PLoS ONE: Målrettet Knock-Down af miR21 Primære Afskrifter Brug snoMEN Vektorer fremkalder apoptose i Human Cancer Cell Lines

Abstrakt

Vi har tidligere rapporteret en antisense-teknologi, “snoMEN vektorer«, for målrettet knock-down af protein-kodende mRNA med humane snoRNAs manipuleret til at indeholde korte regioner af sekvens komplementaritet med mRNA mål. Her karakteriserer vi brug af snoMEN vektorer til at målrette knock-down af mikro-RNA primære udskrifter. Vi dokumenterer den specifikke knock-down af miR21 i HeLa-celler ved anvendelse af plasmid vektorer, der udtrykker miR21 målrettede snoMEN RNA og vis denne inducerer apoptose. Knock-down er afhængig af tilstedeværelsen af ​​komplementære sekvenser i snoMEN vektoren og induktion af apoptose kan undertrykkes ved overekspression af miR21. Desuden har vi også udviklet lentivirale vektorer til levering af snoMEN RNA’er og vis denne øger effektiviteten af ​​vektor-transduktion i mange humane cellelinier, der er vanskelige at transficere med plasmidvektorer. Transduktion af lentivirale vektorer, der udtrykker snoMEN målrettet at PRI-miR21 inducerer apoptose i humane lunge adenocarcinoma-celler, der udtrykker høje niveauer af miR21, men ikke i humane primære celler. Vi viser, at snoMEN-medieret suppression af miRNA ekspression forhindres af siRNA knock-down af Ago2, men ikke af knock-down af Ago1 eller Upf1. snoMEN RNA colocalise med Ago2 i cellekerner og nucleoli og kan co-immunpræcipiteret fra nukleare ekstrakter af antistoffer, der er specifikke for Ago2

Henvisning:. Ono M, Yamada K, Avolio F, Afzal V, Bensaddek D, Lamond AI (2015) Målrettet Knock-Down af miR21 Primære Afskrifter Brug snoMEN Vektorer fremkalder apoptose i menneskelige kræftceller. PLoS ONE 10 (9): e0138668. doi: 10,1371 /journal.pone.0138668

Redaktør: Christophe Antoniewski, CNRS UMR7622 University Paris 6 Pierre-et-Marie-Curie, FRANCE

Modtaget: Juni 24, 2015; Accepteret: September 2, 2015; Udgivet: 25 September, 2015

Copyright: © 2015 Ono et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Finansiering af denne forskning blev leveret af en Wellcome Trust Programme Grant til AIL (Ref: 073.980 /Z /03 /Z) (https://www.wellcome.ac.uk/) og af en MRC Milstein Award til A.I.L. (Ref: G0801738) (https://www.mrc.ac.uk/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

snoMEN (snoRNA modulator af genekspression) vektorer tilvejebringer en form for antisense-teknologi til modulering af ekspressionen af ​​målgener baseret på komplementære baseparringsinteraktioner, analog med de mere kendte siRNA /shRNA vektorsystemer [1]. Den snoMEN vektorteknologi skabes ved manipulation af det humane rubrik C /D lille nucleolar RNA (snoRNA) HBII-180C. Denne klasse af snoRNAs indeholder en indre sekvens (M box), som kan ændres for at gøre det komplementære til RNA-targets. snoRNAs er en familie af bevarede nukleare RNA’er koncentreret i nucleoli hvor de enten funktion i ændringen af ​​ribosomale RNA (rRNA), eller deltage i behandlingen af ​​rRNA under ribosom subunit syntese [2-5]. Box C /D snoRNAs er opkaldt efter en fælles RNA motiv i denne underfamilie, der fungerer som et bindingssted for en gruppe af rubrik C /D-proteiner, herunder NOP56, NOP58, 15.5K og stærkt konserverede protein fibrillarin, som har den specifikke 2 ‘-O-methylaseaktivitet. De fleste snoRNAs er kodet inden intronsekvenser, enten placeret i de primære udskrifter af protein-kodende gener, eller i dedikerede udskrifter indeholder tandem arrays af flere snoRNAs. Endogene snoRNAs er meget rigelige nukleare RNA’er, der effektivt forarbejdede primære udskrifter. Således, forarbejdning og levering af snoMEN RNA’er er ligeledes effektiv og ikke tilbøjelig til mætning af værtscellen maskiner når snoMEN udtrykkes fra eksogene vektorer.

