PLoS ONE: Fetal cyclophosphamid Eksponering Fremkalde testikelkræft og til nedsat Spermatogenese og ovariefollikel numre i mus

Abstrakte

Udsættelse for stråling under fosterudviklingen inducerer testiklerne kimcelletumorer (TGCT) og reducerer spermatogenesen hos mus. Men om DNA-beskadigende kemoterapeutiske midler fremkalde disse virkninger hos mus stadig uklar. Blandt sådanne midler, er cyclophosphamid (CP) i dag anvendes til behandling af brystkræft hos gravide kvinder, og virkningerne af føtal eksponering for dette stof manifesteret i afkommet skal forstås bedre til at tilbyde sådanne patienter egnet rådgivning. Den foreliggende undersøgelse er designet til at afgøre, om føtal eksponering for CP inducerer testikelkræft og /eller gonadal toksicitet i 129 og i 129.MOLF congene (L1) mus. Udsættelse for CP i embryonale dage 10.5 og 11.5 dramatisk forøget TGCT incidens til 28% i afkom af 129 mus (kontrol value, 2%) og 80% i den mandlige afkom L1 (kontrol-værdi 33%). Disse stigninger svarer til dem observeret i begge linjer af mus ved stråling.

I utero

udsættelse for CP også signifikant reduceret testis vægte på 4 ugers alderen til -70% af kontrol og induceret atrofiske sædkanaler i -30% af testiklerne. Når

i livmoderen

CP-eksponerede 129 mus nåede voksenalderen, der var betydelige reduktioner i testikelkræft og epididymale sædtal til 62% og 70% henholdsvis af kontroller. I kvindelige afkom, CP forårsagede tab af 77% af primordiale follikler og øget aktivering follicle vækst. Resultaterne viser, at i) DNA-ødelæggelse er en fælles mekanisme, der fører til induktion af testikelkræft, ii) øget induktion af testis cancer ved eksterne midler er proportional med den spontane incidens skyldes iboende genetisk modtagelighed, og iii) børn udsat for stråling eller DNA skadelige kemoterapeutiske stoffer

i livmoderen

kan have øget risiko for at udvikle testikel kræft og har reduceret spermatogene potentielle eller formindsket reproduktive levetid

Henvisning:. Comish PB, Drumond AL, Kinnell HL, Anderson RA, Matin A, Meistrich ML, et al. (2014) Føtal Cyclophosphamide Eksponering Fremkalde testikelkræft og til nedsat Spermatogenese og ovariefollikel Tal i mus. PLoS ONE 9 (4): e93311. doi: 10,1371 /journal.pone.0093311

Redaktør: Stefan Schlatt, University Hospital of Münster, Tyskland

Modtaget: Januar 28, 2014 Accepteret: 27 februar 2014; Udgivet: April 1, 2014

Copyright: © 2014 Comish et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Firenze M. Thomas Professorat i Cancer Research til MLM, Cancer center Support Grant P30CA016672 fra National Institutes of Health og Medicinsk Reasearch Rådets tilskud G1100357 til RAA. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de seneste 50 år er forekomsten af ​​testikelkræft kimcelletumorer (TGCTs) blandt kaukasisk mænd alder 15-40 år, den gruppe, hvor disse maligne sygdomme forekommer hyppigst, er steget 3 gange [1]. Mænds sædproduktion har også faldet konstant over de seneste seks årtier [2]. Begge disse negative resultater er foreslået for at være resultatet af prænatal eksponering for miljøskadelige stoffer, primært hormonforstyrrende [3]. Ikke desto mindre er der ingen entydige undersøgelser, der viser hormonforstyrrende stoffer at være de årsagsfaktorer bag en stigning i TGCT forekomst [4], [5]. Desuden er der en stigning i tidlig overgangsalder (præmatur ovariesvigt) hos kvinder, der synes at være stort set tilskrives øget overlevelse af cancerpatienter behandlet med strålebehandling og kemoterapi som børn eller unge kvinder [6]; har dog bidraget fra føtale eksponeringer ikke undersøgt.

