PLoS ONE: Angivelse af RFC /SLC19A1 er associeret med tumortype i Blærekræft Patients

Abstrakt

Urinary blærekræft (UBC) rangerer niende i kræft på verdensplan. I Egypten, mønstret for blærekræft er enestående i, at både overgangs- og planocellulære typer sejre. Trods megen forskning om emnet, er det stadig vanskeligt at forudsige tumor progression, optimal terapi og klinisk resultat. Den reducerede folat carrier (RFC /SLC19A1) er den vigtigste transportsystem for folater i mammale celler og væv. RFC er også det primære middel til cellulær optagelse for antifolat cancer kemoterapeutiske lægemidler imidlertid membrantransport af antifolater fra RFC betragtes som begrænsende for antitumoraktivitet. Formålet med denne undersøgelse var at sammenligne mRNA ekspressionsniveauet af RFC /SLC19A1 i urothelial og ikke-urothelial varianter af blærecarcinomer. Kvantificering af RFC mRNA i slimhinden af ​​41 patienter ubehandlede blærecancer blev udført under anvendelse af RT-qPCR. RFC mRNA steady state niveauer var -9 gange højere (N = 39; P 0,0001) i blæren tumorprøver forhold til normal blære mRNA. RFC opregulering var stærkt korreleret med tumortype (urotelial

vs

ikke-urotelial, p. 0,05), hvor median RFC mRNA-ekspression var signifikant (p 0,05) højere i urotelial (~14 gange) i forhold til den ikke-urotelial (-4-fold) variant. Dette kan forklare den variation i respons på antifolat–regimer, der anvendes til behandling af begge typer. RFC mRNA niveauer var ikke associeret med tumor bedømmelse (I, II og III) eller trin (muskel-invasiv

vs.

Non-muscle invasive), hvilket indebærer, at RFC ikke kan anvendes til prognostiske formål i blærecarcinomer og dens øgede udtryk er en tidlig begivenhed i menneskets blæretumorer patogenese. Endvidere kan RFC betragtes som en potentiel markør til forudsigelse respons på antifolat kemoterapi i urothelial carcinomer

Henvisning:. Abdel-Haleem AM, El-Zeiry MI, Mahran LG, Abou-Aisha K, Rady MH, Rohde J et al. (2011) Angivelse af RFC /SLC19A1 er associeret med tumortype i Blære kræftpatienter. PLoS ONE 6 (7): e21820. doi: 10,1371 /journal.pone.0021820

Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, USA

Modtaget: Januar 19, 2011; Accepteret: 12 Juni 2011; Udgivet: 8 jul 2011

Copyright: © 2011 Abdel-Haleem et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af DAAD samt GUC som MSC projektstøtte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

20-60% af kræfttilfælde på verdensplan har været forbundet med ernæringsmæssige faktorer [1]. Blandt de mest omfattende undersøgt næringsstoffer der er involveret i kræft ætiologi er vitamin folinsyre. Folater er afgørende for liv, og folatmangel bidrager med en masse helbredsproblemer, herunder hjertekarsygdomme, fosterskader, neurologiske lidelser og kræft [1], [2].

Kræft i blæren er den niende mest fælles cancer verdensplan. Størstedelen (77%) af blæretumorer forekomme hos mænd. Det er den syvende mest almindelige malignitet hos mænd og 17 hos kvinder [3]. Spektret af blæretumorer er bred og omfatter overgangs- cellecarcinom (TCC), pladecellecarcinom (SCC), adenocarcinom og småcellet carcinom. TCC er langt den mest udbredte og bedst undersøgte. I USA, 90% af blæretumorer er af den urothelial variant, der udvikler sig fra overgangs- celler. Omvendt i Egypten, den mest almindelige histopatologiske form for blærekræft plejede at være SCC [4], der udgør fra 59% til 81% af de indberettede blære kræft mellem 1960 og 1980 [4], [5]. I modsætning til den førende ætiologien af ​​rygning og erhvervsmæssige eksponeringer i de vestlige lande, kronisk blære infektion med

