PLoS ONE: Feber-Range Hypertermi vs. hypotermi Effekt på Cancer Cell Levedygtighed, spredning og HSP90 Expression

Abstrakt

Formål

Den aktuelle undersøgelse undersøger effekten af ​​feber-range hypertermi og mild hypotermi på humane cancerceller med fokus på cellelevedygtighed, proliferation og HSP90 udtryk.

Materialer og metoder

A549 og H1299 lungecarcinom, MCF7 brystadenocarcinom, U87MG og T98G glioblastom, DU145 og PC3 prostatacarcinom og MRC5 normale føtale lungefibroblaster cellelinier blev undersøgt. Efter 3 dages udsættelse for 34 ° C, 37 ° C og 40 ° C blev cellelevedygtighed bestemt. Celleproliferation (Ki67 indeks), apoptose (Caspase 9) og HSP90 udtryk blev undersøgt ved konfokal mikroskopi.

Resultater

Levedygtighed /sprednings forsøg viste, at MRC5 fibroblaster var ekstremt følsomme over for hypertermi, mens de var de mest modstandsdygtige over for hypotermi. T98G og A549 var termo-tolerant, idet de resterende er termo-følsom i varierende grad. Ikke desto mindre, som en universel virkning, hypotermi reduceret levedygtighed /proliferation i alle cellelinjer. Hypertermi skarpt induceret caspase 9 i U87MG mest termo-følsom cellelinie. I T98G og A549 termo-tolerante cellelinier, niveauerne af caspase 9 faldt. Desuden hypertermi stærkt inducerede hsp90 niveauer i T98G, mens et kraftigt fald blev indspillet i termo-følsomme PC3 og U87MG cellelinjer. Hypertermi sensibiliseret termo-følsomme kræft cellelinjer til cisplatin og temozolomid, mens dens sensibiliserende effekt blev formindsket i termo-tolerante cellelinier.

Konklusioner

Eksistensen af ​​termo-tolerant og termo-følsomme kræft cellelinjer blev bekræftet, hvilket yderligere fremmer forskning for at klassificere human tumor termisk forkærlighed for patient lagdeling i kliniske forsøg. Af interesse, mild hypotermi havde en universel undertrykkende effekt på kræft celledeling, yderligere underbygger radio-overfølsomhed hypotesen gennem reduktion af ilt og metaboliske krav

Henvisning:. Kalamida D, Karagounis IV, MITRAKAS A, Kalamida S, Giatromanolaki A, Koukourakis MI (2015) Feber-Range Hypertermi vs. hypotermi Effekt på Cancer Cell levedygtighed, spredning og HSP90 Expression. PLoS ONE 10 (1): e0116021. doi: 10,1371 /journal.pone.0116021

Academic Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians University, TYSKLAND

Modtaget: August 12, 2014 Accepteret: December 2, 2014; Udgivet: 30 Jan 2015

Copyright: © 2015 Kalamida et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. undersøgelsen er finansieret af erhvervsuddannelse og livslang læring – ARISTEIA projekt, kode nr 520, ESPA 2007-2013 GGET beslutning nummer 12.605 /2012/09/26. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancerceller, på samme måde som enhver anden celle og levende system, reagere på små ændringer af ydre temperatur ved aktivering homeostatiske biologiske mekanismer, i et forsøg på at opretholde et tolerant intracellulære miljø og forhindre dødsfald. Temperaturer over 41 ° C er toksiske både til tumorvaskulaturen og til kræftcellerne selv, og anvendes til at opvarme tumorer (Oncothermic Hyperthermi) med sigte på at undertrykke deres vækst, opnå regression eller mere bevidste om strålebehandling og kemoterapi [1]. Randomiserede forsøg har vist betydelig forbedring over lokale satser i sarkomer anvender regional hypertermi kombineret med kemoterapi [2].