129 musemodel [7], som har en 5% forekomst af testikelkræft teratomer, er den eneste dyremodel af menneskelige TGCTs, og selv om resultater ved hjælp af denne model kan ekstrapoleres til tumorer, der opstår hos unge mænd er stadig et spørgsmål om nogen debat, der er mange ligheder. Disse teratomer er histologisk og udviklingsmæssigt ligner menneskelige teratomer. I både mennesker og mus, opstår teratomer under tidlig postnatal udvikling på grund af en fejl i de pluripotente PGC’er, ankommer til genital højderyg, at differentiere til gonocytes forpligtet til spermatogenesen [7], [8]. Endvidere er begge disponeret af mutationer i Kitl eller Dmrt1 gener [9] – [12], og begge synes at involvere epigenetiske ændringer i deres ætiologi [13], [14]

I en tidligere undersøgelse,. vi fandt, at TGCT forekomst af mus udsat for lave doser af ioniserende stråling

in utero

steg dramatisk ovenfor end kontrolmus [5]. Vi fandt også, at ikke-tumorbærende testikler var signifikant mindre ved 28 dage gamle, sammenlignet med bestrålede modparter, angivelse af nedsat spermatogenese. Ekstrapolation af disse resultater til menneskelige forhold førte os til hypotesen, at stråling eksponering

i livmoderen

kan øge hanner risici for TGCT og infertilitet. I betragtning af de relativt lave strålingsdoser, at kvinder i den fødedygtige alder i øjeblikket modtager, er det usandsynligt, at stråling

i livmoderen

har været ansvarlig for den globale elevation i TGCT incidens og faldende sædtal. Snarere, eksponering for et kemisk hvis primære biologiske virkningsmekanisme svarer til den af ​​stråling kunne være ansvarlig for disse negative resultater.

Fordi stråling virker ved DNA-skader, vi hypotese, at DNA-beskadigende kemikalier, især den meget kræftfremkaldende alkylerende midler, kan være kandidater til fremkaldelse af TGCT. Vi valgte at undersøge virkningerne af cyclophosphamid (CP), fordi det er blevet bredt undersøgt og anvendes til behandling af gravide kvinder, såsom dem med brystcancer som en del af FAC (5-fluoruracil, adriamycin, cyclophosphamid) kombinationskemoterapi regime [15] . CP kunne være kræftfremkaldende for embryoet som det har høj transplacental overførsel i ikke-menneskelige primater [16], inducerer DNA strengbrud i musefostre [17], og forårsager sekundære maligniteter hos kræftpatienter [18]. Desuden CP er en stor reproduktionstoksisk stof i mandlige og kvindelige mus [19], [20] og præpubertale og voksne mennesker, der udsættes for CP kan udvikle permanent azoospermi og tidlig ovariesvigt [21], [22]. Men dens virkninger på carcinogenese og reproduktiv funktion efter føtale eksponeringer er ikke blevet endnu undersøgt.

Vi hypotese derfor, at

i livmoderen

CP eksponering kan være kræftfremkaldende for testiklerne og fremkalde reproduktionstoksicitet i både køn. Vi bruges 129 samt mere følsom 129.MOLF-L1 testis cancer musemodel til test induktion af TGCT af denne kemiske og også at teste testikeltoksicitet. Kun 129 mus blev anvendt til at teste æggestokkene toksicitet. Engagementer blev foretaget ved E10.5 og 11,5, som er kendt for at være et følsomt trin for induktion af testikelcancere [5], [7]. Derudover er der kun 1.000 til 3.000 kønsceller på disse aldre og stromale celler bare at blive dannet, hvilket gør både de gonadale kimceller og stromale celler mål for reproduktionstoksicitet.

Materialer og metoder

mus og avl

Inbred congene 129.MOLF-L1-mus, kaldet L1, var blevet udledt ved at krydse 129S1 /SvImJ og Molf /Ei indavlede mus af

mus musculus molossinus

underarter [23]. Ca. 30% af L1 hanner udvikler spontane testikeltumorer. Desuden 129S1 /SvImJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) og 129 /S5 (tidligere opnået fra Taconic og opretholdes i vores laboratorium) mus, som begge har -5% forekomst af spontant udviklede TGCTs blev også anvendt. Ingen større signifikante forskelle mellem resultaterne med de to 129 underlinjer blev observeret, så data kunne kombineres.