I tidligere undersøgelser blev det påvist, at snoMEN vektorer kan reducere protein ekspressionsniveauerne ved at banke-down ekspressionen af ​​nukleare præ-mRNA’er, hvilket tillader målretning af komplementære sekvenser i intron og /eller ikke-kodende 5′- og 3′-flankerende sekvenser i mRNA forstadier (præ-mRNA’er) [6]. Dette øger effektivt rækken af ​​sekvenser i mål-RNA’er, der kan udforskes for at opnå gen-specifikke hæmmende effekter. I lighed med endogene snoRNAs, er snoMEN RNA’er effektivt transkriberet fra RNA polymerase II promotorer, snarere end fra RNA-polymerasen III promotorer anvendes til shRNA plasmider [7]. Som snoMEN RNA’er er kodet i introner, er det relativt nemt at designe vektorer, der kan udtrykke flere snoMEN inden for forskellige introner med en enkelt transkript, som også koder for et protein reporter. Dette letter oprettelsen af ​​enten forbigående eller stabile gen knock-ins, udført ved hjælp af en enkelt udskrift, drevet fra en enkelt promotor. Denne fremgangsmåde ved anvendelse snoMEN vektorer er således anvendt til at etablere humant “protein udskiftning ‘stabile cellelinier, hvor ekspression af et målrettet protein er reduceret med snoMEN RNA’er og effektivt substitueret med ekspressionen af ​​et rekombinant protein der kodes af det samme transkript anvendt til at levere snoMEN [6].

cancer og andre proliferative sygdomme (såsom autoimmun sygdom og inflammation) er ofte forbundet med unormal apoptose, eller celledød. I cancerceller, for eksempel de mekanismer sædvanligvis forstyrret at inducere programmeret celledød efter enten alvorlig DNA-beskadigelse og /eller defekter i normal cellecyklusprogression, hvorved kræftceller at undgå apoptose. En potentiel metode til cancerterapi er således at udløse apoptose ved at finde en måde at fjerne de mekanismer, der blokerer de endogene signalveje, der ellers ville føre til døden af ​​kræftcellerne. Det menes nu, at en af ​​de medvirkende mekanismer, der muliggør mange former for cancerceller at undertrykke aktivering af celledødsveje medieres af overekspression af specifikke microRNAer, såsom miR21 [8].

miR21 var en af ​​de første miRNA påvist i det humane genom og viser stærke evolutionære konservering tværs af en bred vifte af hvirveldyrarter, herunder pattedyr, fjerkræ og fisk clader [9]. RNA udtryk profiler, påvises under anvendelse af high-throughput transkriptom profilering tilgange, som sammenligner miRNA i tumorer og andre cellelinjer, der er forbundet med cancer med de normale celler /væv, påfaldende tyder på, at miR21 er overudtrykt i langt de fleste cancertyper analyseret [8 ]. For nylig antisense undersøgelser rettet mod modne miR21 foreslog, at blokering miR21 funktion kan inducere apoptose ved at aktivere ekspression af den programmerede celledød 4 (PDCD4) protein i visse typer af cancerceller, f.eks HeLa-celler og MCF-7 celler [10, 11]. Hæmningen af ​​miR21 blev rapporteret ved brug syntetisk antisense oligonukleotidanaloger, som supplerer miR21 [12, 13]. Men mens miR21 knock-down via antisense oligonukleotider blev rapporteret at arrestere tumorcelleproliferation, både

in vitro

in vivo

, spørgsmål forbliver i at bruge denne fremgangsmåde til klinisk terapi, der vedrører den lave effektivitet af afgivelsessystemet og de potentielle bivirkninger af antisense-oligonukleotider, der mangler at blive behandlet. Brugen af ​​siRNA /shRNA som en alternativ mekanisme til målretning hæmning af miRNA er blevet foreslået som et terapeutisk, men omfatter også potentielle risici, såsom ikke-tilsigtede virkninger og forstyrrelser af RNA-inducerede silencing kompleks (RISC) i cellen [ ,,,0],14-17]. Ikke desto mindre har flere undersøgelser beskrevet hæmme udtryk for modne miR21 hjælp siRNA /shRNA specifikt påvirker kun 22 basen forarbejdet miRNA, men ikke forårsager knock-down af miR21 primære udskrift [18].