Ikke desto mindre temperaturer under 41 ° C, ved den såkaldte feber-range hypertermi, har også en direkte effekt om kræft celler og væv biologi, sensibiliserende tumorer til strålebehandling og kemoterapi. Hele kroppen hypertermi mellem 38-40 ° C er blevet anvendt i behandlingen af ​​en udbredt metastatiske tumorer i kombination med kemoterapi [3, 4]. Øget blodgennemstrømning, der giver øget tumor iltning og kemoterapi tilgængelighed er formentlig en af ​​de vigtigste mekanismer i synergi [5, 6]. Proteinbeskadigelse er også et kritisk virkning af temperaturer over 39 ° C, men de præcise veje for celledrab forbliver undvigende [7]. Hæmning af homolog rekombination er også blevet foreslået som en mekanisme af tumor chemosensitization [8].

Desuden mild hypertermi som en supplerende behandling til kræft immun-terapi er blevet præsenteret af flere prækliniske og kliniske studier, ved at forbedre antitumor immunresponser. Den hyperthermia- inducerede forbedret immunrespons omfatter HSP’er generation, aktivering antigenpræsenterende celler og lymfocytter trafficking ændringer [9]. Desuden yderligere beviser indikerer, at fysiologiske reaktioner på induceret hypertermi påvirker mikromiljø tumoren sandsynligvis ved en mekanisme, der involverer temperaturfølsomme checkpoints regulerer tumor vaskulære perfusion, lymfocyt menneskehandel, inflammatorisk cytokin udtryk, tumor stofskifte, og sidst men ikke mindst, både adaptive og medfødte immun handling [10]. Øget aktivitet af naturlige dræberceller mod kolon tumorceller er blevet verificeret i mus, når temperaturen blev forøget ved 39,5 ° C [11].

Heat-Shock Proteins (HSP’er) er kraftigt opreguleret under hypertermiske betingelser, som deres højere affinitet til akkumulerende ufoldede proteiner frigiver HSF-1 transkriptionsfaktor bundet til HSP’er der træder kernerne at initiere HSP gentranskription [11]. HSP’er beskytter celler mod varmeinduceret protein skader ved deres chaperon aktivitet. Dog kan langvarig opvarmning resultere i HSP niveauer regression til normale niveauer. Tværtimod kan høje temperaturer over en tærskel inhiberer HSP syntese, som begunstiger celledød [12]. I flere detaljer, har Hsp90 /Hsp70-baserede chaperone maskiner blevet påvist at styre signalering af protein funktion, handel og omsætning. Det er også blevet for nylig foreslået, at Hsp90 og Hsp70 regulere behandling af beskadigede og unormale proteiner til nedbrydning via ubiquitinproteasomvejen. Studiet af HSP90 i særdeleshed, er meget vigtigt, da der indtil videre videnskabelig interesse var fokuseret på reguleringen af ​​sine typiske klient proteiner, men de seneste data tyder på, at HSP90 interagerer dynamisk med forskellige proteiner, som ikke er klassiske HSP90 klienter. Derfor HSP90 rolle i signalering og regulering af kvalitetskontrol og skæbne beskadigede proteiner er yderst vigtigt. [13]

Under alle omstændigheder kan cancercelle respons på hypertermi afhænge af både temperaturniveauer og eksponeringstider, yderligere omgivelsesbetingelser og, i hvert fald på den celletype, der undersøges. I den aktuelle undersøgelse undersøgte vi virkningen af ​​feber-range hypertermi på en lang række af cancerceller, som godtgør, at dens virkning på levedygtighed og proliferation er celle-afhængig. Hypotermi, et langt mindre undersøgt betingelse i cancer cellesystemer, blev også undersøgt. Virkningen af ​​hyper- og hypotermi på HSP90-ekspression blev undersøgt yderligere. Endelig blev hypertermisk chemosensitization undersøgt i to glioblastom cellelinjer (T98G og U87MG) og to lungekræft cellelinier (A549 og H1299). T98G og A549, blev de eneste termo-tolerante cellelinier undersøgt i sammenligning med to repræsentant, termo-følsomme cellelinier af samme tumortype, U87MG og H1299, henholdsvis med de passende kemoterapi narkotika for hver type kræft, sammen med mild hypertermi, for at undersøge en mulig sensibilisering eller modstand.