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg med godkendte protokol numre 110712632 og 110712633. musene anvendt i undersøgelsen blev huset i faciliteter på MD Anderson, der er registreret af det amerikanske Department of Agriculture og akkrediteret af American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care.

Behandlinger

Tidsstyret parringer blev udført med par af L1 eller 129 mus.

Drægtige hunner blev bestrålet med to doser af 0,8 Gy

6 ° Co-gammastråling gives på dag 10.5 og 11.5 i deres graviditet (E10.5 og E11.5) som beskrevet tidligere [5]. Den mandlige afkom 129 og L1 dæmninger fra de samme ynglende kolonier, der ikke modtog nogen af ​​disse behandlinger eller manipulationer blev analyseret som kontroller.

Gravide 129 eller L1 mus injiceret (ip) med CP, opløst i saltvand ved doser på 7,5 mg /kg på dag 10,5 og 11,5 af graviditeten. Afkommet fra dæmninger af samme ynglende koloni, der fik saltvand på disse dage blev brugt som kontrol.

Analyse

Mand afkom udsat for cyclophosphamid eller stråling

i livmoderen

og kontrol mandlige afkom blev aflivet ved 4 ugers alderen, fordi de fleste testikeltumorer umiddelbart kan gøres i denne alder [23]. For at bestemme virkningerne af

i utero

cyclophosphamid eksponering på spermatogenesen hos voksne blev nogle afkom 129Sv mus holdes indtil 8 ugers alderen og derefter aflivet. Testiklerne blev vejet og derefter fikseret i Bouins opløsning til histologisk undersøgelse og tumorer blev identificeret ved analyse af hematoxylin og eosin-farvede snit, som tidligere beskrevet [5].

I snit fra almindelige ikke-tumor-bærende testikler af 4 uger gamle mus, antallet af moderat store atrofiske tubuli uden nogen kimceller (Sertoli-only tubuli), observeret meste i det indre område af en enkelt mid-tværsnit af testis, blev talt. De små atrofiske tubuli til stede i det perifere region nær de rete testis blev udelukket fra denne analyse. Lejlighedsvis testikler i kontrol- eller behandlingsgrupper, der havde 20% atrofiske tubuli, muligvis på grund af en iboende abnormitet, blev udelukket fra denne analyse eller fra testis vægt gennemsnit

Historiske data fra en tidligere undersøgelse af induktion. af TGCT i

i livmoderen

bestrålede L1 mus [5] blev også brugt til sammenligning.

Sperm produktion blev vurderet hos voksne 129 mus, der ikke bærer tumorer. En af testiklerne blev homogeniseret efter vejning og lydbehandlet. Spermahovederne blev talt i et hæmocytometer [24]. For epididymale sædtal blev begge cauda epididymis hakket separat i 1 ml PBS og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter, og suspensionen blev ledt gennem en 80-um porestørrelse metal filter. Sperm blev talt ved hjælp af et hæmocytometer.

For at analysere virkningerne af

i livmoderen

CP eksponering på æggestokkene follikeludvikling blev kvindelige hvalpe aflivet efter 7 dage efter fødslen og æggestokkene fastsat i Bouins væske . Ovarierne blev paraffinindlejrede og serielt sektioneret ved 5-um tykkelse og slides blev farvet med hæmatoxylin og eosin.

For at bestemme ændringer i æggestokkene volumen, blev hver 10. slide bruges til at generere et område måling ved hjælp af Billed- Pro Plus software. Disse area målinger blev derefter anvendt til at beregne den ovarievolumen baseret på tykkelsen af ​​sektionerne og det samlede antal objektglas omfattende æggestokkene.