Micro RNA (miRNA) omfatter en familie af korte, regulatoriske RNA, typisk 22 nukleotider i længden, hvilket kan post-transkriptionelt regulere genekspression

in vivo

. I pattedyr er miRNA blevet rapporteret at regulere genekspression hovedsageligt ved mekanismer, der hæmmer translation af protein-kodende transkripter, sandsynligvis gennem baseparring til specifikke målsekvenser i mRNA 3 ‘utranslaterede regioner (UTR’er) [19]. I nogle tilfælde miRNA transkriberes som en selvstændig transkriptionsenhed, der koder ikke for protein. Men mange miRNA placeret i intronen sekvenser af protein-kodende gener. Disse intronbaserede kodet miRNA er således co-udtrykt med deres vært protein kodning gener [20-25]. Ældre miRNA behandles fra længere pre-miRNA udskrifter, som normalt ~ 70 nukleotid-lang, hårnål strukturer. Disse præ-miRNA igen behandles fra de oprindelige primære gentranskripter, der ofte omtales som PRI-miRNA [26].

I denne undersøgelse viser vi, at snoMEN vektorer kan anvendes til knock-down miR21 af rettet mod specifikke sekvenser inden pri-miRNA udskrifter, hvilket resulterer i apoptose af menneskelige kræftceller. Vi undersøger faktorer, der kræves for snoMEN medieret hæmning af miRNA ekspression og viser, at snoMEN kan leveres i celler fra både plasmid og lentivirusvektorer.

Resultater

snoMEN målretning PRI-miR21 inducere apoptose i transformerede celler

Vores hypotese er, at hvis snoMEN kan målrettes til at forårsage en reduktion i niveauerne af miR21 primære transkript dette kan inducere apoptose i tumorceller, hvis overlevelse afhænger af høje niveauer af miR21 ekspression. Derfor, for at teste, om snoMEN kan anvendes til at modificere ekspressionen af ​​miR21, en plasmidvektor, der udtrykker M box-modificerede snoRNAs målrettet mod endogen PRI-miR21 blev konstrueret (fig 1A), baseret på den tidligere snoMEN design [1]. Dette snoMEN vektor (mCherry-PRI-miR21 snoMEN) kodet tre snoMEN, som hver målrettede forskellige regioner af pri-miR21 sekvens. Disse tre snoMEN RNA’er hver indkodet i separate introner af samme RNA pol II transkript, som også koder for mCherry protein, der virker som et fluorescerende protein (FP) markør i transficerede celler. Efter transfektion af mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmidvektor ind i HeLa-celler, FISH (fluorescens

in situ

hybridisering) eksperimenter, hjælp snoMEN-specifikke prober, viste en steady state lokalisering mønster for de snoMEN RNA, der var overvejende nukleare, med ophobning i nucleoli (fig 1B og andre data ikke vist). Dette mønster er i overensstemmelse med tidligere snoMEN udtryk undersøgelser [1, 6].

(a) Struktur for målrettet endogene miR21 primære udskrift (mCherry-PRI-miR21 snoMEN) og skematisk diagram af miR21 modning vej. Denne konstruktion har tre snoMEN RNA’er (blå femkanter) som tidligere beskrevet [1], bortset fra at her de M box-sekvenserne er komplementære til specifikke sekvenser i det endogene miR21 primære transkript. (B) Validering af snoMEN ekspression ved fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse. Hver snoMEN RNA blev detekteret ved anvendelse af en M kasse specifik RNA-probe mærket med Cy3 (Cy3). DNA farvet med DAPI (DAPI). Scale bar er 10 um. (C) RNA-analyse. Totalt RNA fra HeLa-celler blev høstet 24 timer efter transfektion og QRT-PCR blev udført for at identificere miR21 precursor molekyler under anvendelse miR21 precursor specifikke primere (pre-miR21). Efter cDNA syntese blev qPCR udført med modnet miR21 specifikke primer og universel primer, som Perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, se også metoder) (Modnet-miR21). U3 blev anvendt som en loading kontrol. Graf viser middelværdi og standardafvigelse fra et minimum på 5 uafhængige forsøg. (D) HeLa-celler transficeret med PRI-miR21-snoMEN /Control til 24 timer før total RNA-ekstraktion og Northern blot-analyse.