Materialer og metoder

Cellekulturer

A549 (human lunge adenocarcinom, CLS GmbH, Tyskland), H1299 (human ikke-småcellet lungekræft, ATCC), MCF7 (human brystadenocarcinom, CLS GmbH, Tyskland), U87MG (human glioblastoma-astrocytoma, CLS GmbH, Tyskland), DU145 (human prostatacarcinom, CLS GmbH, Tyskland), PC3 (humane prostataadenokarcinomceller, CLS GmbH, Tyskland) og MRC5 (humane føtale lungefibroblaster, CLS GmbH, Tyskland) cellelinier blev dyrket under anvendelse af DMEM basalt medium (31.885-023, Gibco) og T98G (human glioblastoma multiforme, ATCC) cellelinje blev dyrket i MEM basalt medium (10370-047, Gibco). Både basal dyrkningsmedier blev suppleret med 10% FBS (FB-1000/500, Biosera), 100 enheder /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin (15.140-122, Gibco) og 2 mM L-glutamin (25030, Gibco). Celler blev holdt ved standardbetingelser, 37 ° C, 5% CO2 i befugtet atmosfære og blev brugt efter at have nået 70-90% sammenflydning.

proliferationsassav

evne celledeling under forskellige inkubation temperaturer blev testet ved en spredning assay. Celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1000 celler /brønd, pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 3 timer for at lette vedhæftning og normal vækst og derefter blev anbragt ved 34 ° C, 37 ° C og 40 ° C, henholdsvis for tre på hinanden følgende dage. Proliferationer assays for alle de undersøgte cellelinjer og væksttemperaturer blev udført samtidigt. Celleproliferation blev udført i en 24-intervallet ved hjælp af alamarBlue cellelevedygtighed Reagent (DAL1100, Invitrogen) målt ved 540 nm excitations- og 590 nm emissionsbølgelængder, i en Fluostar Omega mikropladelæser (BMG LABTECH). The alamarBlue assay (DAL1100, Invitrogen) er en pålidelig fremgangsmåde til cellelevedygtighed [14]. Dette assay, ved anvendelse af den metaboliske aktivitet af cellerne for at reducere resazurin (oxideret form; 7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-1-10-oxid) til resorufin, kvantificerer antallet af celler med aktiv mitokondrier, eftersom resazurin reduktionen udføres af mitokondrie enzymer [15]. Eksperimenterne blev udført tre gange for at bekræfte signifikans af resultaterne.

Western Blot-analyse

glioblastomcellelinier (U87MG og T98G) blev dyrket under standardbetingelser, som tidligere nævnt. Disse cellelinier blev på lignende inkuberet ved 34 ° C og 40 ° C i 72 timer. Cellerne blev lyseret ved anvendelse af en sucrose lyseringsbuffer suppleret med en protease og phosphatase inhibitor cocktail (Cell Signaling). Proteinkoncentrationer blev målt baseret på BCA proteinassaykit (Thermo Scientific Pierce, USA). Specifik kanin polyklonale primære antistoffer blev anvendt til Western blot-analyse, anti-HSP90 (1: 1000; ab13495, Abcam) og anti-Caspase9 (1: 1000; ab47537, Abcam).

Hele fraktion prøver blev separeret på diskontinuerlige SDS-geler under anvendelse af 10% fraskillelse og 5% stacking-geler. Fyrre mikrogram celleekstrakterne blev fyldt på gelen. Immunoblotting blev udført under anvendelse af PVDF-PSQ membraner (Millipore Corp.). Efter en blokerende trin med 5% fedtfri tørmælk i 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 indeholdende 0,1% (v /v) Tween 20 (TBS-T) ved stuetemperatur (RT) i 2 timer, blev membranerne hybridiseret natten over ved 4 ° C med de primære antistoffer. Membranerne blev derefter hybridiseret i 2 timer ved 37 ° C med det sekundære antistof, ged polyklonale til kanin-IgG (H + L) -HRP (1: 3.000, Biorad, 1.706.515, USA) og endeligt udviklet i Amersham ECL Western blotting detektionsreagenser og analysesystem (RPN2209, GE Healthcare) udnytte Chemidoc MP Imaging System (Biorad, USA).