Schistosoma haematobium

, har været den vigtigste risikofaktor for blærekræft i Egypten [5]. Men nyere undersøgelser [5], [6] rapporterede, at SCC i Egypten ser ud til at være faldet fra 78% i 1980 til 27% i 2005.

biopsiprøver af blæren tumor læsioner kan let opnås ved trans -urethral resektion (TUR) før behandling. Trods megen forskning om emnet, er det stadig vanskeligt at forudsige tumor progression, optimal terapi og klinisk resultat [7]. Tumor staging (TNM-system) anses for at være den bedste prognostiske markør; dog ikke nøjagtigt at forudsige udvikling eller tilbagefald opleves ofte [8]. Desuden behandlingssvigt er et stort område, hvor translationel blærekræft forskning kunne gavne patienterne. For eksempel MVAC regimen (en antifolat-regime) udviser kun begrænset antitumoraktivitet over ikke-overgangsperiode celle kræft mens responsrater på op til -70% blev rapporteret i TCC i samme undersøgelse [9]. Hvis genetiske forskelle mellem de to varianter af blære carcinomer påvirke deres progression og /eller respons på kemoterapi, så spørgsmålet er; som genetisk markør (s) er (er) de mest kritiske dem?

allestedsnærværende udtrykt reduceret folat carrier (RFC) betragtes som den vigtigste transportvej for folater ved fysiologiske cofaktor koncentrationer, selv når flere uptake systemer er til stede [ ,,,0],1], [10], [11]. Tab af RFC udtryk eller funktion varsler potentielt dybe fysiologiske og udviklingsmæssige konsekvenser [1], [12]. RFC er også en vigtig transportør af antifolatlægemidler anvendes til cancerkemoterapi såsom methotrexat (MTX), pemetrexed, og raltitrexed. Effektiviteten af ​​kemoterapi med disse stoffer er tæt knyttet til niveauer og aktiviteten af ​​RFC i både tumorer og normale væv [13], [14]. MTX, for eksempel, fortsætter med at være en vigtig del af det kemoterapeutiske armamentarium for en række forskellige maligniteter, herunder blærecancer [15], [16]. Pemetrexed er også for nylig blevet overvejet til anvendelse i behandling af blærecancer [16]. Membrantransport af disse antifolater er kritisk for antitumoraktivitet da dette tilvejebringer tilstrækkelig (ubundet) intracellulær lægemiddel til at opretholde maksimal inhibering af enzymmål (f.eks DHFR; Dihydrofolatreduktase) og til syntese af polyglutamatformer derivater kræves til højaffinitetsbinding til intracellulære enzymer [13 ]. Den reducerede folat carrier genekspression kan opgøres pålideligt studeret på mRNA niveau, og er baseret på en række undersøgelser [13], [14], [17], [18], [19], [20], [21] ekspression afspejler sandsynligvis aktiviteten af ​​RFC i både tumorer og normale væv. Derfor inspektion uoverensstemmelser i RFC udtryk blandt de forskellige typer af blære kræft kan bane vejen for mulig forbedring af rationelt baseret antifolat-holdige kemoterapi.

Den foreliggende undersøgelse blev dermed forpligtet sig til at undersøge mRNA-ekspression og potentielle kliniske relevans (dvs. foreninger med tumor stadie, grad og /eller histologiske type) af de store folat transportør, RFC, i en gruppe af humane urinblæretumorer af forskellige histologiske typer.

Materialer og metoder

Etisk erklæring

En indledende antal 61 blære kræftpatienter blev inkluderet i denne undersøgelse. Alle patienternes data blev analyseret anonymt og patienternes samtykke var opnået at omfatte udskæres væv til den aktuelle undersøgelse via patologi afdeling på National Cancer Institute (NCI), Kairo, Egypten. Alle forskningsaktiviteter protokoller blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelser NCI og forskning etiske komité i den tyske universitet i Cairo.

