PLoS ONE: MIR-203 Undertrykker ZNF217 Opregulering i kolorektal cancer og dens onkogenicitetsstudie

abstrakt

zinkfingerprotein 217 (ZNF217) er afgørende for celledeling og er blevet impliceret i tumorigenese. Men dens udtryk og præcise roller i kolorektal cancer (CRC) fortsat uklare. I denne undersøgelse har vi påvist, at ZNF217 ekspression afvigende blev opreguleret i CRC væv og forbundet med dårlig samlet overlevelse af CRC patienter. Desuden fandt vi, at ZNF217 var et formodet mål for microRNA (MIR) -203 hjælp bioinformatik analyse og bekræftede, at anvendelse af luciferase reporter assay. Desuden in vitro knockdown af ZNF217 eller fuldbyrdes udtryk for miR-203 svækket CRC celleproliferation, invasion og migration. Endvidere kombineret behandling af ZNF217 siRNA og MIR-203 udviste synergistiske inhibitoriske virkninger. Tilsammen vores resultater giver nye beviser, ZNF217 har en onkogen rolle i CRC og reguleres af miR-203, og åbner op for muligheden for ZNF217- og miR-203-målrettet terapi for CRC

Henvisning.: Li Z, Du L, Dong Z, Yang Y, Zhang X, Wang L, et al. (2015) MIR-203 Undertrykker ZNF217 Opregulering i kolorektal cancer og dens onkogenicitetsstudie. PLoS ONE 10 (1): e0116170. doi: 10,1371 /journal.pone.0116170

Academic Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, KINA

Modtaget: September 25, 2014 Accepteret: December 3, 2014; Udgivet: 26 januar 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. projektet blev støttet af China National Natural Science Foundation projekter (Grant nr 81.072.406, 81.271.916, 31.270.971 og 81.301.506), forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse i Kina ( Grant No. 20120131110055), og Shandong-provinsen Natural Science Foundation (bevilling nr ZR2010HZ004). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den anden og tredje mest almindelige ondartet svulst i hunner og hanner, henholdsvis hele verden, med over 1,2 millioner nye tilfælde og en anslået 608,700 dødsfald i 2008 alene [1]. Trods nylige fremskridt i diagnose og behandling af CRC, den samlede prognose for CRC patienter stadig ringe [2]. Derfor er der et presserende behov for at udvikle nye terapeutiske metoder til CRC. For at opnå dette, en dybere forståelse for de molekylære og genetiske netværk, der styrer initiering og progression af CRC er bydende nødvendigt.

ZNF217 gen er et onkogen nyligt klonet i 20

th. Det lokaliserer i kromosomet 20q13.2 og koder et Kruppel-lignende transskriptionsfaktor af zinkfinger proteinfamilie [3]. ZNF217 protein indeholder 8 forudsagte Kruppel-lignende C2H2 zinkfinger motiver og en prolin-rig region [4]. Et stigende antal undersøgelser har vist, at medlemmer af zinkfinger-protein familien spiller vigtige roller i udviklingen af ​​en række forskellige cancere [5]. Mange undersøgelser har bevist, at kopital forøgelse af kromosom 20q13.2 er forbundet med metastase af CRC [6] og ZNF217 opreguleres i tyktarmskræft som målt ved laser capture microdis sektion og multipleks kvantitativ real-time PCR [7].

MikroRNA’er (miRNA) er ikke-kodende, 18 til 24 nukleotid lange, enkeltstrengede RNA’er, der har evnen til negativt at regulere ekspressionen af ​​gener involveret i adskillige cellulære processer, herunder celleproliferation, apoptose, migration, invasion, og stressrespons [8, 9, 10, 11, 12]. Det har vist sig, at unormale mønstre af miRNA-ekspression er til stede i mange menneskelige karcinomer [13] og i forbindelse med patogenesen, progression, og naturhistorie af flere kræftformer [11, 14]. Nye data tyder på, at miRNA kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener og spille kritiske roller i udviklingen af ​​kræft [15]. En undersøgelse præsenterer beviser at ZNFs reguleres på post-transkriptionel niveau i brystkræft ved miR-181a, som direkte er rettet mod de kodende regioner af ZNFs [4].

