Tilknyttede Hospital i Nanjing Medical University, og Jiangsu-provinsen Hospital i traditionel kinesisk medicin (TCM) mellem januar 2003 til januar 2010. Den detaljerede metode til at rekruttere forsøgspersoner til undersøgelsen havde tidligere blevet beskrevet [29]. Patologisk diagnose for blære tumor etape var ifølge 2002 International Union Against Cancer tumor-knuder-metastaser klassificering og sortering af urothelial papilloma World Health Organization 1973 blev anvendt til at definere blærekræft klasse: godt differentieret (grad 1, G1), moderat differentierede (grad 2, G2) eller dårligt differentierede (grad 3, G3). Blære kræftpatienter blev ekskluderet, hvis der havde tidligere kræft, spredt kræft fra anden oprindelse, tidligere strålebehandling eller kemoterapi. De kræft-fri forsøgspersoner blev rekrutteret fra dem, der søgte lægehjælp i ambulante afdelinger på sygehuset. De kræft-fri kontroller blev modsvaret af alder (± 5 år) og køn til de tilfælde, som var genetisk relateret til de tilfælde og ikke havde nogen individuel historie af kræft, herunder melanom hudkræft. De kræft-fri patienter, som havde symptomer på blærekræft, såsom hæmaturi, blev udelukket. Vi brugte et kort spørgeskema for at opnå den demografiske og risikofaktoren oplysninger fra de inkluderede emner. I denne undersøgelse, vi definerede nogensinde rygere (tidligere og nuværende rygere) baseret på rygning tilstand. Emner, der røg dagligt i 1 år blev defineret som nogensinde rygere. Nogensinde rygere, der havde rygestop for 1 år blev defineret som tidligere rygere og de andre som rygere. Dette case-control studie blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelse Nanjing Medical University. Alle individer underskrev informerede samtykker, og hvert emne doneret 5 ml blodprøve for genomisk DNA-ekstraktion.

SNPs vælge og genotyping

I denne undersøgelse har vi studeret de genetiske varianter af

DICER

og

drosha

gener, som spiller vigtige roller i miRNA biogenese. Her har vi fokuseret på at studere de enkelte nukleotid polymorfier (SNP) spænder disse to gener (HapMap nøgletal 27), herunder 2 kb opstrøms og 2 kb nedstrøms ved hjælp af Haploview software [30]. Følgende kriterier bør medtages: (i) SNPs skal placeres i den 5′-flankerende region, 5′-UTR, 3’UTR, og kodende region med aminosyreændringer, (ii) mindre allel frekvens (MAF) 5% i han-kinesere i Beijing (CHB). Ifølge de kriterier, blev fire SNP’er identificeret i

DICER

(rs12323635, rs13078, rs1057035, og rs3742330) og tre SNPs i

drosha

(rs2291109, rs10719, og rs642321).

Genomisk DNA blev ekstraheret fra perifere blodlymfocytter af emnet. De inkluderede syv SNP’er blev genotypebestemt i alle 1415 individer under anvendelse MGB TaqMan proben assay (7900HT Real Time PCR System, Applied Biosystems, Foster City, USA). Omkring 10% af prøverne blev udvalgt tilfældigt til gentagen genotypning til validering, og resultaterne var 100% overensstemmende. Genotype analyse blev udført af to personer uafhængigt i et blindet måde og kontroller blev inkluderet i hver plade for at sikre nøjagtigheden af ​​genotypebestemmelse. Men flere prøver mislykkedes i genotypning skyldtes DNA kvalitet, og vi ville udelukke dem i de videre analyser. Tabel 1 forudsat de primære oplysninger om de udvalgte syv SNPs.

Gene (tiltrædelsen nr.) Og locus

NCBI rs nr.

Position

en

Beliggenhed

Base forandring

MAF

P

for HWE

c

Genotypning rate (%) Vejviser

HapMap

b

Case

Controls

DICER

(NM_030621) 14q31rs1232363595625711promoterC T0.3330.3760.3780.06798.2rs13078955567473’UTRT A0.0560.0570.0610.13199.1rs1057035955541423’UTRT C0.1110.1120.1100.741100.0rs3742330955533623’UTRA G0.2670.3310.3320.25799.6

DROSHA

(NM_013235) 5p14-p13rs229110931532301promoterA T0.2110.2190.2340.062100.0rs10719314014473’UTRT C0.2330.2820.2430.43799.7rs642321314010033’UTRC T0.4670.4740.5050.655100.0Table 1. Primær information af genotypede SNP’er.