Patienter

Sixty en tumor biopsier blev opnået ved TUR på NCI under perioden fra marts 2009 til januar 2010. 17 prøver blev senere udelukket fra undersøgelsen under RNA kvalitetskontrol trin (se nedenfor). For de resterende 44 prøver blev tumor scenen og kvalitet tildelt i henhold til TNM [4] af den patologi enhed på NCI .. Patienterne inkluderet i denne undersøgelse (n = 44; 31 mænd, 11 kvinder og to uidentificerede, aldersgruppe: 31-79) blev tildelt i to hovedgrupper afhængig tumor histologisk seværdighed: urothelial tumorer ‘gruppe; TCC og TCC med skællede metaplasi; og ikke-urotelial tumorer ‘gruppe; SCC og adenocarcinom. På tidspunktet for optagelsen, havde ingen af ​​patienterne modtog behandling i enhver form. Kliniske karakteristika af patienter de blærekræft inkluderet i denne undersøgelse er anført i tabel S1.

Total RNA ekstraktion og revers transkription

Udskårne tumorbiopsier anvendt til mRNA-analyse blev straks placeret i RNA

senere

® RNA Stabilization Reagent (Qiagen, Tyskland), der holdes ved -4 ° C natten over, derefter opbevaret ved -20 ° C. Totalt RNA blev ekstraheret fra frosne biopsier (-30 mg) under anvendelse af Absolutely RNA mini-prep-kit (Stratagene, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Isoleret RNA integritet blev elektroforetisk verificeret ved ethidiumbromidfarvning og ved A

260 /A

280 absorption ratio (interval 1,8-2,0) (A260 nm = 1 svarer til 40 ug /ml RNA). En 02:01 intensitet forholdet mellem 28S og 18S rRNA blev betragtet som et benchmark for intakt RNA (figur S1). 17 tumor prøver blev udelukket fra undersøgelsen baseret på deres RNA integritet profil (Figur S1). 5 ug totalt RNA blev revers transkriberet med Sprint ™ RT komplette produkter kit (Clonetech, Tyskland) i et volumen på 20 pi ifølge producentens anvisninger.

RT-qPCR kvantificering af RFC-mRNA

RT-qPCR protokol fulgt i denne undersøgelse var struktureret omkring Minimum Information til Offentliggørelse af kvantitative realtids-PCR Eksperimenter (MIQE) retningslinjer, der er offentliggjort af Bustin

et al.

[22]. RFC mRNA blev kvantificeret ved RT-qPCR på Mx3005P ™ instrument (Stratagene, USA). Transkripter af β-actin blev kvantificeret som en endogen RNA kontrol [7], [23] for at eliminere variationer i mængden og /eller kvaliteten af ​​total RNA tilsat til hver reaktionsblanding, og hver prøve blev normaliseret på grundlag af dens β-actin mRNA-indhold. Alle kvantificeringerne i denne undersøgelse er præsenteret som forholdet mellem målgenet og β-actin. Primersekvenser, annealingstemperatur og PCR-produkter størrelse for målgenet RFC og henvisningen gen β-actin er præsenteret i tabel 1. Specificiteten af ​​hvert primerpar blev bekræftet ved smeltekurveanalyse (figur S2), hvilket resulterede i enkelt produkt specifik smeltning temperaturer.