I denne undersøgelse ved hjælp af bioinformatiske algoritmer og luciferase reporter assay fandt vi, at ZNF217 er et mål for miR-203, en tumor suppressor miRNA. At udforske de potentielle roller ZNF217 som en ny prognostisk biomarkør for CRC og dens regulering af miR-203 miRNA i CRC væv og parret normale kolorektale væv, vi udførte in vitro forsøg og bekræftede, at en) ZNF217 kan fremme spredning, invasion og migration af CRC cellelinier og 2) ZNF217 samt dens virkninger i CRC cellelinier nedreguleres af mIR-203, i håb om at yderligere at belyse mekanismen af ​​CRC udvikling og tilvejebringe hidtil ukendte fund for målrettet behandling af CRC.

Materialer og Metoder

Vævsprøver

i alt 82 CRC patienter, som gennemgik kirurgisk resektion af tumorer for CRC mellem juli 2004 og marts 2009 Department of General Surgery, Qilu Hospital i Shandong University, Jinan, Kina, blev rekrutteret til denne undersøgelse. Alle patienters data blev opnået fra kliniske og patologiske optegnelser, herunder alder, køn, tumorstørrelse, differentiering, placering, invasion dybde og metastase samt tumor-knude-metastaser (TNM) fase. Den postoperative patologiske iscenesættelse af hvert emne blev bestemt i henhold til det 7. udgave af Union for International Cancer Control (UICC) tumor-node-metastaser (TNM) iscenesættelse system til CRC. De operativt fjernede tumor væv og parrede tilstødende ikke-cancervæv (mindst 5 cm fra tumoren margen) blev straks opsamlet, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Ingen patienter fik kemoterapi eller strålebehandling før operationen. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Qilu Hospital, Shandong University og skriftlige informerede samtykke blev opnået fra alle tilmeldte patienter.

Immunhistokemi farvning og evaluering for ZNF217

Immunhistokemi (IHC) blev anvendt til opdage ZNF217 udtryk i paraffinindlejrede CRC væv. Paraffinindlejrede HCC væv blev skåret som 5 um snit bagt ved 65 ° C i 2 timer, og afparaffineres anvendelse af standardprocedurer. Efter antigen-genvinding og vask med Tris-buffer, blev ZNF217 primære antistof (Biosyntese Biotechnology CO, LTD, Beijing Kina) påført på objektglas og ekspression af ZNF217 blev gennemgået ved inkubation med et peroxidase-konjugeret gede-anti-kanin-antistof (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Beijing , Kina) i overensstemmelse med producentens retningslinier.

ZNF217 farvning blev vurderet under et lysmikroskop af to uafhængige efterforskere, der var uvidende om de kliniske resultater. Farvning blev betragtet som positive for ZNF217 når en stærk korrelation var tydelig i cytoplasmaet. Væv blev scoret semikvantitativt ved at tælle de positive cytoplasma 10 separate felter ved 400 x forstørrelse i de områder med den højeste tæthed af positivt cytoplasma. Den passende cutoff point er opnået ved hjælp af analyse af modtageren opererer karakteristiske (ROC) kurver plottet ved at tage de procentvise snesevis af tumor eller tilstødende ikke-tumorvæv som uafhængige variable. Den score nærmest både maksimal følsomhed og specificitet, [dvs. punktet (0.0,1.0) på kurven] var valgt som cut-off score. Prøver med farvning score over eller under cutoff point er klassificeret som positiv eller negativ, henholdsvis.

Cell kultur og transfektion

CRC cellelinier (HT-29, SW480, og SW620) og den menneskelige embryonal nyre (HEK) 293T cellelinie blev købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og HCT116 cellelinie blev købt fra Shanghai Institute for Biokemi og Cellebiologi (Kina). Alle cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; hyaline, UT) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en inkubator tilsat 5% CO

2.