hypertermisk chemosensitization eksperimenter

i chemosensitization eksperimenter, 1000 celler /brønd blev forgyldt med en 96-brønds plade i passende dyrkningsmedium. Celler blev inkuberet med klinisk etablerede narkotika; lunge cancer cellelinjer: A549 og H1299 med 100 μΜ af cisplatin og glioblastoma cellelinjer: T98G og U87MG med 500 μΜ af temozolomid. Cellerne, samtidig med lægemiddelbehandling, blev inkuberet i 24 timer ved 37 ° C og 40 ° C, hvorimod cellernes levedygtighed blev vurderet efter 24 h inkubationstid ved alamarBlue assay og cellerne overlevelse procenter (%) blev beregnet. Statistisk analyse af 2WAY ANOVA test (n≥ 10 målinger for hver gruppe, ** p = 0,0037 for 5a p = 0,0097 for 5b, som er statistisk signifikant i begge tilfælde) og graf præsentation er blevet udført ved hjælp af GraphPad Prism version 5.01 statistisk pakke (GraphPad Software Inc., USA). Forsøgene blev udført tre gange for at bekræfte betydningen af ​​resultaterne.

Konfokal immunofluorescens og Billedanalyse

For immunfluorescensfarvning blev celler dyrket på No. 1.5 dækglas, fikseret i 3,7 % paraformaldehyd /PBS pH 7,4 i 20 minutter ved 37 ° C og derefter permeabiliseret i PBS /0,1% vol /vol Triton X-100, pH 7,4 i 5 minutter ved stuetemperatur. Desuden blev cellerne blokeret i PBS /5% vægt /volumen BSA pH 7,4 i 20 minutter og farvet med forskellige primære antistoffer: anti-Ki67-muse-monoklonalt (1: 150; DAKO) anti-Caspase9 kanin-polyklonalt (1: 100; Abcam ), anti-HSP90 kanin-polyklonalt (1: 100; Abcam), i 1 time ved stuetemperatur. Celler blev vasket i PBS pH 7,4, inkuberet med passende CF 488 og 564 sekundære antistoffer ved stuetemperatur, og DNA blev modfarvet med Hoechst 33342 (1 ug /ml; Sigma-Aldrich). Efter afsluttende vaske dækglas blev monteret i hjemmelavet Mowiol montering medium. Imaging blev udført på en tilpasset Andor Revolution Spinning Disk Konfokal System bygget op omkring et stativ (IX81, Olympus) med en 60x linse og et digitalt kamera (Andor Ixon + 885) (CIBIT Facility, MBG-DUTH). Billede købet blev udført i Andor IQ 2-software. Optiske snit blev registreret hvert 0,3 um. Alle konfokale mikroskopi billeder præsenteres i dette arbejde er 2D maksimal intensitet fremskrivninger af z-stack billeder (ImageJ 1.47v National Institute of Health, USA).

er udført Billede intensitet analyse for de opnåede datasæt ved hjælp ImageJ 1,47 v (National Institute of Health, USA) software. Billedbehandling makroer er blevet skik udviklet for at kvantificere niveauerne af de undersøgte proteiner (% fluorescensintensitet) for caspase 9 og HSP90 i området af interesse.