Hvert primerpar blev evalueret for sekundære strukturer og SNP’er af

i silico

evalueringsværktøj på RTPrimerDB (https://medgen.ugent.be/rtprimerdb). Højt oprenset saltfri primer til RFC og β-actin (tabel 1) blev genereret kommercielt (Metabion GmbH, Tyskland) og optimeret til en to-trins (kombineret annealing /forlængelse temperatur) PCR-protokol. En pulje af 3 blærecancer cDNA prøver blev anvendt til assay optimering og evaluering amplifikationseffektivitet (tabel 1) under anvendelse af “standardkurven” metode. En standardkurve for hvert gen blev derefter genereret automatisk af Mx3005P ™ software, hvor log målet koncentrationen blev plottet mod det tilsvarende kvantificering cyklus (Cq) værdi [22]. Betingelser for alle PCR’er blev optimeret med hensyn til forward og reverse primere koncentrationer og forskellige annealing temperaturer (55-66 ° C). Real-time PCR mastermiksens af følgende reaktionskomponenterne var parat til den angivne ende-koncentration: 12,5 pi Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK), 0,2 pi fremad primer RFC (100 nM), 0,2 pi revers primer RFC (100 nM) og 11,1 pi nuclease-frit vand for målgenet; og 12,5 pi Power SYBR® Green PCR Master Mix, 0,75 pi fremadrettet primer β-actin (300 nM), 0,75 pi revers primer β-actin (300 nM) og 10 pi nuclease-frit vand for referencen genet. 24 pi af den fremstillede mastermiksens blev pipetteret per brønd i en plade med 96 brønde. 1 pi cDNA template blev derefter tilsat til hver reaktion brønd. Anvendelser af total cDNA input blev udført in duplo. Pladen med 96 brønde blev forseglet ved en PCR optisk klæbende film (Eppendorf AG, Tyskland). Følgende optimerede termiske profil blev anvendt: denaturering program (95 ° C i 10 min), forstærkning og kvantificering program gentaget 40 gange (95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 minut, med en enkelt fluorescensmåling), smeltekurveanalyse program (55-95 ° C med en opvarmningshastighed på 0,1 ° C per sekund og en kontinuert fluorescensmåling). De fluorescensdata blev opsamlet, og mRNA kvantificeret med Mx3005P ™ softwareversion 4.1. CQ værdier blev automatisk beregnet i henhold til “fit punkt metode”; hvor Cq defineres som fraktioneret antal cyklusser, hvor PCR kinetiske kurve når et program fastlagt loft mængden af ​​fluorescens.

gange ændring i ekspression af β-actin blev estimeret ifølge fremgangsmåden af ​​Schmittgen og Livak [24]. Som vist i tabel 2, variationen i β-actin-ekspression var minimal blandt urothelial og ikke-urothelial grupper.

Statistical Analysis

Dataene blev testet for normalitet ved anvendelse af Shapiro -Wilk normalitet test. Parametriske tests blev besluttet i overensstemmelse hermed. P-værdier mindre end 0,05 blev anset for at være betydelig. Mann-Whitney U-test og Kruskal-Wallis testen blev anvendt til at korrelere ekspressionen af ​​RFC med tumor stadium, grad og type. Softwaren

Graph Pad Prism

(version 5) blev anvendt til statistisk analyse.

Resultater

mRNA ekspressionen af ​​RFC

mRNA ekspressionen af ​​folat transporter RFC blev kvantificeret i 41 blære kræft prøver, tre prøver uden tegn på malignitet fås fra blære slimhinden støder op til kræft væv, og en kommercielt tilgængelig henvisning blære RNA poolet fra 26 mand /kvinde kaukasiere; alderen 22-70 (Clonetech, Tyskland). Sidstnævnte vil blive omtalt som kalibratoren i de følgende afsnit.

RFC-mRNA-ekspression blev detekteret i alle blære prøver, der anvendes i denne undersøgelse. Steady-state ekspressionsniveauer af RFC mRNA var signifikant (

P

0,0001) højere i blærekræft prøver med -9-fold (8,661, rækkevidde 0,98-50, N = 39) end i kalibratoren .

Klinisk

vs.

hisotpathological parametre

En multivariat analyse blev udført for at bestemme de vigtigste faktorer, som RFC mRNA ekspression blev forbundet. Korrelationen mellem RFC mRNA niveauer og de testede klinisk-patologiske parametre for blærecancer er opsummeret i tabel 3. RFC relative ekspressionsniveau var signifikant (

P

0,05). Højere i urotelial

vs

non -urothelial blærecarcinomer hvor RFC mRNA blev forøget med ~14-fold (13,27; n = 27) i urothelial tumorer i sammenligning med 4 gange (4,083; n = 10) kun stige i de ikke-urothelial varianter (figur 1A). Medianen Ekspressionsniveauet af RFC i TCC prøver var 17,48; n = 23 i forhold til 5,538; n = 6 i prøver, der er klassificeret som TCC med skællede metaplasi eller blandede overgangs- og planocellulært karcinom. Der blev dog ikke statistisk signifikant forskel mellem RFC mRNA-ekspression i blærekræft prøver klassificeret som ren TCC

vs.