ASNP position i NCBI dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).bMAF fra HapMap databaser (https://www.hapmap.org) .cHWE

P Drømmeholdet værdi i kontrolgruppen. CSV Hent CSV

Bioinformatik analyse af

drosha

3’UTR

Baseret på bioinformatik analyse, vi forudsagde, at HSA-miR-27a /b kan binde med 3’UTR-regionen i

drosha

ved at bruge fire fælles hjemmesider (Target Scan: https://www.targetscan.org/~~number=plural, Miranda: https://www.microrna.org/~~number=plural, Mikrokosmos: https://www.ebi.ac .uk /Enright-SRV /mikrokosmos /cgi-bin /mål /v5 /genome.pl, og PITA: https://genie.weizmann.ac.il/~~number=plural) (figur 1A). Vi mente, at kombinationen af ​​disse metoder i høj grad ville reducere muligheden for falsk positive.

(A) drosha 3’UTR blev forudsagt et bindingssted for HSA-miR-27a /b. Sekvensen af ​​HSA-MIR-27a og HSA-MIR-27b havde kun én base forskel (understreget). Scanning ca. ± 100bp regioner i bindingsstedet, vi kun fundet at rs10719T C blev placeret i denne region. Forudsige effekten af ​​allel variation på rs10719 på HSA-MIR-27a /b anerkendelse og konstruktionen af ​​pGL3-drosha 3’UTR-T /C indeholdende renilla luciferase genet og fuldlængde-3’UTR af drosha genet med forskellige alleler af rs10719 ( pil: T C substitution). (B, C) Luciferase reporter assays til måling rs10719T eller C allel forskel med tilstedeværelsen eller interferens af HSA-MIR-27a /b. I (B), T24-celler podet på plader med 24 brønde blev forbigående co-transficeret med konstruktioner og HSA-MIR-27a /b efterligner eller stabil negativ kontrol (NC). I (C), J82-celler podet på plader med 24 brønde blev forbigående co-transficeret med konstruktioner og HSA-MIR-27a /b inhibitorer eller inhibitor NC. Resultaterne er vist som relativ luciferaseaktivitet versus NC. Data var fra tre uafhængige transfektionsforsøg.

**,

P

0,05.

Real-time kvantitativ revers transkription-PCR (RT-PCR) assay

For at vurdere den endogene ekspressionsniveau af HSA-MIR-27a /b, fire blære cancercellelinier (EJ, T24, J82, og 5637) podet i 20 cm

2 plader blev underkastet ekstraktion af det totale RNA isoleret fra celler ved anvendelse af Trizol Reagent (Invitrogen, CA, USA). Tabel S1 i File viste S1 de primere information HSA-miR-27a /b og U6. Revers transkriptase reaktioner (10 pi) indeholdt 2 pi total RNA (500 ng /pl), 1 pi 10 × AMV RT-puffer, 10 pmol hver af dNTP’er (Toyobo, Tsuruga, Japan), 0,75 pi antisense løkker primerblanding, 0,25 U /pl RNase Inhibitor (Toyobo, Tsuruga, Japan), 1U /pl AMV revers transkriptase. Blandingen blev inkuberet ved 16 ° C i 15 min, 42 ° C i 60 min, og 85 ° C i 5 minutter. Dernæst blev Applied Biosystems 7900HT Real Time PCR systemet anvendes til at udføre real-time kvantificering PCR (ABI, CA, USA) baseret på SYBR-Green metode (Toyobo, Tsuruga, Japan). Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer. Fold ændringer var normaliseret til ekspressionsniveauerne af U6

Til påvisning af sammenhængen mellem de

drosha

mRNA-niveauer og rs10719 T . C polymorfi

in vivo

, i alt af 61 blære tumorvæv med forskellige genotyper (32 for TT, 24 for TC, og 5 for CC genotyper) blev underkastet ekstraktion af det totale RNA ved anvendelse af Trizol Reagent (Invitrogen, CA, USA). Blære tumorvæv blev bevaret i flydende nitrogen efter at være blevet fjernet fra kroppen. Den totale RNA blev bedømt ved både revers transkriptase reaktion og real-time kvantitativ PCR baseret på SYBR-Green metode (Toyobo, Tsuruga, Japan). CDNA’et blev anvendt til amplifikation af

drosha

gen og et endogent kontrol gen

GAPDH

. De primere information af

drosha

GAPDH

gener blev inkluderet i Tabel 1. Fold ændringer blev normaliseret ved ekspressionsniveauerne af