Ved 24 timer efter transient transfektion af snoMEN plasmidet mCherry-pri- miR21 ind i HeLa-celler, som meget udtrykkelige miR21 [27], observerede vi ~ 65% og ~ 45% knock-down for pre-miR21 og modnet miR21, sammenlignet med en negativ kontrol snoMEN (Control) vektor, som bedømt af både QRT-PCR (fig 1C) og Northern blotting analyse (fig 1D). Endvidere celler transficeret med mCherry-PRI-miR21 snoMEN plasmid viste høje niveauer af apoptose (fig 2A pil). I modsætning hertil celler transficeret med en kontrol snoMEN plasmid (Control), der ikke er målrettet nogen endogene gener, viste ikke tegn på apoptose (figur 2A). Multiple markører for apoptose blev testet i hvert tilfælde, herunder en Annexin-V-assay under anvendelse af FACS (fluorescensaktiveret cellesortering) (Fig 2B), en immunofluorescensanalyse af spaltet Caspase-3 (fig 2C), Western blotting-analyse for spaltet PARP1 og spaltet Caspase-3 (fig 2D). Alle disse assays viste opregulering af apoptose specifikt i celler transficeret med mCherry-PRI-miR21 snoMEN plasmid. Imidlertid co-transfektion af plasmider miR21 shRNA-pLVX (som udtrykker præ-miR21) og mCherry-PRI-miR21 snoMEN, resulterede i ringe eller ingen cytotoksicitet og apoptose, sammenlignet med co-transfektion af celler med mCherry-PRI-miR21 snoMEN og den negative kontrol EGFP-pLVX (udtrykkende EGFP protein alene) ekspressionsplasmider (fig 3A og 3B). Disse resultater indikerer, at apoptose forårsaget af snoMEN-medieret miR21 depletering kan reddes af exogene miR21 end ekspression.

(a) Mikrografer viser eksempler på apoptose induktion i HeLa-celler transficeret med PRI-miR21-snoMEN. Billeder blev taget 72 timer efter transfektion. Pile viser cellerne viste en apoptose fænotype. Scale bar er 10 um. (B) Graf viser et tidsforløb af ændringer i populationen af ​​Annexin-V (apoptose markør) positive celler efter transfektion med enten pri-miR21-snoMEN (grøn), eller kontrol (rød). Det celleantal blev talt under anvendelse af FACS. Annexin-V-signal blev påvist ved hjælp af Guava nexin Reagent (Guava teknologier). (C) Billederne viser lokalisering mønster af DNA (DAPI, blå), en transfektion FP-markør for enten pri-miR21-snoMEN /Kontrol (mCherry, rød) og en Apoptose markør (kløvet caspase-3, grøn). Pilespidser viser Apoptose markør-positive celler. Scale bar er 10 um. (D) Western blot, der viser maker proteiner i HeLa-celler transficeret med PRI-miR21-snoMEN /Control til 24 timer før proteinekstraktion. Hele cellelysater blev analyseret ved anvendelse af de viste antistoffer.

(a) Mikrografer viser redning eksperiment af apoptose induktion ved co-transfektion med PRI-miR21-snoMEN (mCherry) og præ-miR21 ekspressionsplasmid (GFP + miR21) /kontrol-plasmid, der udtrykker GFP-protein alene (GFP). Billeder blev taget 72 timer, efterfulgt efter transfektion. Scale bar er 10 um. (B) RNA-analyse. Totalt RNA fra HeLa-celler blev høstet 24 timer efter co-transfektion med PRI-miR21-snoMEN (mCherry) og præ-miR21 ekspressionsplasmid (miR21) /kontrol-plasmid, der udtrykker GFP-protein alene (GFP) og QRT-PCR blev udført for at identificere miR21 precursor molekyler ved hjælp miR21 forstadium specifikke primere (pre-miR21, rød). Efter cDNA syntese blev udført under anvendelse af qPCR modnet miR21 specifik primer og universel primer tilvejebragt af Perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, se også fremgangsmåder) (Modnet-miR21, grøn). U3 snoRNA blev anvendt som kontrol. Graf viser middelværdi og standardafvigelse fra mindst 3 uafhængige forsøg. (C) Mikrografer viser forebyggelse af ikke-apoptose induktion ved transfektion med PRI-miR21-snoMEN mut, som har 3 basefejlparringer i hvert M kasse komplementær sekvens til PRI-miR21. Billeder blev taget 72 timer, efterfulgt efter transfektion. Scale bar er 10 um. (D) RNA-analyse. Totalt RNA fra HeLa-celler blev høstet 24 timer efter transfektion med enten pri-miR21-snoMEN mut eller Control. Efter cDNA syntese blev udført under anvendelse af qPCR modnet miR21 specifik primer og universel primer tilvejebragt af Perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, se også fremgangsmåder). U3 snoRNA blev anvendt som kontrol. Graf afbilder middelværdi og standardafvigelse fra mindst 4 uafhængige eksperimenter.