Transfektion blev udført med lipofectamin 2000-reagens (Invitrogen) ved at følge fabrikantens protokol. En endelig koncentration på 50 nM miRNA, 100 nM (siRNA) og deres respektive negative kontroller blev anvendt til hver transfektion.

Forudsigelse af kandidat miRNA og luciferase reporter assay

De to mest udbredte og web -baserede bioinformatiske algoritmer (Targetscan og micrornaorg) blev anvendt til at forudsige kandidat miRNA målretning nukleotidsekvensen af ​​3′-utranslaterede region (UTR) af ZNF217 mRNA. For at verificere deres effektivitet, blev en luciferase reporter assay udført ved hjælp af pmiR-REPORTTM vektorer (RiboBio, Guangzhou, Kina) indeholdende vildtype (WT) -ZNF217 3′-UTR sekvens eller mutant (MUT) – ZNF217 3′-UTR sekvens . HEK293T celler blev transient cotransficeret med MIR-203 efterligner /MIR-negativ kontrol og WT-ZNF217 3′-UTR vektor /MUT ZNF217 3′-UTR. Luciferaseaktiviteter blev målt ved anvendelse af Dual-Luciferase assay kit (Promega, Madison, WI) 48 timer efter transfektion ifølge producentens anvisninger.

Real-time RT-PCR og Western blot

I alt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Alle manipulationer af RNA blev udført under RNase-fri betingelser. RNA-koncentrationen blev målt under anvendelse af en BioPhotometer plus (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) ved 260 nm, og det isolerede RNA blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Til analysen af ​​ZNF217 mRNA-ekspression. I alt 1 ug RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af SuperScript kit (Toyobo, Osaka, Japan) og QRT-PCR-analyser blev udført ved anvendelse SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japan) og en ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems , Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner. ZNF217 mRNA-niveau blev normaliseret for p-actin og folden ændringer i ZNF217 mRNA-ekspression blev kvantificeret under anvendelse af 2

-ΔΔCT relativ kvantificering metode. De anvendte primere til RT-qPCR af ZNF217 var frem, 5′-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3 ‘og Reverse, 5′-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3’. Alle ovenstående primere var fra BioSune, Shanghai, Kina.

For miR-203-ekspression blev cDNA syntetiseret ved hjælp gen-specifikke primere (Ribobio, Guangzhou, Kina) og M-MLV RT kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i en 20-pi reaktion. RT-reaktionen reagenser indeholdt 1 ug RNA-template, 1 pi 10 mM dNTP-blanding, 2 pi 0,1 M DTT, 4 pi 5 × første streng puffer, og 1 pi 40 U /pl RNase inhibitor. Volumenet blev indstillet med RNA-fri H2O. Revers-transkriptionsreaktion blev udført tre gange for at fjerne eventuelle outliers. MIR-203-ekspression blev vurderet ved hjælp af QRT-PCR og et ABI PRISM 7500 Sequence Detection System folden ændringer i miRNA udtryk blev bestemt ved hjælp af 2

-ΔΔCT metode; ekspressionen blev normaliseret til U6 lille nukleare RNA-ekspression niveau. De anvendte primere til RT-qPCR af MIR-203 var MIR-203 fremadrettet 5′-GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA-3 ‘, U6 fremadrettet 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′ og den universelle reverse primer 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 ‘.

Total proteiner blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse RIPA buffer indeholdende PMSF og kvantificeres ved hjælp af BCA protein assay kit (Beyotime, Haimen, Kina). I alt 30 ug proteiner blev underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Efter blokering blev membranen inkuberet med muse-anti-ZNF217 monoklonalt antistof (Abcam, Southampton, UK) eller muse-anti-β-actin monoklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) efterfulgt af inkubation med HRP-konjugeret sekundært antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Signaler blev bestemt ved en kemiluminescensdetektion kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev målt med en methyl-thiazolyltetrazolium (MTT) assay. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne podet ved en tæthed på 5 x 10

3 /brønd i 96-brønds plader. Efter dyrket i 24, 48, 72, 96 og 120 timer blev cellerne inkuberet med 20 pi MTT (5 mg /ml) i 4 timer ved 37 ° C. De dannede krystaller i cellerne blev flygtiggøres ved inkubation med 150 pi dimethylsulfoxid i 10 minutter ved stuetemperatur og kvantificeres ved måling af den optiske densitet ved 490 nm ved anvendelse af et enzymbundet immunosorbentassay reader (Tecan, Schweiz).