GAPDH

og hver analyse blev udført tre gange .

drosha

3’UTR indeholder rs10719TC reporter genkonstruktioner og luciferasereporteren analyser

for at konstruere luciferase reporter plasmider af

drosha

3’UTR,

drosha

3’UTR fragmenter (937bp) bærer den største rs10719T allelen blev opformeret ved PCR. Primerne var 5′-ACCTTGGTACCCCAGATGAGACTGAAGACATC-3 ‘(fremad) og 5′-ACCTTCTCGAGGCACTCACTATATATTTGCTG-3′ (revers). PCR-produkterne blev ekstraheret og separeret ved agarosegel, som blev klonet med TA-kloning (Invitrogen, CA, USA). Desuden blev fragmentet indeholdende mindre rs10719C allel udført under anvendelse af følgende primere: 5’-TAGTTTTCCTGCAGACAATGAACGAAGTGTGC-3 ‘(fremad) og 5′-TTTATTTCAATGAGCACACTTCGTTCATTGTC-3’ (revers). Endelig blev det amplificerede fragment, der bærer T eller C-allel indsat nedstrøms for luciferasegenet i en pGL3-promotor-plasmid og derefter plasmidet indeholdende T eller C-allel blev udført, som blev bekræftet ved sekventering.

I luciferase reporter assay blev T24 og J82 celler placeret i 24-brønds plader (1 × 10

5 celler per brønd) og derefter cotransficeret med pGL3-

drosha

3’UTR-T eller pGL3-

drosha

3’UTR-C og pRL-SV40 (50: 1). De efterligner og inhibitorer af HSA-MIR-27a /b og deres negative kontroller (GenePharma, Shanghai, Kina) blev cotransficeret med reporterplasmider ved en slutkoncentration på 20nmol /pl. Otteogfyrre timer efter transfektion i T24 og J82-celler, blev luciferaseaktivitet i lysater målt med et Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, WI, USA) og normaliseret mod aktiviteten af ​​pRL-SV40. Assays blev efterfulgt af producentens forslag. Uafhængige tredobbeltforsøg blev udført for hver plasmid konstruktion.

Statistisk analyse

Hardy-Weinberg ligevægt af genotypen fordeling blandt kontrollerne blev anvendt ved hjælp af en goodness-of -fit χ

2 test. Hyppigheden fordelinger af udvalgte demografiske variable mellem de tilfælde og kontroller blev testet ved hjælp af χ

2 test. Genotype-specifikke odds ratio (OR) og deres 95% konfidensintervaller (CIS) blev beregnet ved ubetinget univariate og multivariate logistiske regressionsanalyser. Den multivariate justering omfattede alder, køn og rygning status (aldrig og nogensinde ryge). Desuden blev Kruskal-Wallis envejs ANOVA test, der anvendes til at analysere resultaterne af

drosha

mRNA-ekspression

in vivo

. I denne undersøgelse blev den relative luciferase reportergenekspression for T eller C-allel beregnet separat. Studerendes

t

test blev anvendt til at evaluere forskellene i ekspressionsniveauerne af luciferasereportergenet blandt undergrupper. Alle tests var to-sidet ved hjælp af SAS-software (version 9.1, SAS Institute, Inc, Cary, NC, USA) og

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Association undersøgelse mellem polymorfier af

DICER

drosha

og blære kræftrisiko

de karakteristika for de 685 blære overgangsordning celle karcinom patienter og 730 kontroller er sammenfattet i tabel 2. Heri vi ikke observere statistisk forskel i fordelingen af ​​alder (

P

= 0,144) og køn (

P

= 0,825) mellem patienter og kontroller. Men der var mere nogensinde rygere (55,6%) blandt de patienter, mere end blandt kontrollerne (38,4%), og denne forskel var statistisk signifikant (

P

0,001). Disse variabler blev justeret for efterfølgende multivariat logistisk regressionsanalyse. Af de 685 tilfælde, der var 315 tumorklassificering 1 (46,0%), 261 tumor grad 2 (38,1%) og 109 tumorklassificering 3 (15,9%) patienter. Desuden 435 (63,5%) havde overfladiske tumorer og resterende 250 (36,5%) havde invasive tumorer.