Dem, der har TCC med planocellulært metaplasi (Figur 1D). Dette viser, at RFC mRNA-ekspression i ikke-urothelial tumorer er meget lavere end i deres urothelial modstykker og skællede komponent er overvejende forbundet med reduceret RFC-mRNA-ekspression. Udtrykket niveau af RFC i blære kræft prøver indeholdende bilharzial æg blev sammenlignet med dem uden tegn på bilharzial infektion, hvor RFC mRNA var signifikant (

P

0,05) faldt i bilharzial-associerede (BA) blærekræft prøver (3,13; n = 7) i sammenligning med den ikke-bilharzial-associeret gruppe (9,76; n = 32). (fig 1E)

Solid vandrette linjer demonstrerer medianen af ​​hver enkelt gruppe. Alle data er vist som forholdet mellem målgenet og beta-actin. *

P

-værdi, ikke-parametrisk, Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis test. BA, Bilharizal-associeret

Vi undersøgte sammenhængen mellem niveauer af ekspression af RFC mRNA og markører for tumor aggressivitet. (Nemlig, kvalitet og fase). Udtrykket af RFC mRNA korrelerede ikke med tumor bedømmelse (figur 1B), hvor der ikke var nogen statistisk signifikant forskel (

P

= 0,3008) påvist mellem kvaliteter I, II eller III. Endvidere blev RFC udtryk ikke statistisk ændret (

P

= 0,2666) mellem muskel-invasive og ikke-muskel invasive prøver (figur 1C). Især alle SCC prøver (n = 8) blev klassificeret som muskel-invasive tumorer, som peger på den mere aggressive natur SCC og ikke-urothelial karcinomer. Desuden ingen statistisk signifikant forskel (

P

= 0,2162) blev fundet i alderen patienter med urothelial karcinomer (gennemsnit = 60,42)

vs.

Dem af den ikke-urotelial gruppe (betyder = 52,88).

diskussion

Da pattedyrsceller ikke kan syntetisere folater

de novo

har stramt regulerede cellulære uptake processer udviklet sig til at opretholde tilstrækkelige niveauer af intracellulære folater [25], [26]. I forbindelse med malignitet, de store folat transportør-system, RFC, forøget udtryk er i overensstemmelse med behovet for at øge cellulære tilbageholdelse af folater at støtte kravene i de hurtigt delende kræftceller til DNA-syntese og replikation. I den foreliggende undersøgelse, vores resultater i human blære cancer biopsier var i overensstemmelse med dette begreb hvor RFC-mRNA-ekspression blev øget signifikant ved ~14 gange i urothelial blærecarcinomer (TCC og TCC med skællede metaplasi) og ved -4-fold i ikke-urothelial varianter (SCC Adenocarcinom). Ændret udtryk for RFC er også blevet rapporteret i leukæmier, især B-forstadie ALL [11], [26], [27], osteosarcom [17], kolorektal cancer og primære centralnervesystemet lymfomer [1] på både udskrift og protein niveauer.

uoverensstemmelsen i RFC mRNA-ekspression mellem urotelial og ikke-urothelial blæretumorer, rapporteret i den aktuelle undersøgelse, kunne tilskrives opstrøms genetiske begivenheder, der finder sted i hver type, som kan påvirke transkriptionel regulering af transporter. Både allestedsnærværende og vævsspecifikke TF’er der transaktivere eller undertrykker transskription som respons på krav til folat cofaktorer kontrollere netto niveauer af RFC-transkripter i væv [1], [18]. Litteratur og sti minedrift ved hjælp af