Cell invasion og migration assay

de invasive og vandrende potentialer cellerne blev evalueret ved hjælp transwell indsatse med porer på 8 um (Corning). For invasion assay 24 timer efter transfektion 3,0 × 10

5-celler i serumfrit medium blev tilsat til det øvre insert pre-coated med matrigel matrix. 500 pi 10% FBS-medium blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubation i 48 timer blev ikke-invaderende celler fjernet fra den øvre overflade af Transwell membran med en vatpind, og de invaderede celler på den nedre membranoverfladen blev fikseret i methanol, farvet med 0,1% krystalviolet, fotograferet og talt . Cellemigrationsassay blev udført under anvendelse af lignende procedurer bortset fra, at 2 × 10

5-celler blev tilsat til ikke-coatede inserter. Celler i seks tilfældige felter ved 200 X forstørrelse for hver indsats blev talt. Analyserne blev udført i tre eksemplarer.

Statistiske analyser

Students t-test blev anvendt til at analysere forskellene i ZNF217 ekspression mellem tumor og normalt væv. Korrelationer mellem ZNF217 udtryk og klinisk-patologiske træk blev analyseret af en parametrisk test: Mann-Whitney U test mellem to grupper og Kruskal-Wallis test for tre eller flere grupper. Den χ2 og Fishers eksakte test blev udført for at bestemme sammenhængen mellem ZNF217 udtryk og klinisk-patologiske parametre. Samlet overlevelse kurve blev beregnet ved Kaplan-Meier-metoden og overlevelse forskelle patientundergrupper blev sammenlignet ved log-rank test. Cox regression multivariat analyse blev udført for at estimere de uafhængige prognostiske faktorer for overlevelse forudsigelse. Sammenhængen mellem ZNF217 og miR-203 blev bestemt ved Pearsons korrelationsanalyse. Statistiske analyser og grafer blev udført ved hjælp af SPSS-version 17,0, Microsoft Excel og GraphPad Prism-software. P 0,05 blev betragtet som signifikant forskel.

Resultater

ZNF217 udtryk er korreleret med klinisk-patologiske funktioner i CRC

IHC-analyse af 82 tilfælde af CRC og deres tilsvarende noncancerous væv viste, at positive farvning for ZNF217 sås i cytoplasmaet af CRC-celler og tilsvarende ikke-kræft mucosa-celler (fig. 1A). De gennemsnitlige procentdele af celler farvet positive for ZNF217 i kræft og tilsvarende ikke-kræftrelaterede slimhinde var 76,3% og 38,9%, hhv. Ved at sammenligne procentdelen af ​​positive celler, blev det bestemt, ZNF217 ekspression i colorektal carcinom var statistisk højere end i det tilstødende ikke-kræft mucosa (P 0,001;. Figur 1B).

(A-venstre ) cytoplasma farvning af ZNF217 i CRC-celler. (A-højre) Manglende ZNF217 udtryk i normale colon epitelceller. (B) Procentdelen af ​​positivt farvede celler i kræft og tilstødende normale væv (* P 0,05, ** 0,01). (C) Kaplan-Meier analyse af den samlede overlevelse i CRC patienter i henhold til ZNF217 udtryk niveau. Den ZNF217 positiv gruppe (n = 55) viste signifikant kortere overlevelse sammenlignet med den negative (n = 27; P = 0,0405: log-rank test).