Variable

Cases (n = 685)

Controls (n = 730)

P

en

N

%

N

%

Age ≤ 6532948.037951.90.144 6535652.035148.1Sex Male55480.958780.40.825 Female13119.114319.6Smoking status Never30444.445061.6 0,001 Ever38155.628038.4 Former17225.1729.9 Current20930.520828.5Tumor kvalitet G131546.0 G226138.1 G310915.9Tumor etape Overfladiske (pT

a-pT

1) 43563,5 Invasive (pT

2-pT

4 ) 25036.5Table 2. frekvens fordelinger af udvalgte variabler mellem tilfælde blærekræft og kræft-fri kontroller.

aTwo-sidet χ

2-test for frekvensfordelingen af ​​udvalgte variabler mellem blære kræfttilfælde og kræft-fri kontrol CSV Hent CSV

de syv SNP’er genotypefrekvenser blandt kontrollen var efter aftale med Hardy-Weinberg ligevægte (

P

0,05; tabel 1). Som vist i tabel 3, bemærkede vi, at forsøgspersoner med

drosha

3’UTR rs10719C allel (TC og CC genotyper) havde en 1,24 gange øget risiko for blærekræft (Justeret OR = 1,25, 95% CI = 1,01-1,55,

P

= 0,041) i forhold til rs10719TT genotype. I mellemtiden, bemærkede vi, at fordelingen af ​​rs10719TC genotyper mellem cases og kontroller viste signifikant forskel (

P

= 0,017). Men vi ikke observere nogen signifikante forskelle i genotype fordelingen af ​​

DICER

rs12323635CT, rs13078TA, rs1057035TC, rs3742330AG og

drosha

rs2291109AT, rs642321CT polymorfier mellem cases og kontroller (alle

P

0,05, tabel 3). Vi yderligere evaluerede effekten af ​​omfattede syv polymorfier på risiko blærekræft ved stratificering efter køn og rygning status. Som vist i tabel S2 i File S1, fandt vi, at rs10719TC polymorfi kan øge risikoen for blærekræft blandt mandlige patienter (Justeret OR = 1,34, 95% CI = 1,05-1,70,

P

= 0,018), og stadigt rygere (justeret OR = 1,56, 95% CI = 1,14-2,14,

P

= 0,006).

genotyper

Cases

Controls

Rå OR (95% CI )

Justeret OR (95% CI)

a

P

a

P

b

N

%

N

%

DICER

rs12323635CT680710CC26639.128640.31.00 (Reference) 1,00 (reference) 0.887CT32147.231143.81.11 (0.88-1.40) 1,09 (0.86-1.37) 0.485TT9313.711315.90.89 (0.64-1.22) 0,88 (0.63-1.22) 0.441CT /TT41460.942459.71.05 ( 0.85-1.20) 1,03 (0.83-1.28) 0.793rs13078TA679723TT60388.864088.31.00 (reference) 1,00 (reference) 0.640AT7511.17810.81.02 (0.73-1.43) 0,99 (0.70-1.39) 0.937AA10.250.70.21 (0,03-1,82 ) 0,30 (0,03-2,57) 0.271AT /AA7611.28311.50.97 (0.70-1.35) 0,95 (0.68-1.33) 0.768rs1057035TC685730TT54880.057779.01.00 (reference) 1,00 (reference) 0.857TC12017.514519.90.87 (0,67-1,14) 0,88 (0,67-1,16) 0.371CC172.581.102.34 (0.96-5.23) 2,36 (1.00-5.59) 0.051TC /CC13720.015321.00.94 (0.73-1.22) 0,96 (0.74-1.25) 0.753rs3742330AG683727AA30244.233145.51.00 (henvisning ) 1,00 (reference) 0.942AG31045.430942.51.10 (0.88-1.37) 1,09 (0.87-1.37) 0.437GG7110.48712.00.90 (0.63-1.27) 0,88 (0.61-1.25) 0.464AG /GG38155.839654.51.06 (0.86- 1,30) 1,05 (0.84-1.30) 0,686