LitInspector

software [28] viste, at RFC (SLC19A1) har potentielle interaktioner med CREB1 (CAMP responsive element bindende protein-1). CRE /AP-1-lignende konsensus sekvens er en af ​​de to store steder af regulering af RFC basale initiativtagere [18]. CREB, som binder til CRE /AP-1, er blandt de TF’er aktiveret af ERK’er (MAPK), som er komponenter af RTK-Ras-signalvejen. Tilfalder data viser, at centrale elementer i denne signalvej ofte aktiveres i humane urothelial karcinomer [29], men ikke i de ikke-urothelial typer [30], [31]. I humane fibrosarcomceller, CREB-1 og c-Jun var cellespecifikke transkriptionsfaktorer, der er involveret i CRE bindende i RFC promotoren. Lignende resultater blev rapporteret for CREB-1 og ATF-1 i humane hepatocellulært carcinom celler og humane leukæmiceller [18], [32]. Endvidere kan to tredjedele af de antifolat–resistente cellelinier viste et markant fald i transskriptionsfaktorbindende til et enkelt CRE tilstede i minimale promotor A i RFC-genet [33]. Der er derfor stigende tyder på, at binding af CREB-1 til CRE i RFC promotoren er en vigtig bidragyder til induktion af RFC genekspression i kræftceller og maligne tumorer [18], [32], [33]. Derfor vi hypotesen, at den konstitutive aktivering af RTK-RAS vej er formentlig en faktor, der tegner sig for øget RFC mRNA-ekspression i urothelial karcinomer. I ikke-urothelial karcinomer, men RAS mutationer er sjældne og andre mutationer spiller ind (p16 p15 sletning [31], [32], Bax, Bak EGFR overekspression og p53 inaktivering [32]). Derfor forventer vi, forskellige genetiske begivenheder at have ført til den beskedne stigning i RFC mRNA niveau i ikke-urothelial karcinomer, og muligvis forskellige TF’er involveret i RFC transskription aktivering. Dette understøttes yderligere af det faktum, at øget RFC ekspression er meget sandsynligt at være forbundet med inaktivering af tumorsuppressorgener, hvor 5-methyl tetrahydrofolat (5-CH3-THF) er en cofaktor i de novo syntese af S-adenosylmethionin, der deltager i methylering af CpG-øer. RFC er den vigtigste indfaldsvej for THF og øget RFC ekspression ville derfor føre til akkumulering af den methylerede reduceret folat [11], [15], som i sidste ende kan føre til inaktivering af forskellige tumorsuppressorgener som; p16, p15 og /eller p53 [34], [35].

Desuden er baseret på vores nuværende resultater, RFC overekspression indebærer, at urothelial blære karcinomer ville være uløseligt mere følsomme over for antifolater mens ikke-urothelial karcinomer ville vise en mindre gunstig reaktion på antifolat kemoterapi. Denne spekulation kan forklare, hvorfor MVAC regime udviser kun begrænset antitumoraktivitet mod ikke-overgangsperiode celle kræft, mens responsrater op til -70% blev rapporteret i TCC i samme undersøgelse [9].

Vores resultater viser, at RFC mRNA forøget ekspression er ikke forbundet med tumorklassificering eller stadiet implicere, at øget ekspression af RFC-mRNA synes at ske tidligt i processen af ​​multi-step tumorprogression. Denne hypotese understøttes yderligere af konsekvent RFC mRNA udtryk stigning blandt de forskellige aldersgrupper i vores undersøgelse. Imidlertid er det blevet rapporteret, at kun -15% af de lav kvalitet overfladiske tumorer vil fortsætte med at infiltrere muskulaturen, og at høj kvalitet muskel-invasive tumorer, enten stammer fra flad carcinoma in situ (CIS) /svær dysplasi eller udspringer

de novo

[29]. Følgelig kunne en alternativ hypotese, at forøget RFC mRNA ekspression forekommer som en konsekvens af uafhængige hændelser mellem de forskellige typer af blærecarcinomer. Interessant, alle ikke-urothelial tumorbiopsier udnyttes i denne undersøgelse var muskel-invasiv peger på de ugunstige diagnostiske funktioner i ikke-urothelial tumorer som allerede foreslået af Erdemir

et al.