For at undersøge forholdet mellem sekvensen i M boksen region af snoMEN og PRI-miR21 målsekvens, en mutant version af mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmid (PRI-miR21 snoMEN mut), som omfattede tre uoverensstemmelser i PRI-miR21 komplementær sekvens, blev gjort og analyseret for at måle både knock-down niveauer og enhver potentiel apoptose fænotype (fig 3C og 3D). Resultaterne viser, at de 3 basefejlparring mutationer i M boksen effektivt at fjerne både apoptose fænotype og knock-down aktivitet, sammenlignelig med den negative kontrol snoMEN vektor (fig 3C og 3D). Vi konkluderer, at miR21 knock-down og den resulterende apoptose fænotype ses med det mCherry-PRI-miR21 snoMEN vektor afhænger sekvens komplementaritet mellem M boksen region og den målrettede region af PRI-miR21.

vi også konstrueret og testet en anden snoMEN vektor, mCherry-pre-miR21 snoMEN, som er rettet mod miR21 precursor-sekvenser (fig A i S1 File). Forbigående transfektion af mCherry-præ-miR21 snoMEN plasmidet i HeLa-celler resulterede i miR21 knock-down og induktion af apoptose, der ligner resultaterne opnået ovenfor med mCherry-PRI-miR21 snoMEN plasmid. Resultaterne for mCherry-pre-miR21 snoMEN og mCherry-pri-miR21 snoMEN plasmider var ens med hensyn til FISH-analyse, Annexin-V under anvendelse FACS og miR21 knock-down niveauer, som analyseres af QRT-PCR, (fig BD i S1 fil). Disse resultater indikerer, at snoMEN vektorer faktisk kan målrette miRNA primære udskrifter, der giver større fleksibilitet i udformningen af ​​knock-down vektorer end målrette kun kort (~ 22 base), modne miRNA-sekvenser.

Dernæst testede vi, om snoMEN vektorer kunne bruges til at målrette andre miRNA, der adskiller sig fra miR21. Således blev snoMEN vektorer designet til at målrette fire tidligere godt karakteriserede miRNA primære udskrifter [27-30], dvs. pri-miR31, pri-lad-7g, pri-miR132 og PRI-miR210, og deres knock-down aktivitet målt ved hjælp QRT -PCR efter transient transfektion ind i HeLa-celler (fig 4A). Dette viste, specifik og reproducerbar knock-down for alle fire målrettede miRNA, sammenlignet med de negative kontrol snoMEN, som bedømt af QRT-PCR. Desuden er der for hver af de målrettede miRNA i denne undersøgelse undersøgte vi specificiteten af ​​miRNA knock-down af snoMEN vektorer. For at gøre dette, vi brugte QRT-PCR til at måle og sammenligne niveauet af de respektive målrettede og ikke-målrettede mikro RNA’er efter udtryk for enten en miRNA målrettet snoMEN RNA, eller den negative kontrol snoMEN RNA (fig 4B). Dette viste for eksempel, at ekspressionen af ​​mCherry-pri-miR21 snoMEN forårsagede en specifik reduktion i miR21 niveauer med ringe eller ingen off-target effekter på niveauerne af de andre fire mikro RNA testet. Lignende resultater blev opnået for hver af de snoMEN vektorer målrettet mod de fire testede ovenfor, dvs. PRI-miR31, PRI-let-7g, PRI-miR132 og PRI-miR210 andre miRNA.

(a) snoMEN vektorer målrettet til yderligere miRNA. Totalt RNA fra HeLa-celler blev høstet 24 timer efter transfektion og efter cDNA-syntese, blev qPCR udført med modnet miRNA målrettet specifikke primere, dvs. miR31, lad-7g, miR132, miR210, og universel primer leveres af Perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, se også metoder) (Modnet-miRNA, grøn). U3 snoRNA blev anvendt som kontrol. Graf viser middelværdi og standardafvigelse fra mindst 3 uafhængige forsøg. (B) Analyse af specificitet målrette miRNA knock-down hjælp snoMEN vektorer. qPCR blev udført i 5 forskellige miRNA (miR21, MIR-31, lad-7g, miR132, miR-210) til at kontrollere mulige off target effekter af snoMEN vektorer målrettet pri-miRNA, dvs. pri-miR21 snoMEN, pri-miR31 snoMEN, pri -Lad-7g snoMEN, pri-miR132 snoMEN, pri-miR210 snoMEN. Grafen viser gennemsnitlige signal-forholdet for tre uafhængige forsøg, der sammenligner specifikke målrettede snoMEN med kontrol snoMEN transfektion (Kontrol, Red). Hvert signal blev normaliseret ved sammenligning med U3 snoRNA niveau.