Sådan tælle forskellige typer af follikler, en sektion fra hver 10. slide blev afbildet under anvendelse af en 40 × objektive og flisebelagte [25]. Follikler blev klassificeret som enten primordial (med en enkelt fladtrykt lag granulosaceller); primær overgangsperiode (med nogle, men ikke alle, af granulosaceller allerede terningformet); primære (med et enkelt lag af kubisk granulosaceller); eller sekundær (med mere end et lag af kubisk granulosaceller). Det samlede antal af follikler /æggestok blev beregnet ud fra de rå follicle tællinger pr sektion ved hjælp af Abercrombie ligning [26] for at korrigere for follikel størrelse.

Statistisk analyse

Numeriske data præsenteres som middelværdier ± standardafvigelser af midlerne. Betydningen af ​​forskelle i kontinuerte variable (fx kuld størrelse, vægt, sperm tæller, rørformede eller follikulært numre) mellem eksponerede og kontrol mus blev evalueret af en Students

t

-test. Betydningen af ​​forskellene i kategoriske variable (fx produktion af afkom, forekomst af svulster eller atrofiske tubuli) mellem eksponerede og kontrolmus blev bestemt under anvendelse af Fishers eksakte test.

P

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. En computer-assisteret statistikprogram (IBM SPSS-version 19) blev anvendt.

Dataene for afkom af CP kontroller (

i livmoderen

saltvand-behandlede mus) og stråling-kontroller (afkom af ubehandlede mus) var ikke signifikant forskellige (med én undtagelse angivet i tabel S1) og blev samlet sammen.

Resultater Salg

Pregnant 129 (129S1 /SvImJ og 129S5) og L1 mus blev behandlet med to doser af CP, et ved hver af dage 10.5 og 11.5 i graviditeten. Indledende undersøgelser testede doser på 25 og 10 mg /kg givet på begge dage, men selv om alle hunnerne overlevede, 0/15 og 0/7 plug-positive kvinder, henholdsvis fremstillet afkom. Når CP-dosis blev reduceret til 7,5 mg /kg /dag, 24% og 31% af den succes parret 129 og L1 mus, henholdsvis fremstillet afkom (tabel 1). Procentdelen af ​​afkom-producerende CP-behandlede 129 dæmninger (24%) var signifikant lavere end for kontrolgruppen dæmninger (50%), men var ikke signifikant forskellig fra den af ​​den stråling-behandlede moderdyr (33%). Men CP eller stråling ikke påvirke kuldstørrelser. Desuden har mus udsat for stråling eller CP ikke vise nogen større teratogene virkninger, bortset fra at de fleste af de mus udsat for CP

i livmoderen

havde knæk i deres haler (fig. S1). Samlet set var der små, men betydelige reduktioner i legemsvægt af mus efter føtal eksponering for enten CP og stråling.

Testikler blev høstet fra den mandlige afkom samt tilstedeværelse og typer af tumorer blev bestemt ved histologisk undersøgelse (figur 1 A . B). Udsættelse for CP under graviditeten væsentligt (

P

0,001) øgede TGCT forekomst i den mandlige afkom af 129 mus fra en kontrol på 2% til 28% og i L1 mus fra 33% til 80% (tabel 2). I begge musestammer, jo højere forekomst af tumorer hos mus udsat for CP

in utero

var svarende til den i mus udsat for stråling

in utero

. Antallet af mus med ensidige eller bilaterale tumorer fulgte en binomial fordeling, hvilket indikerer, at forekomsten af ​​en tumor i hver testikel var en uafhængig begivenhed. Således udtrykker data på en pr testikel grundlag, CP inducerede TGCTs i 18% af testiklerne i 129 mus og i 64% af testiklerne i L1 mus. De fleste af disse tumorer var teratomer (figur 1A.); resten kun indeholdt neuroepitelceller tumorceller (fig. 1B). Sammenlignet med dem for kontrolmus, de TGCT-bærende testikler af L1-mus, men ikke 129 mus, der udsættes for CP eller bestråling var betydeligt tungere. Dette antyder, at både CP- og strålingsinduceret multipel tumorfoci i nogle af testiklerne af L1-mus. For at bestemme om mindre forskelle i genetiske makeup påvirkede tumor induktion, vi sammenlignet disse resultater på induceret TGCT forekomst af 129S1 /SvImJ mus til de af 129S5 mus (tabel S1). Der var kun en marginalt signifikant forskel (

P

= 0,04) med højere forekomst af TGCTs i CP-behandlede 129S5 mus end i CP-behandlede 129S1 /SvImJ mus.