Correlation analyse afslørede, at ZNF217 ekspression var positivt korreleret med tumorstørrelse, dybde af invasion, og lymfeknude, (P 0,05), men ikke med patientens alder, køn, histologi kvalitet, og fjerne metastaser (P 0,05; tabel 1). Desuden viste Kaplan-Meier-test, at patienter med positiv ZNF217 farvning havde kortere overlevelse end dem med negativ ZNF217 farvning (P = 0,028;. Figur 1C).

Reduktion af ZNF217 udtryk undertrykker CRC celleproliferation, migration og invasion

for at måle biologiske egenskaber ZNF217 i CRC celler, vi testede proliferation og motilitet af CRC celler under betingelse af siRNA medieret knockdown af ZNF217 gen. Først undersøgte vi ekspressionsniveauet for ZNF217 i et panel af CRC cellelinjer, herunder HCT-116, HT-29, SW620 og SW480. Resultaterne viste, at ZNF217 ekspressionsniveau var den højeste i SW480-celler og de laveste i HT29-celler blandt alle testede cellelinier (fig. 2A). Baseret på dette udtryk mønster, vi derfor chosed SW480 for yderligere undersøgelser. Vi forbigående moduleret ZNF217 udtryk ved transfektion siRNA i SW480 celler og fandt, at siRNA-medieret ZNF217 lyddæmpning nedsat celleproliferation (fig. 2B) og forringede celle migration og invasion evner (Fig. 2C). Tilsammen angivet vores observationer, at ZNF217 kunne fremme proliferation, migration og invasion af CRC celler

(B) Reduktion af ZNF217 udtryk ved transfektion siRNA-ZNF217 signifikant hæmmede proliferation (* P 0,05). Og (C ) migration og invasion af SW480-celler (200 × forstørrelse, * P 0,05) sammenlignet med børnesikring og negative kontroller

ZNF217 var direkte rettet af miR-203

Brug. online miRNA target forudsigelse databaser (microrna.org og Targetscan), fandt vi, at ZNF217 var et potentielt mål for miR-203 (fig. 3A). For at verificere dette resultat, vi konstrueret luciferase indberettere af WT og Mut 3′-UTR af ZNF217 og udførte luciferaseaktivitet assay i HEK293T celler. Resultaterne viste, at transfektion af MIR-203 efterligner inhiberede signifikant ekspressionen af ​​WT men ikke Mut 3′-UTR af ZNF217 i HEK293T celler (fig. 3B). I overensstemmelse med disse resultater, transfektion af MIR-203 efterligner mindsket den endogene ekspression af ZNF217 både mRNA og protein niveauer i SW480-celler (fig. 3C og 3D). Desuden er der i den analyserede panel af 30 CRC patienter, observerede vi en omvendt korrelation mellem ZNF217 og miR-203-ekspression i CRC væv og deres tilstødende normale væv (Fig 4E, r = 0,792, P. 0,01;. Figur 3E). Tilsammen disse data kraftigt antydet, at miR-203 negativt regulerer ZNF217 udtryk via direkte målrette sin 3′-UTR sekvens.

(A) De formodede miR-203 bindende sekvenser i ZNF217 3′-UTR. (B) Luciferaseaktivitet assay blev udført for HEK293T celler cotransficeret med pmiR-REPORTTM vektorer indeholdende WT-ZNF217 3′-UTR eller MUT-ZNF217 3′-UTR sekvenser og miR-203 efterligner. Data er præsenteret som normaliseret gange ændring i luciferaseaktivitet. (C, D) ZNF217 mRNA og protein blev bestemt i SW480-celler transficeret med MIR-203 efterligner eller MIR-negativ kontrol ved QRT-PCR og Western blot hhv. (E) Inverse korrelation mellem ZNF217 mRNA-ekspression og miR-203 niveauer i CRC væv blev analyseret ved hjælp af Pearsons korrelationsanalyse.