[19]. Den kliniske betydning af pladedifferentiering synes at være en negativ prognostisk funktion på grund af dets associering med højkvalitets invasive tumorer.

Selvom en signifikant forskel blev påvist mellem RFC ekspressionsniveauer i bilharzial- og ikke-bilharzial-associeret blærekræft kan denne konklusion ikke være afgørende, da kun 7 sager (18% af det samlede) af bilharzial-associeret blærekræft indgik i denne undersøgelse (jf 32 ikke-bilharzial-associeret tilfælde). Yderligere, jo højere niveau af RFC mRNA-ekspression i BA-TCC (2 enheder)

versus

SCC eller blandede typer (5 prøver) kan også betyde, at RFC forøget mRNA-ekspression er faktisk uafhængig af bilharzial infektion.

Værd at nævne (da dette understøtter relevant tekst) er, at egenskaberne ved de blærekræft prøver anvendes i denne undersøgelse var repræsentative for blærekræft patienters befolkning med hensyn til køn, alder og histologiske typer. Forholdet mellem female:male patienter var ~1:3. Gennemsnitsalderen for alle blærecancerpatienter inkluderet i undersøgelsen var 60, hvor den gennemsnitlige alder af de ikke-urothelial grupper var lavere end den for de urothelial blærecarcinom patienter (53

vs.

60), der angiver den aggressive arten af ​​de ikke-urothelial varianter af blærecancer. Desuden 64% af patienterne havde urothelial carcinomer, mens kun 24% præsenteret med de ikke-urothelial varianter. Disse demografiske data var i overensstemmelse med skiftende mønster af blærekræft i Egypten tidligere rapporteret af Felix

et al.

I 2008 [5], således, fremhæver fremkomsten og udbredelsen af ​​overgangsperioden celletype og tilbagetrækning af ikke-urothelial typer.

Sammenfattende kan RFC udtryk betragtes som et tveægget våben (Figur 2). Øget RFC udtryk vil fremme kemosensitivitet til antifolater mens, udvide intracellulær folat pool størrelse; hvilket kan føre til erhvervet resistens. Denne opfattelse understøttes yderligere af det fund, at tabet af folat eksportører førte til modstand mod antifolater gennem en udvidelse af folat pool størrelse [21]. Især i blære karcinom, Rady

et al.

, (Upublicerede resultater) rapporterede, at BCRP (eksport mono-, di- og triglutamates af folater) udtryk blev nedsat, mens MRP3, som har begrænset evne til at eksportere kun monoglutamate folater, viste sig at være overudtrykt [udgivet værk af Rady et al. 2009]. Desuden MRP3 var signifikant højere i urotelial forhold til den ikke-urotelial blærecarcinom variant [udgivet værk af Rady et al. 2009]. Disse variationer i ekspressionsniveauerne af antifolater efflux og tilstrømning pumper indebærer, at udnyttelsen af ​​et panel af genetiske biomarkører for hver tumor type kan være mere passende til at definere respons på kemoterapi i stedet for en enkelt uafhængig genetisk markør.

A afbilder den foreslåede tveægget rolle RFC i kræft kemoterapi. Forøget ekspression er prædiktive for antifolater (MTX) transport. Samtidig vil øget ekspression af RFC føre til folat pool størrelse ekspansion tvinge en negativ feedback hæmning på optagelsen af ​​antifolater.