(AD) Testes fra 4 uger gamle mus. (A) TGCT karakteriseres som en teratom stammer fra flere dermale lag; (B) TGCT kun indeholder neuroepitelceller. Forkortelser: BM: knoglemarv; CA: brusk; EEP: endodermal epitel; NE: neuroepitelceller; MS: muskel; ST: sædkanalerne. (C) ikke-TGCT-bærende testis viser aktive og atrofiske tubuli. (D) Stor forstørrelse af atrofiske tubuli, der kun indeholder Sertoli celler. (E-H) Ovarier fra 7 dage gamle mus. (E, G) fra en mus, behandlet på E10.5 og 11,5 med 7,5 mg CP /kg /dag. (F, H) Kontrol ovarie på samme alder. G og H er den forstørrede visninger fra dele af E og F henholdsvis viser ur (PO), primær-overgangsperiode (PT) og primære (PR) hårsække. Linjen repræsenterer 100 um i A, B, C, E F; 30 um i D; 10 um i G og H.

Desuden ved 28 dages alderen vægten af ​​tumor-fri testikler af 129 og L1 mus udsat for CP

i livmoderen

var reduceret til 74% og 72% af henholdsvis de af kontrolmusene (tabel 3); svarende til faldet observeret med 2 × 0,8 Gy stråling

i livmoderen

. Denne reduktion i testis vægt syntes ikke at være resultatet af vægttab, som forholdet mellem testiklerne og kropsvægt af giftstoffet-eksponerede mus var også signifikant lavere end den for kontrolmusene. Atrofisk Sertoli celle-only tubuli blev ofte observeret i grupperne af behandlede mus (figur 1 C . D), men sjældent observeret i kontrollerne. For eksempel ca. 30% af testiklerne fra CP- eller stråling-behandlede 129 mus havde atrofiske tubuli med et gennemsnit på 6 pr testis sektion (tabel 3). I modsætning blev observeret atrofiske tubuli i kun 4% af testiklerne fra kontrolmus, med et gennemsnit på 1,6 atrofiske tubuli per sektion. Selv når

in utero

CP-eksponerede 129 mus blev voksen, vægtene af testiklerne forblev reduceret til 78% af kontrolværdier (tabel 4). Reduktioner i greverne af testikelkræft og epididymis sperm til 62% og 70% henholdsvis kontrol blev observeret i disse mus efter

i livmoderen

CP eksponering, hvilket viser, at kønsceller tab var hovedansvarlig for reduktionen i testiklerne vægte.

i kvindelige afkom,

in utero

udsættelse for CP betydeligt reduceret mængden af ​​æggestokke til en værdi på 5,5 ± 0,6 × 10

7 um

3, i forhold til 13,0 ± 1,4 × 10

7 um

3 i kontroller (

P

= 0,001;. figur 1 E F). I disse mus er antallet af primordiale follikler pr ovarie var kun 23% af kontrolmus (tabel 5 og figur 1 G . H). Interessant, selvom mus udsat for CP

in utero havde

lavere antal af voksende (overgangsperiode, primær- og sekundære) follikler end kontroller blev forholdet mellem det samlede antal udvikle follikler til antallet af primordiale follikler øget fra 0,23 i kontroller til 0,62 i

i livmoderen

CP-eksponerede afkom (

P

0,05).

diskussion

i nærværende undersøgelse, vi demonstrerede for første gang, at kemisk eksponering under fosterudviklingen kan fremkalde TGCTs. Vi viste også, at

in utero

udsættelse for stråling eller CP dramatisk øger forekomsten af ​​testikeltumorer i 129 mus, og dermed udvider vores tidligere resultater ved hjælp af L1 mus, som er stærkt modtagelige for testikeltumorer [5], til en almindeligt anvendte stamme af mus, som kun er moderat modtagelige for sådanne tumorer. De kvalitative og kvantitative ligheder i induktion af TGCTs mellem mus udsat for stråling

i livmoderen

og dem i mus udsat for CP

i livmoderen

viser, at stråling og CP har lignende mekanismer i testikelkræft tumorigenese . Vi viste også, at disse

i livmoderen

-exposures resulterede i markante reduktioner i kønsceller numre i æggestokkene af kvindelige afkom og i testiklerne af mandlige afkom, der ikke udvikler tumorer.