Billedanalyse og kvantificering af Ki67-udtryk i kernen har blevet udført ved hjælp af brugerdefinerede udviklede makroer i ImageJ software 1.47v (National Institute of Health, USA). er blevet analyseret En population af N-celler (n≥ 20), overfor Ki67 kvantificering. Cellerne blev kategoriseret i tre klasser, efter deres pixelenheder, der repræsenterer Ki67 ekspressionsniveauer. Klasse I var den lavere klasse, herunder celler med 1000-5000 pixels i den grønne kanal (Ki67 imaging) og klasse III var den højere klasse, herunder celler med mere end 7501 pixels, mens klasse II inkluderet 5001-7500 værdier hhv.

todimensionale (2D) gennemsnitlig projektion af z-stack billeder blev kvantificeret ved anvendelse af en standard størrelse firkantet område, hvor integrerede intensitetsværdier er blevet målt. Statistisk analyse af 2WAY ANOVA test (n≥ 20 celler for hver gruppe, * p 0,0001) og graf præsentation er blevet udført ved hjælp af GraphPad Prism Version 5.01a statistisk pakke (GraphPad Software Inc., USA)

Resultater Salg

Virkning af hyper- og hypotermi på cellevækst

efter en 3-dages inkubationsperiode ved feber rækkevidde hypertermi, ændringer af celleproliferation /levedygtighed var stærkt afhængig af hver enkelt cellelinie ( fig. 1). Den normale fibroblastcellelinie, MRC5, var yderst følsom over for hypertermi, der viser en udbredt celledød virkning. U87MG glioblastoma-cellelinie var også meget følsom over for hypertermi, hvilket inducerede en 10 gange reduktion i cellevækst. Prostata DU147 og PC3, samt lunge H1299 og bryst MCF7 cancercellelinier blev også temperaturfølsomme. Tværtimod T98G glioblastom og A549 lungekræft-cellelinjer var termo-tolerant, viser en vækst stigning på 1,87 og 1,18 gange.

% ændring af relative fluorescerende enheder (RFUs) som er optaget med Alamarblue assay, efter 3 dages eksponering af celler for hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) sammenlignet med normotermi (37 ° C).

hypotermi ved 34 ° C, på den anden havde en temmelig homogen effekt, hvilket resulterer i reduktion af både de normale MRC5 fibroblaster og al kræft cellelinjer levedygtighed (fig. 1). Denne reduktion varierede mellem 1,23 og 7,40 gange, i DU145 og U87MG cellelinjer, sammenlignet med kontrol (37 ° C) celler, som beregnet på den tredje dag af inkubation.

Effekt af hyper- og hypotermi på Ki67 proliferationsindeks

Da celleproliferation /levedygtighed vurderet af alamarBlue assayet er et resultat af kombinerede spredning og død begivenheder, vi yderligere undersøgt celleproliferation ved hjælp af Ki67-proliferation indeks. Efter 3 dages celle inkubation, hypertermi resulterede i en øget brøkdel af celler i klasse III, inT98G og A549 (1,3 og 1,4 gange henholdsvis) cellelinjer i forhold til normotermi. Dette faldt med 1,1 til mere end 45 gange i resten af ​​cellelinier (fig. 2a). Karakteristiske og repræsentative konfokale billeder af Ki67 nuklear farvning og ændringer efter eksponering for hypertermi er vist i fig. 2b

2a:. Ændringer i Ki67 proliferationsindeks klasse efter 3 dages udsættelse af celler for hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) sammenlignet med normotermi (37 ° C). 2b:. Repræsentative konfokal mikroskopi billeder, der viser nukleare Ki67 immunfarvning skiftende intensitet efter udsættelse for hypertermi (40 ° C)

Hypotermi resulterede i fald i celle ophobning i klasse III-gruppen med 1,2 op til mere end 45 fold i alle cellelinjer med undtagelse af DU145 prostatacancer-cellelinie, hvor dette blev forøget med 1,6 gange.