Angivelse af snoMEN fra en lentiviral vektor

For at forbedre fleksibiliteten i at levere snoMEN i celler, især til formål at forbedre leveringen af snoMEN i cellelinjer, der viser lav transfektionseffektiviteter for plasmidvektorer, søgte vi at konstruere lentivirusvektorer der kan udtrykke snoMEN (fig 5A). De fleste pattedyrceller er modtagelige for lentivirus-infektion, herunder både delende og ikke-delende celler, stamceller, og primære celler [31]. Vi sammenlignede lentiviral udtryk for PRI-miR21 snoMEN i enten primære eller kræftceller, der stammer fra humane væv. To separate lentivirale snoMEN vektorer blev konstrueret, dvs. Lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN og Lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN, som er målrettet forskellige regioner af miR21 primære udskrift (Fig 5A og også se fig A i S1 File). Både PRI-miR21 snoMEN præ-miR21 snoMEN koder også mCherry cDNA som et udtryk markør for transficerede celler. Som vist ved FISH-analyse, hver af de Lenti-mCherry-PRI-miR21 snoMEN, Lenti-mCherry-præ-miR21 snoMEN og negativ kontrol Lenti-mCherry-Control snoMEN (EGFP målrettet), udtrykker snoMEN RNA’er, der akkumulerer i nucleoli, svarende til de opnåede resultater, når snoMEN RNA’er udtrykkes fra transficerede plasmidvektorer (fig E i S1 Fil og fig 1B) [1]. Ekspressionen af ​​snoMEN RNA’er fra de virale vektorer blev også bekræftet ved northern blot-analyse (data ikke vist).

(a) Struktur af lentivirale vektor, der koder snoMEN målrettet til det endogene miR21 primære transkript (Lenti-mCherry-PRI -miR21 snoMEN). Denne konstruktion har tre snoMEN RNA’er (blå femkanter) og en mCherry FP-markør-cDNA som beskrevet i fig 1A, bortset fra, at insertet blev sub-klonet ind i en vektor, som ville frembringe lentivirus partikel (pLVX-puro, Clontech). (B) Mikrografer viser apoptose induktion ved at transducere med enten Lenti-mCherry-pri-miR21-snoMEN eller Lenti-mCherry-Control-snoMEN viruspartikler. Billeder blev taget 72 timer efter transduktion. Scale bar er 10 um. (C) I alt RNA fra human lunge primære (ATCC-CCL-75) og lungekræft (ATCC-CRL-5868) celler blev høstet 24 timer efter transduktion. Efter cDNA syntese blev udført under anvendelse af qPCR både en modnet miR21 specifik primer og en universel primer, som Perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, se også fremgangsmåder). GAPDH blev anvendt som kontrol. Graf viser middelværdi og standardafvigelse fra et minimum på 4 uafhængige forsøg. (D) Graf viser et tidsforløb af ændringer i populationen af ​​Annexin-V positive celler transduceret med enten Lenti-pri-miR21-snoMEN (grøn), Lenti-pre-miR21-snoMEN (blå) eller holde Ctrl (rød). Det celleantal blev talt under anvendelse af FACS. Den Annexin-V-signal blev påvist ved hjælp af Guava nexin Reagent (Guava teknologier).