De tidspunkter for eksponering for potentielle kræftfremkaldende stoffer til induktion af TGCTs blev oprindeligt udvalgt på E10.5 og E11.5 [5], da disse er de tidligste dage lige efter PGC’er kolonisere føtale gonadedosis og undergår omfattende epigenetiske ændringer [14]. Desuden PGC’er udtrykker stadig pluripotens markører og har evnen til at danne teratomer i transplantation analyser [7], som er tabt ved dag E13.5. Demonstrationen af ​​følsomhed over for induktion af TGCTs i dette tidsrum vindue i to agenter, CP og stråling, og for to stammer af mus, 129 og L1, understøtter dette valg. Selv om andre tider har endnu ikke undersøgt, er det mest sandsynligt, at vinduet i følsomhed over for induktion af TGCTs efter stråling og CP er begrænset til E10.5 til E12.5 i mus, som er den tid i mus hvorunder PGC’er er i testiklerne og er pluripotente, og endnu ikke er forpligtet til at kønsceller slægter.

Tidligere undersøgelser har vist, at enkelte engagementer med lav-dosis (~1.5 Gy) stråling, der leveres mellem E14.5 og fødsel årsag langsigtet skader på spermatogenese hos både mus [27] og rotter [28]. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at dette vindue af følsomhed over for stråling er endnu længere, der strækker sig så tidligt som E11.5 eller E10.5. Virkningerne vi observerede viser, at prænatal testikler er mere følsomme over for de langsigtede virkninger af stråling eksponering end voksne testikler er.

Selvom CP er en kendt teratogen og reproduktionstoksisk stof til pattedyr efter postnatal eksponering, dens prænatal virkninger på spermatogenese er relativt ukendt. En undersøgelse [29] viste, at CP givet til rotter på dag 12 af graviditeten påvirkede migration af PGC’er i fostre men fulgte ikke den postnatale udvikling af kønskirtlerne. Vores konklusion om, at en total dosis på CP på 15 mg /kg har langsigtede virkninger på spermatogenesen viser, at mandlige kønskirtler på E10.5-E11.5 er langt mere følsomme over for CP end voksne testikler er [30]. Fordi spermatogenese var følsom for stråling fra E10.5 til fødslen, er det sandsynligt, at spermatogenesen er også følsomme over for CP på disse tidspunkter. dette er dog stadig, der skal testes.

følsomhed oocyt og follikulært numre til CP behandling var forventet, da den behandling, påvirkede spermatogenesen blev givet på E10.5-E11.5 når PGC’er var i udifferentierede gonader. Hvis udtømning af PGC’er ikke blev kompenseret gennem ekstra spredning af oogonia, skal dette resultere i færre oocytter i æggestokkene. Studier, der undersøger eksponering af hunrottefostre til lave strålingsdoser [31] eller busulfan [32] har vist, at æggestokken er følsomme over for disse midler mellem E13.5 og 17,5. Derfor er det sandsynligt, at æggestokkene vil være følsom over for CP hele den sidste halvdel af fosterudviklingen.