(A) Ektopisk udtryk for miR-203 ved transfektion miR-203 efterligner væsentligt reduceret spredning af SW480 celler, i sammenligning med børnesikring og negative kontroller (* P 0,05). (C) Ektopisk ekspression af MIR-203 især inhiberede celle migration og invasion af SW480-celler (200 ganges forstørrelse, * P 0,05). Omvendt inhibering af MIR-203-ekspression ved transfektion MIR-203 inhibitorer samtidigt (B) fremmes proliferation (* P 0,05) og (D) migration og invasion af SW480-celler, sammenlignet med parentale og negative kontroller (200 ganges forstørrelse, * P 0,05). Figur er en repræsentant for 3 forsøg med lignende resultater.

Effekt af miR-203 på CRC celleproliferation, migration og invasion

For at validere, om miR-203 kunne regulere CRC celledeling udførte vi en proliferationsassay i SW480-celler transficeret med mIR-203 efterligner eller dets negative kontrol, og fandt, at forøget ekspression af mIR-203 signifikant inhiberede proliferation, (fig. 4A), motilitet (fig. 4B), samt invasion af SW480-celler. Omvendt nedregulering af MIR-203 i inhibitorer-transficerede SW480-celler tilsyneladende fremmet proliferation, motilitet og invasion af SW480-celler (fig. 4C).

Overekspression af MIR-203 delvist forstærker ZNF217 proliferation, migration og invasion af CRC celler

for yderligere at udforske ZNF217 medierede-tumorigene effekter er reguleret af miR-203, vi co-transficeret SW480 celler med ZNF217 siRNA i kombination med miR-203 efterligner. Vi observerede synergistiske inhibitoriske virkninger på ZNF217 ekspression (fig. 5A), samt proliferation, (fig. 5B), migration og invasion (fig. 5C) af SW480-celler co-transficeret med ZNF217 siRNA og MIR-203 efterligner i sammenligning med SW480-celler transficeret med enten ZNF217 siRNA eller mIR-203 efterligner alene. Tilsammen disse resultater viste, at funktioner af ZNF217 som en potent onkogen reguleres af miR-203.

(A) Effektiv undertrykkelse af ZNF217 proteinekspression af ZNF217 siRNA og miR-203 efterligner henholdsvis og combinedly. Bemærk at ZNF217 ekspression mere effektivt undertrykt af kombineret behandling. Undertrykkelse af ZNF217 resulterede samtidig i (B) signifikant hæmning af cellevækst og (C) migration og invasion (200 × forstørrelse) af SW480 celler sammenlignet med negative kontroller. Bemærk den synergistiske hæmmende effekt af kombinationen af ​​ZNF217 siRNA og MIR-203 efterligner, sammenlignet med en af ​​dem alene (* P 0,05)

Diskussion

ZNF217 er et nyligt. identificeret medlem af zinkfingerproteinet familie. Det primært fungerer som en transkriptionel regulatorisk faktor involverer i reguleringen af ​​tumor forekomst og udvikling [16]. ZNF217 har flere forskellige strukturelle domæner inklusive otte C2H2 zinkfinger-DNA-bindende motiver samt en prolin-rig (16-20%) domæne placeret i rest 757-1,005. Prolinerich domæner har vist sig at fungere som transkriptionelle aktivatorer i mange gener, såsom CTF /NF-1 [3]. ZNF217 genet er blevet omfattende undersøgt i brystkræft [4, 17], ovariecancer [18, 19, 20], esophageal pladecellecarcinom [21], gastrisk cancer [22, 23, 24] og prostatacancer [25, 26] , men ikke i CRC. Desuden har vist forøget kopital af kromosom 20q13.2 at være forbundet med metastase af CRC. Således er det især værd at undersøge dets potentielle roller i CRC udvikling.

I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at ZNF217 ekspression både mRNA og protein niveauer var signifikant højere i colorektale tumorvæv end i dets matchet ikke- tumorvæv og dets overekspression var forbundet med maligne klinisk-patologiske træk og korte overlevelse CRC patienter, hvilket indikerer, at ZNF217 fungerer som et onkogen i CRC.