drosha

rs2291109AT685730AA42161.541957.41.00 (reference) 1,00 (reference) 0.332AT22833.328038.40.81 (0.65-1.01) 0,79 (0.63-0.99) 0.044TT365.3314.31. 16 (0.70-1.90) 1,20 (0.72-2.00) 0.482AT /TT26438.531142.60.85 (0.68-1.05) 0,83 (0.67-1.03) 0.098rs10719TC684727TT35251.541356.81.00 (reference) 1,00 (reference) 0.017TC27840.627537.81.19 (0.95-1.48) 1,20 (0.96-1.50) 0.116CC547.9395.41.63 (1.05-2.51) 1,61 (1.03-2.50) 0.036TC /CC33248.531443.21.24 (1.01-1.53) 1,25 (1.01-1.55) 0.041rs642321CT685730CC19728. 817624.11.00 (reference) 1,00 (reference) 0.107CT32647.637150.80.79 (0.61-1.01) 0,79 (0.61-1.02) 0.075TT16223.718325.10.79 (0.59-1.06) 0,78 (0.58-1.06) 0.112CT /TT48871.255475.90 0,79 (0,62-1,00) 0,79 (0.62-1.01) 0.056Table 3. genotypefrekvenser af

DICER

og

drosha

SNPs blandt blære kræfttilfælde og kontroller og deres forbindelse med risiko blærekræft .

aAdjusted for alder, køn og rygning status (aldrig og nogensinde) i logistisk regression model.bTwo-sidet chi-square test for fordeling af allel frekvens (mindre allel versus større allel). CSV Hent CSV

drosha

3’UTR rs10719TC påvirker

drosha

udtryk ved at regulere HSA-miR-27b bindende

For at undersøge mulig mekanisme for

drosha

3’UTR i risiko for blærekræft, vi udførte de funktionelle assays. Baseret på bioinformatik analyse blev

drosha

3’UTR forudsagt et bindingssted for HSA-miR-27a /b (figur 1A). Her har vi vist, at rs10719TC lå 46bp nedstrøms for HSA-miR-27a /b bindingssted i

drosha

3’UTR.

Som vist i figur S1 i File S1, fast -tid kvantitativ RT-PCR analyse foreslog, at endogene ekspressionsniveauer af HSA-miR-27a /b i J82-cellelinje var mere markant højere end andre celler (T24, EJ, og 5637) (

P

0,001 ). Her valgte vi J82 og T24-cellelinier i yderligere luciferase assay. Derefter brugte vi de plasmider til transient co-transfektion med T24 celler [stabil negativ kontrol (NC) miRNA: stabil NC eller HSA-miR-27a /b efterligner] og J82-celler (inhibitor NC eller HSA-miR-27a /b inhibitor). Som vist i figur 1B (T24 celle), HSA-MIR-27a /b undertrykt luciferaseekspression i nærvær af rs10719T allel, sammenligning med NC (

P

0,05), men ikke den rs10719C allel (

P

0,05). Desuden har vi også fundet at inhiberingen af ​​HSA-MIR-27a /b-ekspression kan øge luciferaseekspression effektivt til rs10719T-indeholdende plasmid i stedet for rs10719C-indeholdende plasmid i J82-celler (

P

0,05; Figur 1C). Vi fandt imidlertid også, at en signifikant nedgang i luciferaseekspression, når vi tilføjet HSA-MIR-27a-inhibitor til allel C i J82-celler. Det tilsvarende resultat ikke observeres i at tilføje HSA-miR-27b hæmmer til allel C i J82 celler. Måske, har HSA-miR-27a ikke direkte påvirke drosha luciferaseekspression. Vores data foreslog, at rs10719 T til C-substitution fungerer som et tab af funktion mutation og ville påvirke drosha luciferaseekspression af HSA-miR-27b mål.

I den foreliggende undersøgelse, vi også udført RT-PCR-analyse at undersøge, om HSA-miR-27b påvirkes drosha udtryk ved at nedbryde mRNA eller undertrykke mRNA posttranslationel oversættelse (Figur S1 i File S1). I alt 61 blære tumorvæv med forskellige genotyper af

drosha

rs10719TC polymorfi blev anvendt til at vurdere ekspression af

drosha

mRNA. Ingen signifikant forskel niveauer af

drosha

mRNA blandt personer med TT, TC og CC genotyper blev observeret (

P

0,05). Tilsammen kan HSA-miR-27b påvirke drosha udtryk ved at regulere protein oversættelse.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi sammenhængen mellem syv polymorfier af

DICER

og

drosha

gener og blærekræft risiko i en kinesisk befolkning, og identificeret, at rs10719TC polymorfi ved siden af ​​HSA-miR-27b bindingssted i

drosha

3’UTR var forbundet med signifikant øget den risiko for blærekræft. Funktionelle analyser viste, at

drosha

rs10719 T til C substitution kan nedsætte bindende aktivitet af HSA-miR-27b med

drosha

3’UTR.