Virkning af hyper- og hypotermi på caspase 9 niveauer Salg

Konfokal immunofluorescens billeder af Caspase 9 ekspression i cellelinjer efter udsættelse for hypertermi og hypotermi er vist i fig. 3a. Plots af ændringerne fluorescensintensitet efter udsættelse for hypertermi og hypotermi er vist i fig. . 3b og 3c, henholdsvis

3a: Repræsentative konfokal mikroskopi billeder, der viser cytoplasmatisk Caspase 9 ekspression skiftende intensitet efter udsættelse for hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) sammenlignet med normotermi (37 ° C) ( forstørrelse x60). 3b, c:. Densitometri udført på konfokale mikroskopi billeder af caspase 9 immunfarvning efter udsættelse for hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) sammenlignet med normotermi (37 ° C)

Hyperthermi skarpt induceret caspase 9 i U87MG termo-følsom cellelinie, som også udviste den mest dybtgående nedsættelse af cellelevedygtighed i alamarBlue eksperimenter. Af interesse, både T98G og A549 termo-tolerante cellelinier, caspase 9 niveauer blev reduceret med hypertermi, hvilket tyder på en apoptose undertrykkende virkning af hypertermi i disse cellelinier. Den mest termo-følsomme af alle, MRC5 cellelinje, dog ikke viser øget Caspase 9 niveauer tyder død ved uafhængig af caspase 9 veje.

hypotermi induceret caspase 9 i U87MG, DU145 og MCF7-celler efter aftale med nedsat levedygtighed, demonstreret i alamarblue eksperimenter. I resten af ​​cellelinier, Caspase 9 ekspression var stabil eller den blev reduceret i tilfælde af T98G-celler, hvilket antyder, at hvis apoptoseveje aktiveres af hypotermi disse er Caspase 9 uafhængige.

Western blot-analyse udført i termo-tolerant T98G og temperaturfølsomme U87MG glioblastomcellelinier er vist i fig. 3d, der støtter de tidligere præsenterede resultater. Hypertermi induceret caspase 9 i termo-følsom U87MG cellelinje, mens dette blev reduceret i den termo-tolerante én, T98G. Hypotermi reduceret Caspase 9 niveauer i T98G cellelinje, mens ingen tydelig ændring blev noteret i U87MG én.

Effekt af hyper- og hypotermi HSP90 niveauer

Repræsentant konfokal mikroskopi og immunofluorescens billeder af effekt af hypertermi og hypotermi på HSP90 på cellelinier er vist i fig. 4a. Plots af fluorescens intensitetsændringer er vist i fig. 4b og c

4a:. Repræsentative konfokal mikroskopi billeder, der viser cytoplasmatisk HSP90-ekspression skiftende intensitet efter udsættelse for hypotermi (34 ° C) eller hypertermi (40 ° C) sammenlignet med normotermi (37 ° C) (forstørrelse x60) . 4b, c: Densitometri udført på konfokale mikroskopi billeder af HSP90 immunfarvning. 4d:. Western blot billeder af HSP90 udtryk i termo-tolerante T98G og termo-følsomme U87MG cellelinjer

Hypertermi stærkt forøget hsp90 niveauer i T98G termo-tolerant cellelinje, mens en skarp faldet blev indspillet i termo-følsomme PC3 og U87MG cellelinjer. På den anden side blev de HSP90 niveauer klart reduceres i alle undersøgte under hypotermi cellelinier. Western blot-analyse udført i termo-tolerante T98G og temperaturfølsomme U87MG glioblastoma cellelinier er vist i fig. 4d, hvilket bekræfter resultaterne af konfokal mikroskopi.

hypertermisk chemosensitization

Eksponering af termo-tolerante A549 og termo-følsomme H1299 lungekræft-cellelinjer til cisplatin, nøglen stof, der anvendes i den kliniske praksis til behandling af lungekræft, viste, at feber rækkevidde hypertermi kraftigt sensibiliseret H1299 på lægemidlet, men dens virkning på A549-cellelinje var minimal

5a (figur 5a.):. levedygtighed lungekræft-cellelinjer A549 og H1299 efter en 24 udsættelse for cisplatin under normotermiske og feber range hypertermiske betingelser. 5b: levedygtighed glioblastom cellelinjer T98G og U87MG efter en 24 udsættelse for temozolomid under normotermiske og feber range hypertermiske betingelser

Eksponering af termo-tolerante T98G og U87MG termo-følsomme glioblastom cellelinjer til. temozolomid, det eneste godkendte lægemiddel til behandling af human glioblastom, viste, at hypertermi ved 40 ºC kraftigt sensibiliseret U87MG cellelinien over for lægemidlet, mens der ikke sensibiliserende virkning blev bemærket for T98G on (fig. 5b).