De fleste kræftpatienter er døde af komplikationer som følge af metastaser. Derfor målretning metastatiske sygdomme er en central anti-cancer-strategi. Mange undersøgelser har vist, at zinkfinger-proteiner, der spiller kritiske roller i fremgangsmåderne ifølge tumorinvasion og metastase herunder ZNF217 kan reguleres ved en række forskellige gener [27, 28]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at knockdown af ZNF217 af siRNA førte til reduceret proliferation, invasion og migration af CRC-celler in vitro. Disse resultater afslører onkogene funktioner i ZNF217 i CRC. Faktisk er det blevet rapporteret, at tumorceller HO-8910, LNCaP, og DU145 [26] samt brystkræft væv [4] konstruktivt udtrykke høje ZNF217. Krig et al rapporterede, at mis-regulering af E-cadherin og endnu ukarakteriserede ZNF217 målgener [29] kunne forklare ændringerne i cellulær immortalisering, apoptose resistens, resistens over for kemoterapeutiske midler, og Akt phosphorylering i celler med et højt ekspressionsniveau af ZNF217 . Selvom hundredvis af gener er potentielle mål for ZNF217 og konsensus bindingssteder er blevet foreslået, de specifikke gener, der regulerer ZNF217 udtryk er lidt kendt.

Akkumulerende beviser tyder på, at afvigende ekspression af miRNA er knyttet til udviklingen af ​​CRC [ ,,,0],30, 31, 32]. Sofistikeret computer-baserede metoder til miRNA identifikation og target forudsigelse samt valideringsteknikker hvorpå disse forudsigelser har i høj grad bidraget til opdagelsen af ​​nye miRNA og deres funktionelle karakterisering. Derfor lille molekyle medieret dysregulering af miRNA fremstår som en potentiel ny terapeutisk tilgang for humane sygdomme, herunder kræft [33]. Blandt humane cancer-relaterede miRNA har MIR-203 tiltrukket betydelig opmærksomhed, fordi det udtrykkes aberrerende i en række forskellige cancere. I vores undersøgelse identificerede vi for at MIR-203 var markant nedreguleret i human CRC og restaurering af MIR-203-ekspression kunne inhibere proliferation, invasion og migration af SW480-celler. Tværtimod transfektion af MIR-203 inhibitor stimuleret proliferation, invasion og migration af SW480-celler. Disse resultater tyder på, at miR-203 er involveret i metastase processer CRC og er i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser, der viser, at miR-203 blev udtrykt ved lavere end normalt niveau i nogle kræftformer [34, 35, 36, 37]. Imidlertid har MIR-203 blevet beskrevet at udøve en onkogen funktion i nyre og blære kræft [38] og pancreas adenocarcinom [39]. De uoverensstemmelser i MIR-203 funktioner i forskellige typer af kræft kan afspejle forskellene i cellulære kontekst eller alternativt målrettede gener.

Den nuværende undersøgelse giver flere linjer af beviser, at ZNF217 er en roman mål for miR-203 og deres antagonistisk interaktion spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​CRC. Først luciferase reporter assay viste, at luciferaseaktiviteten under kontrol af den ZNF217 3’UTR kunne reguleres af MIR-203. For det andet blev en omvendt korrelation mellem ZNF217 og miR-203 niveauer observeret i CRC væv. For det tredje overekspression af MIR-203 undertrykte ZNF217 niveauer og førte til reduceret celleproliferation, migration og invasion i CRC cellelinier.

Sammenfattende i denne undersøgelse påviste vi, at ZNF217 ofte er opreguleret i CRC og et potentielt onkogen for CRC udvikling. I mellemtiden, beskrev vores forskning ZNF217 /miR-203 link og forudsat en potentiel mekanisme til ZNF217 dysregulering og bidrag til CRC celle invasion. Disse resultater åbner op for muligheden for at anvende miR-203 mod kliniske CRC behandlinger.

Tak

Forfatterne er taknemmelige for Shao-Feng Yan (Department of Neurokirurgisk, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan , Kina) varetagelse af siRNA-ZNF217 forfatterne også takker Chao Wang for hendes teknisk vejledning fra Shandong Provincial Hospital.