Konklusioner og fremtidige Kørselsvejledning

Den foreliggende undersøgelse var forpligtet sig til at undersøge ændringer i RFC udtryk blandt de forskellige varianter af blære karcinom. RFC mRNA-ekspression viste sig at være typen-afhængige, men stage- og klasse-uafhængig. Selvom differentiering mellem urotelial og ikke-urothelial blære karcinomer kan gøres ved mikroskopisk undersøgelse, ville vores ultimative mål være at integrere molekylær diagnostik til klinisk praksis. Prospektiv evaluering af et panel af folat transportører (lignende; RFC, BCRP, og MRP3), kan forudsige respons på antifolat terapi, foreslå nye terapeutiske strategier og dermed forbedre resultatet behandling for individuelle blærecancerpatienter. De beskrevne mellem urothelial og ikke-urothelial karcinomer i blæren forskelle kan afspejle forskellige ætiologier og /eller risikofaktorer. En større undersøgelse designet til at give korrelationer af omfanget af RFC methylering med klinisk-patologiske karakteristika såsom alder, køn, histologisk kvalitet, scene, og progression kunne give yderligere nyttige oplysninger om ætiologien af ​​RFC ændrede niveauer af ekspression blandt forskellige typer af blære kræftformer. Andre kendte DNA methylering mål i blæren kan også være inkluderet for at se effekten af ​​højere udtryk for RFC og højere folat transport på DNA methylering.

Støtte Information

Figur S1.

RNA Quality Assessment. Agarosegelelektroforese samlet RNA minipreps. Prøver ‘baner er mærket i henhold til deres kodenummeret for dem efter indsamlingen. Observation skarpe bands i 28S rRNA (4,8 kb) og 18S rRNA (1,8 kb) var indikationen for intakt RNA (T82, T65, S22 og T38). S22 og S38 indeholde spor af genomisk DNA, men de RFC og β-actin-primere blev designet til at spænde over exon /intron junction at minimere genomisk DNA-amplifikation. T118 udviste delvis nedbrydning men de 28S og 18S bands var meget svag; det totale RNA udbytte på T118 var kun 2 ug. T 107 udviste nedbrudt RNA og blev udelukket fra yderligere analyse. RNA (pile) og DNA størrelsesmarkører (1031-1080 bp) blev inkluderet til sammenligning. Dette billede blev fotograferet ved hjælp UVIsoft erhvervelse billede-system (Tokyo, Japan)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0021820.s001

(TIF)

Figur S2.

Melting Curve Analyser. Smeltekurveanalyse for demonstration af primere ‘specificitet. Panel A: Dye fluorescens falder hurtigt når DNA smelter. Smeltepunktet defineres som vendepunktet af smeltekurven, som er lettest bestemmes som den maksimale benægtende 1. afledede af smeltekurven. Dissociation kurverne for både målet (RFC) og reference (ACTB) gener er vist. Hvert produkt viser en enkelt skarp top indikerer specificiteten af ​​primerparrene og fravær af primer-dimerer eller ikke-specifikke amplifikationsprodukter. NTC har enten ikke optage en Ct-værdi eller optagede Ct-værdier i området mellem (35-38), der afviger mere end 5cycles fra højeste Ct værdi, der registreres af prøverne (ikke vist). De flade kurver af ROX passive farvestof indikerer ingen spiking (ikke vist). Panel B: Agarose gel elektroforese af konventionel PCR produkt under anvendelse af revers transkriberet cDNA af en tumorprøve (T42) og revers transkriberet cDNA af kalibratoren (kommercielt tilgængelig, normal blære RNA, Clonetech). Enkelte bands de korrekte størrelser for RFC og henvisningen gen angiver specificiteten af ​​produkterne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0021820.s002

(TIF)

tabel S1. Salg Kliniske karakteristika blærecancerpatienter.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021820.s003

(XLS)

Tak

Vi værdsætter meget støtte fra Prof. Ashraf Zaghloul og Dr. Ahmed Moustafa af National cancer Institute, i at levere de blærekræft patientprøver. Vi takker Prof Raid Amin, direktør for UWF statistiske Consulting Services, for hans hjælp med den statistiske analyse af resultaterne. Prof. Stephen Bustin og Prof. Sanaa Eissa bidrog gennem mange frugtbare diskussioner, og uddybede mange aspekter af RT-qPCR. Vi er også taknemmelige for Shady Saad og Deena Amr for deres hjælp med oprettelse af de metoder og eksperimentelle design af undersøgelsen.