Discussion

effekten af ​​feber-range hypertermi på normal og kræft cellebiologi og dens eventuelle rolle og indflydelse i celle følsomhed over for kemoterapi og strålebehandling stadig dårligt forstået, kræver yderligere undersøgelser. Mild hypertermi er blevet rapporteret at have en hæmmende virkning på celleproliferation. I en tidligere undersøgelse imidlertid Morrisey

et al

også rapporteret en stimulerende virkning af mild hypertermi ved 38 ° C på U87MG cellelinie, som blev kraftigt vendt ved 40 ° C [16]. Konklusionen af ​​disse forskere vedrørende forskellen respons blandt cellelinjer til små temperaturstigning er bestemt vigtigt. Den aktuelle undersøgelse har ført til fastlæggelse af to cellelinier (T98G og A549), som synes at være modstandsdygtige over for virkningen af ​​hypertermi ved 40 ° C. Den humane A549-cellelinje er tidligere blevet rapporteret at være resistente over for termisk drab ved 43-45 ° C i forhold til den U87MG cellelinjen [17], men en differential reaktion spænder fra proliferation til celledrab ved tåles godt af den menneskelige krop 40 ° C er nyt. Kombinationer af feber-range hypertermi kan derfor forsinke progressionen af ​​metastatisk sygdom i temperaturfølsomme tumorer med U87MG-lignende opførsel, medens G2-M-fasen målretning lægemidler kan vise sig kritisk til behandling thermo-tolerant T98G-lignende tumorer i kombination med kroppens samlede induktion af feber eller lokal giftfri opvarmning.

på den anden side bør den terapeutiske rolle hypotermi ikke undervurderes, og bør undersøges grundigt i dyremodeller, som omkring halvdelen af ​​de undersøgte cellelinjer viste en 3- 7 fold reduktion af levedygtighed ved 34 ° C. Den nuværende viden om dens virkning på cancercellen er begrænset. Hypotermi ved 28 ° C synes at beskytte fortrinsvis normale fibroblaster sammenlignet med cancerceller mod 5-fluoruracil [18]. I vores undersøgelse ved 34 ° C, normale humane fibroblaster lidt for reduceret proliferation af et omfang, imidlertid ret begrænset i forhold til flertallet af cancercellelinjer. Den reducerede metabolisme og oxygenforbrug af tumorer udsat for hypotermi kan også være vigtige i tumor strålingssensibilisering [19], en hypotese, der er blevet også testet i den kliniske praksis [20]. Rolle hypotermi hæmme kræft celle adhæsion til endotelceller og dermed migration som det fremgår af Zhang

et al

[21], giver en ekstra grundlag for yderligere undersøgelser af brugen af ​​hypotermi som en kræftbehandling mulighed.

Vi yderligere undersøgt, om døden effekt induceret af milde temperaturændringer i flere cellelinjer er Caspase-9-medieret. Asparaginsyren specifik protease caspase-9 er involveret i mitokondriel død pathway. Frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier aktiverer Apaf-1 (apoptosome), som på sin side spalter proenzym af Caspase-9 til dets mest aktive form. Alligevel spaltning ikke er essentielt for caspase-9 apoptotisk aktivitet [22]. I vores undersøgelse, hypotermi og hypertermi induceret caspase-9 i flere følsomme cellelinier, såsom U87MG, DU145 og MCF7, i overensstemmelse med den reducerede levedygtigheden noteret. I resten af ​​tilfældene, Caspase-9-ekspression forblev stabil, hvilket antyder, at hvis apoptotiske veje aktiveres af hypotermi disse er Caspase 9 uafhængige. For eksempel AIF (apoptoseinducerende faktor) eller Caspase-8 og 12 er alternative apoptotiske Caspase-9 uafhængige apoptotiske veje [23]. Af interesse, i T98G og A549 termo-tolerante cellelinier blev Caspase-9 niveauer reduceres under feber-varierede hypertermi, som bevis for en vej udnyttet af nogle cellelinjer at undslippe mitokondrie relateret apoptose.