Næste, Lenti-mCherry-pri-miR21 virus blev transduceret enten ind i WI-38 (ATCC-CCL-75) menneske lung fibroblastceller (isoleret fra et foster ved 3 måneder svangerskabet), som udtrykker lave niveauer af miR21, eller i humane lunge adenocarcinoma-celler, der er etableret fra en human patient (alder 55, trin 2), som i høj grad udtrykkelig miR21 (fig F i S1 Fil). Dette miR21 ekspressionsniveauet ikke ændre sig efter at transducere en Lenti-mCherry-Control snoMEN vektor (Fig F i S1 File). Disse celler er vanskelige at transficere med DNA-plasmider under anvendelse af almen transfektionsreagenser. Mere end 90% af både primære og cancerceller viste mCherry ekspression 24 timer efter lentivirus transduktion. Primære celler transduceret ved enten pri-miR21 snoMEN, eller pre-miR21 snoMEN, holdt voksende og fortsatte med at udtrykke mCherry (Fig 5B og fig G venstre paneler i S1-fil). Imidlertid viste lentivirus transducerede lungeadenocarcinom celler, en stærk cytotoksisk fænotype inden for 3 dage transduktion (Fig 5B midterste panel og fig G højre paneler i S1 File). Selv om der blev observeret denne kræftcellen specifikke cytotoksiske fænotype efter transduktion med enten Lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN eller Lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN vektor, transduktion med den negative kontrol lentiviral vektor, der udtrykker snoMEN målrettet EGFP (Lenti-mCherry -Control snoMEN;. ingen endogen mål), viste ikke en cytotoksisk fænotype i enten primær eller lunge adenocarcinoma celler (fig 5B højre panel)

transduktion af enten Lenti-mCherry-pri-miR21 snoMEN, eller Lenti-mCherry-pre-miR21 snoMEN, i lunge adenocarcinom celler, som meget hurtig miR21 resulterede i hvert tilfælde i ~ 25% reduktion af niveauerne af modne miR21 RNA, sammenlignet med celler transduceret med den negative kontrol, Lenti-mCherry- kontrol snoMEN vektor, som bedømt ved QRT-PCR (fig 5C og fig H i S1 File). Endvidere Annexin-V assay anvendelse af FACS, viste opregulering af Annexin-V i lungeadenokarcinom celler efter transduktion med enten Lenti-mCherry-PRI-miR21 snoMEN eller Lenti-mCherry-præ-miR21 snoMEN, men ikke efter transduktion med den negative kontrol lentivirale snoMEN vektor (fig 5D).

Vi konkluderer, at lentivirusvektorer give udtryk snoMEN RNA’er kan transduceres i mammale celler med høj effektivitet. Levering af snoMEN målrettet til sekvenser i PRI-miR21 fremkalder apoptose i humane lunge adenocarcinom celler, men ikke i ikke-transformerede humane lunge primære celler.

Sammenligning af siRNA /shRNA og snoMEN PRI-miRNA interferens

Under vist ovenfor, at M box-modificerede snoRNAs kan reducere ekspressionen af ​​endogene miRNA i humane celler, når den rettes til en sekvens i det primære transkript af et miRNA, der ikke er til stede i det modne miRNA, vi næste sammenlignede evnen af ​​siRNA oligoribonukleotider til knock-down ekspression af miR21 når den rettes mod de samme primære transkript sekvenser (fig 6A). For at udføre disse sammenligninger, tre siRNA oligoribonukleotider komplementære til de samme primære transcript sekvenser i miR21 pri-miRNA som målrettet af M box-modificerede snoRNAs i mCherry-pri-miR-21 snoMEN, blev transficeret ind i HeLa-celler (Fig 6A og Fig I i S1 fil). Alle tre pri-miRNA siRNAs (si21M1-3), viste lidt eller ingen knock-down af enten modent-miR21 eller pre-miR21 niveauer, som gjorde en yderligere negativ kontrol siRNA (Scramble), som bedømt af QRT-PCR (Fig 6B venstre felt) og ved Northern blotting (fig 6B højre panel). Som en positiv kontrol, en anden siRNA rettet mod den modne miR21 sekvens (si21), resulterede i ~ 25% knock-down, specifikt for modne miR21 men ikke for pre-miR21, i overensstemmelse med tidligere rapporter [12, 13]. Desuden blev de samme analyser udført også bruger shRNA teknologi (Fig 6A og 6C og fig I i S1 File). Således tre shRNA ekspressionsplasmider pr gen, supplerer de samme primære transcript sekvenser i miR21 som målrettet af M box-modificerede snoRNAs i mCherry-pri-miR21 snoMEN, blev transficeret ind i HeLa-celler (Fig 6A og figur I i S1 fil) . Alle tre pri-miR21 målrettet shRNAs (sh21M1-3), igen viste lidt eller ingen knock-down i niveauerne af enten modent-miR21, eller pre-miR21, som gjorde en yderligere negativ shRNA kontrol, som bedømt af QRT-PCR ( fig 6C venstre felt) og ved Northern blotting (fig 6C højre panel). I modsætning hertil en positiv kontrol shRNA plasmid udtrykke en shRNA målrettet til den modne miR21 sekvens (sh21), resulterede i ~ 70% knock-down af moden miR21.