Fordi CP, ligesom stråling, er et DNA-beskadigende middel, kan DNA-skader være en fælles mekanisme, der fører til TGCT dannelse og kim tab celle i embryoniske gonader. Skaden produceret af stråling og at forårsaget af CP har nogle fælles træk. Stråling, enten direkte eller gennem frie radikaler /reaktive ilt arter, indirekte forårsager hovedsageligt single- og dobbelt-strenget pauser, men også skaber nogle basen skader [33]. De CP metabolit phosphoramidsennep former addukter og interstreng-forbindelser med DNA [34] og metabolitten acrolein producerer reaktive ilt arter og DNA-addukter [35]. Den DNA-skader sandsynligvis dræber PGC’er fører til mangler i spermatogenesen og æggestokkene reserver. Desuden for at reparere eller omgå DNA beskadigelse, en DNA-beskadigelse-respons pathway aktiveres og forholdet af gener i denne vej til menneskelig testikelkræft er blevet påvist i et genom-dækkende sammenslutning undersøgelse [36]. En mulighed for den mekanisme, hvormed DNA-skade responset forårsager TGCT er, at det forstyrrer de omfattende epigenetiske forandringer inden for de PGC’er mellem E10.5 og 11,5, der er involveret i tab af pluripotens og engagement i kønsceller differentiering [14] .

rolle genetiske baggrund i induktion af TGCT af udefra kommende agenter og dens forhold til spontan forekomst blev vurderet ved at sammenligne induktion i 129

vs.

L1 mus. Eftersom tumorer var til stede i en høj procentdel af de eksponerede testiklerne og den øgede størrelse angivne multipel tumorfoci, var det nødvendigt at anslå antallet af tumorfoci pr testis, under hensyntagen til Poisson distribution. Antallet af foci var meget større i behandlede L1 mus (0,81 og 1,38, henholdsvis for CP og stråling) end i 129 mus (0,19 og 0,16, henholdsvis) (tabel S2). Dataene tyder på, at stigningen i inducerede TGCTs af DNA-beskadigende midler er proportional med den spontane hyppighed, og at susceptibly til induktion af TGCT i mennesker vil afhænge af den spontane hyppighed i forskellige etniske baggrunde [37].

den mekanisme, hvorved stråling og CP årsag sædcelledannende fejl sandsynligvis indebærer aflivningen af ​​PGC’er eller understøttende Sertoliceller. Hvorimod mindre testis kunne være resultatet af enten færre Sertoli celler eller spermatogonstamceller stamceller til at fylde nicher, tilstedeværelsen af ​​atrofiske tubuli med morfologisk normale Sertoli celler (Fig 1C . D) angiver, at kimceller tab er den dominerende virkning

.

reduktionen i ovariefollikel numre vi observerede også kunne have resulteret fra CP nedbryder de PGC’er i udifferentierede gonader. Hertil kommer, at højere forhold for at udvikle follikler til primordiale follikler i CP-eksponerede mus sammenlignet med kontroller viser en stigning i antallet af follikel rekruttering, som er blevet observeret i rotter, hvor eksponeringen for busulfan

i livmoderen

forarmet den oprindelige follicle pool [38]. Denne forbedrede aktivering af follikel rekruttering kan være et resultat af lavere koncentrationer af hæmmende faktorer fremstillet af det lavere antal primordiale follikler selv [39] eller af lavere mængder af anti-mullerian hormon produceret fra reducerede antal udviklingslande preantral hårsække [40]. Den forhøjede sats for follikel rekruttering vil yderligere nedbryder den oprindelige follicle pool som disse mus i alderen; således CP behandling

i livmoderen

før indrejse i meiose kan være en potentiel model for tidlig ældning i æggestokkene.

Resultaterne af den foreliggende undersøgelse har klinisk betydning, da mange gravide kvinder er diagnosticeret med brystkræft eller andre livstruende kræftformer kræver øjeblikkelig behandling, der normalt omfatter DNA-skadelige alkylerende midler såsom CP. Inden for de sidste par år flere grupper har rapporteret om mere end 400 børn af kvinder behandlet med kemoterapi i andet og /eller tredje trimester [41] – [45]. Den misdannelse sats og generelle sundhed og vækst i disse børn ikke er væsentligt forskellige fra børn, hvis mødre blev ikke behandlet med kemoterapi i disse tider. Disse børn inkluderet de mere end 100 kvinder, der modtog CP doser på ca. 2.000 mg /m

2, en del af FAC kemoterapi for brystkræft eller gynækologisk cancer under graviditet på The University of Texas MD Anderson Cancer Center [15] (JT Litton, upublicerede kommunikation). Men de fleste af børnene fra de ovennævnte undersøgelser er i øjeblikket præpubertal og stadig ikke har nået den alder, hvor de åbenlyse tegn på mulige negative resultater, såsom testikelkræft patogenese eller æggestokkene insufficiens bliver synlige.