drosha er medlem af RNase III superfamilien og er en vigtig nuklease, som henretter det første skridt i miRNA behandling ved at skære pri-miRNA til at pre-miRNA [31]. RNA-interferens af drosha resulterede i akkumulering af PRI-miRNA og reduktion af præ-miRNA og modne RNA [31]. Indtil nu har adskillige grupper studeret rolle

drosha

i kræft [32,33]. Det har rapporteret, at

drosha

rs644236 TT genotype og rs7737174 AA-genotypen var forbundet med risikoen for brystkræft hos postmenopausale kvinder [32].

drosha

3’UTR rs10719 er i stærk bindingsuligevægt med rs644236 baseret på tusind genomprogramledere data (r

2 = 0,88) [33]. I den foreliggende forbindelsesundersøgelse, fandt vi, at

drosha

3’UTR rs10719TC polymorfisme var forbundet med risiko for blærekræft. Stratificeret analyse viste, at rs10719TC /CC genotyper markant kan øge risikoen for blærekræft, især blandt mænd og rygere. En mulig forklaring er, at cigaretrygning er blevet etableret som den vigtigste risikofaktor for udviklingen af ​​blærekræft, som indeholder hundredvis af kemikalier, såsom polycykliske aromatiske kulbrinter [34,35]. Således kan nogensinde rygere være tilbøjelige til at være kræft. En anden årsag kan være, at sammenlignet med kvindelige, de mandlige mennesker er mere tilbøjelige til at udsættes for akkumulerede miljømæssige risikofaktorer involveret i ætiologien af ​​blærekræft som cigaretrygning, erhvervsmæssig eksponering (dvs. farvestof fremstilling, læder arbejde). Derudover har vi den relativt lille stikprøve af kvindelige mennesker. Derfor kan vi ikke registrere signifikant sammenhæng i kvindelige mennesker. Weng et al. foreslog også, at rs10719TC polymorfi var relateret med ondartet perifer nerve kappe tumor risiko, som støttede vores resultater [33]. Overekspression af drosha blev vist at bevirke celleproliferation og forudsagte dårlig prognose i esophageal cancer [36], ovariecancer [37], brystcancer [38], og livmoderhalskræft [39]. Tidligere undersøgelse havde også afsløret, at overekspression af drosha kan fremme celleproliferation og inhiberer celle apoptose i blærekræft [24]. Derfor fremsatte vi den hypotese, at

drosha

3’UTR rs10719C allel kan øge risikoen for blærekræft, hovedsagelig gennem regulering af ekspressionen af ​​drosha.

Det er blevet foreslået, at nogle af 3’UTR polymorfier kan være i miRNA bindende stedet eller i nærheden af ​​bindingssted og kan forstyrre miRNA-funktion, der fører til differential genekspression at påvirke udviklingen af ​​kræft [19,20]. Vores luciferase rapporterede gen-analyser viste, at

drosha

rs10719 T til C substitution forstyrret et bindingssted for HSA-miR-27b, resulterer den øgede niveauer af

drosha

3’UTR luciferase udtryk. Således er C-allel forbundet med en øget risiko for blærekræft, potentielt gennem øget drosha ekspression, hvilket var i overensstemmelse med den tidligere fund [24]. Endvidere er der ingen signifikant forskel i

drosha

mRNA-ekspression niveau blandt forskellige rs10719TC genotyper blev observeret i blære tumorvæv ved hjælp af RT-PCR-assay. Disse resultater antyder, at SNP ikke påvirker mRNA-ekspression imidlertid, eftersom miRNA binding til mRNA’er fører ikke altid til transkript spaltning, og nogle gange det fører til oversættelse undertrykkelse, er det muligt, at SNP fører til en ændring i drosha protein. Men vi ikke teste dette i vores studie, og derfor stadig en mulighed, men ikke bevist. Disse data antydede, at HSA-MIR-27b kan påvirke drosha ekspression ved kontrol af proteintranslation. Det var værd at bemærke, at vores funktionelle resultater var i overensstemmelse med resultaterne af en case-kontrol undersøgelse.

I den foreliggende undersøgelse, HSA-miR-27b blev først rapporteret at regulere ekspressionen af ​​

drosha

i blærekræft.