(a) De regioner på pri-miR21 RNA målrettet efter snoMEN vektor, der anvendes i denne undersøgelse er vist i et skematisk diagram (sh /si21M1-M3). De samme pri-miR21 sekvenser som er omfattet af den snoMEN vektoren blev rettet af siRNA oligoribonucleotider og shRNA ekspressionsplasmider. (B) Grafen viser resultatet af QRT-PCR /qPCR. Totalt RNA fra HeLa-celler blev høstet 24 timer efter transfektion og QRT-PCR blev udført for at identificere miR21 precursor molekyler under anvendelse miR21 precursor specifikke primere (præ-miR21, rød). Efter cDNA syntese blev udført under anvendelse af qPCR modnet miR21 specifik primer og universel primer tilvejebragt af Perfecta SYBR Green qPCR kit (Quanta Biosciences, se også fremgangsmåder) (Modnet-miR21, grøn). U3 blev anvendt som kontrol. Graf viser middelværdi og standardafvigelse fra et minimum på 4 uafhængige forsøg. Højre panel viser resultatet af Northern blot analyse for siRNA eksperimenter. Påvisning af endogene miR21 RNA niveauer efter transfektion af HeLa-celler ved hjælp af enten kontrol siRNA (Scramble: bane 1), miR21 siRNA (si21: bane 2), miR21 M box siRNA-1 (si21M1: lane3), miR21 M box siRNA-2 (si21M2: Lane4), miR21 M box siRNA-3 (si21M3: lane5). En ækvivalent mængde af HeLa total RNA blev påsat for hver bane og RNA separeret ved PAGE, elektroblottet på membran og probet begge med en miR21 probe og med et tRNA probe som en loading kontrol. (C) den samme serie af eksperimenter med siRNA transfektion, som beskrevet i fig 6b, bortset shRNA ekspressionsplasmider blev transficeret i stedet for siRNA’er.

Vi konkluderer, at snoMEN vektorer kan forårsage en reduktion i ekspressionen specifikke miRNA ved at målrette nukleare precursor RNA-sekvenser, der ikke synes at være modtagelige for knock-down af enten siRNA oligoribonucleotider eller shRNA vektorer. I modsætning hertil cytoplasmatiske RNA’er, herunder modne miRNA, kan blive slået ned af shRNA vektorer, der er målrettet de samme sekvenser anvendes i snoMEN vektorer.

Mekanisme snoMEN RNA-interferens

Vi har tidligere demonstreret at mekanismen, hvorved snoMEN kan modulere ekspressionsniveauet af en mål-mRNA kræver Argonaute-2 (Ago2), som igen er involveret i de vigtigste RNAi pathway [32]. Den snoMEN Mekanismen kan også involvere up-læserammeforskydning-1 (Upf1), som menes at være afgørende for nonsens-medieret henfald (NMD) vej [6, 33-35]. Det var dog ikke klart, om snoMEN-medieret modulering af ekspressionsniveauet af et målrettet ikke proteinkodende RNA, herunder PRI-miRNA, ville indebære nøjagtig den samme mekanisme. Derfor har vi undersøgt, om RNAi-medieret udtømning af flere proteiner, herunder Ago2 kunne påvirke evnen til snoMEN vektorer til at ændre ekspressionen af ​​miRNA (figur 7). Resultaterne viser, at snoMEN-afhængige knock-down af pri-miR21 niveauer blev forhindret specifikt i celler udtømt for Ago2 af siRNA behandling, sammenlignet med celler behandlet med en kodet siRNA negativ kontrol (fig 7A og 7B). Yderligere kontroller viste, at niveauet af snoMEN RNA udtryk ikke var påvirket af siRNA transfektioner (fig J i S1 File). Dette indebærer, at Ago2 kan være involveret, enten direkte eller indirekte, i mekanismen for snoMEN-medieret suppression af miRNA primære transkriptniveauer. Imidlertid fandt vi her, at hverken siRNA-medieret nedbrydning af Upf1, som tidligere blev vist at påvirke evnen af ​​snoMEN til knock-down proteinkodende RNA’er [6], ej heller af Ago1, der ligesom Ago2 [32], kan associere med snoRNAs, forhindrede hæmning af miR21 udtryk ved snoMEN.