HSP90, på den anden side, er en tung medlem af HSP-familien, med en vigtig rolle for tumorvækst, idet også sammen med dårlig prognose i brystkræft og andre maligniteter [24]. Den HSP’erne opreguleret under hypertermiske betingelser [11], for at beskytte celler mod varme-induceret protein skade ved deres chaperon aktivitet. Adskillige HSP90 hæmmere er blevet udviklet og er blevet påvist i

vivo

at være tumoristatic og have en synergistisk effekt med kemoterapi og andre mål behandlinger [25]. Det fund, at hypotermi reducerede ekspressionen af ​​HSP90 i alle undersøgte cellelinier er interessant. Virker som en fysisk agent inhibitor af HSP90, kunne hypotermi have synergistisk virkning med kemoterapi, i lighed med de kemiske inhibitorer. Af interesse, hypertermi forstærket HSP90-ekspression i termo-tolerante T98G-cellelinie, hvilket tyder på en beskyttende rolle af HSP90 i sådanne cellelinjer blomstrende under varme forhold.

hypertermi er også blevet undersøgt i kombination med kemoterapi narkotika. Det er tidligere blevet rapporteret, at samtidig hypertermi og cisplatin-induceret celledød i T leukæmiske celler ved forskellige molekylære mekanismer, på den måde den forøgede cisplatin-induceret cytotoksicitet ved hypertermi kan forklares [26]. Tilsvarende data er blevet rapporteret i et fase I-II studie til formål at vurdere mulighederne og alvorlig toksicitet af en kombination af cisplatin, bestråling og hypertermi, i behandlingen af ​​overfladiske cervikale nodal metastaser fra hoved og halscancer, hvor muligheden for kombinationen af cisplatin, bestråling og lokal ekstern mikrobølge hypertermi med en acceptabel toksicitet profil er blevet bekræftet. Derfor blev det yderligere foreslået, at trimodale terapi fortjener yderligere vurdering som en måde at forbedre effektiviteten af ​​bestråling i tilfælde af nodal metastaser fra hoved og hals tumorer [27]. I vores undersøgelse, eksperimenter af samtidig eksponering af lungekræft og glioblastom cellelinjer til feber rækkevidde hypertermi og klinisk etablerede kemoterapeutiske stoffer viste, at overfølsomhed tillagt ved hypertermi primært vedrørte termo-følsomme cellelinjer, mens dens sensibiliserende effekt var drastisk ringere termo-tolerant cellelinier. Dette finde yderligere understøtter behovet for at udvikle kliniske metoder i stand til at identificere temperaturfølsomme tumorer, der ville gavne mest, hvis de behandles med kombineret hypertermi og kemoterapi protokoller. Hvorvidt termotolerante tumorer kan blive følsomme over for hypertermisk kemoterapi ved at blokere HSP90 eller relevante biologiske veje er stadig en hypotese for yderligere eksperimenter.

Det konkluderes, at kræftceller reagerer forskelligt på milde temperaturændringer, hvad enten disse er i retning af mild hypotermi eller feber-range hypertermi. Thermo-tolerante og termo-følsomme cellelinjer er blevet identificeret til feber rækkevidde hypertermi, som tilskynder forskning for at finde egnede metoder til klinisk gruppering af humane tumorer i henhold til deres termiske forkærlighed. Sådan karakterisering ville muliggøre kliniske forsøg med ikke-toksiske lokaliseret eller kroppens samlede hypertermi hos patienter forventes at være følsomme over for sådanne behandlinger. Af interesse, mild hypotermi havde en undertrykkende virkning på celleproliferation i alle celler undersøgt, tyder på, at hypotermi ville undertrykke tumor replikation og metabolisme i de fleste humane tumorer, yderligere underbygger radio-sensibilisering hypotese gennem øget iltning ved at reducere oxygen og metaboliske krav.