Hos mennesker vinduet modtagelighed af PGC’er til tumorgene virkninger af DNA-ødelæggende midler sandsynligvis mere forlænget end hos gnavere. Årsagen er, i mennesker omdannelsen af ​​potentielt pluripotente PGC’er til begået kønsceller, som starter efter PGC’er er ankommet til testiklerne på 6 ugers fostrets udvikling, fortsætter gradvist i resten af ​​graviditeten og selv efter fødslen [46]. Selv om der gives kemoterapi i andet og tredje trimester, kønscellerne er stadig modtagelige for de giftige og tumorigene virkninger af kemoterapi.

Det er vigtigt at overveje, hvordan at ekstrapolere de mulige skadelige virkninger af CP findes i den foreliggende undersøgelse til menneske. Hvis menneskelige mænd udsættes for CP

i livmoderen

har en 6-dobling i testikelkræft forekomst, som blev observeret i mus i nærværende undersøgelse, den kumulative incidens af testikelkræft hos mænd i alderen op til 44 år vil øges fra ca. 3 pr 1000 til omkring 18 pr 1000 mænd [47]. For at detektere en sådan virkning, er en stor undersøgelse kræves med langsigtet opfølgning, som de fleste af de testikelcancere opstår efter puberteten. Men fordi den kumulative CP dosis til gravide kvinder (2.000 mg /m

2) [15] er 40 gange så givet til mus i den foreliggende undersøgelse (50 mg /m

2), den testikelkræft forekomst kunne være højere og dermed lettere detekterbar. Under alle omstændigheder, kan virkningen af ​​CP på den reproduktive funktion være mere udbredt og lettere at opdage i begrænsede populationer.

Eftersom virkningerne, om nogen, af

i livmoderen

eksponering hos mennesker fortsat usikre , bør læger bruge invasive markører for mulige negative udfald. Sædcelledannende potentiale i præpubertale hanner kunne vurderes ved måling af testikel størrelse. forventes normal pubertetsudvikling af hanner fordi fraværet af kimceller ikke interfererer med puberteten, og i puberteten fremkalder mænd, follikelstimulerende hormon og inhibin B-niveauer, og sperm tæller kunne måles. I præpubertale piger skal måles anti-mullerian hormon niveauer [22] for at vurdere æggestokkene reserve og data bør indhentes på puberteten, menarche, regelmæssighed efterfølgende menstruation, og efterfølgende frugtbarhed at vurdere den samlede reproduktive potentiale. Den nuværende undersøgelsens resultater understreger, at det haster med at teste disse reproduktive parametre i drenge og piger, så patienter, der sandsynligvis vil blive givet CP kan blive ordentligt rådgivet om de potentielle risici ved lægemidlet til deres ufødte børn, og passende foranstaltninger for at reducere eventuelle konsekvenser.

Støtte Information

Figur S1.

Fire uger gamle 129 mus udsat for cyclophosphamid (7,5 mg /kg) i embryonale dage 10.5 og 11.5 har knæk i deres haler (pile), en kendt teratogen effekt

doi:. 10,1371 /journal.pone. 0093311.s001

(PDF)

tabel S1. Sammenligning

af testikelkræft kønsceller tumor (TGCT) incidens og størrelse i to underlinjer af 129 mus udsat for stråling eller cyclophosphamid (CP)

i livmoderen

i embryonale dage 10.5 og 11.5

doi:. 10,1371 /journal.pone.0093311.s002

(DOCX)

tabel S2.

Sammenligning af stigning i det beregnede antal tumor foci pr testis i 129 og L1 mus udsat for cyclophosphamid (CP) eller stråling

i livmoderen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0093311. S003

(DOCX)

tak

Vi takker Joseph A. Munch i MD Anderson Institut for videnskabelige publikationer til redigering af manuskriptet.