PLoS ONE: en konserveret vævsspecifikke homeodomæne-Less isoform af MEIS1 nedreguleres i kolorektal cancer

Abstrakt

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige kræftformer i udviklede nationer og er resultatet af både miljømæssige og genetiske faktorer. Mange af de genetiske læsioner observeret i kolorektal cancer ændre udtryk for homeobox gener, der koder for homeodomænet transkriptionsfaktorer.

MEIS1

homeobox genet er kendt for at være involveret i flere blodkræftsygdomme som solide tumorer og nye oplysninger tyder på, at ekspressionen af ​​

MEIS1

udskrift ændres i kolorektal cancer. Trods dette potentiale forbindelse, er lidt kendt om den rolle af genet i tarmene. Vi probed murine gastrointestinale vævsprøver med en N-terminal Meis1 antistof, afslører ekspression af to tidligere beskrevne isoformer, samt to hidtil ukendte Meis1 produkter. En 32 kD Meis1 produkt blev udtrykt i kerner af ikke-epiteliale celler i maven og tyktarmen, mens en 27 kD produkt blev udtrykt i cytoplasmaet af epitelceller i den proximale colon. Vore data antyder, at de 27 kD og 32 kD Meis1 proteiner er begge former af Meis1d protein, et homeodomæne-mindre isoform hvis transkript blev tidligere identificeret i cDNA skærme. Både

MEIS1D

udskrift og protein blev udtrykt i human colon mucosa. Ekspression af MEIS1D protein blev nedreguleret i 83% (10/12) af primære kolorektale cancer prøver sammenlignet med matchede normal slimhinde, hvilket indikerer, at MEIS1D er en biomarkør for kolorektal tumorigenese. Den reducerede ekspression af MEIS1D i colontumorer antyder også, at denne konserverede homeodomæne-mindre isoform kan virke som en tumorsuppressor i human colorectal cancer

Henvisning:. Crist RC, Roth JJ, Waldman SA, Buchberg AM (2011) en bevaret vævsspecifikke homeodomæne-Less isoform af MEIS1 nedreguleres i kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (8): e23665. doi: 10,1371 /journal.pone.0023665

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Maj 20, 2011; Accepteret: 22 Juli 2011; Udgivet: 17 August, 2011

Copyright: © 2011 Crist et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [T32-CA09678 til RCC, T32-CA09683 til JJR] og National Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller tilberedning af dette manuskript

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tyktarms kræft tegner sig for ca. 10% af både kræft diagnoser og dødelighed i USA (www.cancer.org). Dødeligheden er faldet i de foregående to årtier, primært som følge af højere niveauer af overholdelse af anbefalede koloskopi screeninger samt forbedret effektivitet af terapeutiske muligheder [1]; dog kolorektal cancer har stadig den næsthøjeste dødelighed forekomst i USA, efterfølgende kun lungekræft. Ligesom mange former for kræft, tyktarmskræft har både miljømæssige og genetiske komponenter [2], [3], [4]. Både sporadiske og arvelige former af sygdommen er forbundet med en ophobning af multiple genetiske læsioner [5], [6], hvilket kan resultere i nedsatte niveauer af apoptose [7], tab af cellecyklusregulering [8], og konstitutiv aktivering af

WNT

signalvejen [9]. Som regulatorer af nedstrøms transkriptionelle aktivering, er transkriptionsfaktorer ofte dysreguleret i kolorektal cancer [10], [11].

homeobox gener koder for proteiner med DNA-bindende domæner kendt som homeodomains. Disse homeodomæneproteiner fungerer som transkriptionsfaktorer, bindende promotorområder og aktivere transkription [12].

HOX

gen familiemedlemmer er de prototypiske homeobox gener.

HOX

gener er involveret i embryonisk segmentering og mønsterdannelse samt udviklingen af ​​talrige organsystemer, herunder mavetarmkanalen [12]. Udviklingsmæssige gener ofte ektopisk udtrykt under carcinogenese [13] og flere

HOX

gener er blevet knyttet til kolorektal cancer.

HOXB6

,

HOXB8

,

HOXC8

,

HOXC9

, og

HOXD13

er overudtrykt i både kolorektale cancer cellelinjer og primære kolon tumorer [14], [15], [16].

HOXB13

imidlertid udtrykkes normalt i kolonmucosa men nedreguleres i tumorvæv [10]. Deregulering af ikke

HOX

homeobox gener er også blevet observeret i kolorektale karcinomer.

CDX1

CDX2

er nedreguleres under kolorektal carcinogenese [17], [18], mens afvigende

PROX1

udtryk i tyktarmen medfører øget dysplasi [19].

homeodomæne transkriptionsfaktorer ofte binder promotorområder som enten homodimere eller heterodimere komplekser [20]. Denne dimerisering giver øget specificitet transkriptionel aktivering [21]. Den MEIS1 homeodomænet protein er et kendt bindingspartner af flere andre homeodomæneproteiner, herunder HOXA7, HoxA9, og PBX1 [22].

MEIS1

spiller en rolle i den normale udvikling af en hæmatopoietisk linje og overudtrykkes i en undergruppe af akutte myeloide leukæmier [23]. Øget

MEIS1

udtryk er også blevet observeret i neuroblastomer og ekspressionsniveauet af

MEIS1

resultatoversigt er et prognostisk indikator i brystkræft [24]. Nedregulering af alt

MEIS1

udskrift blev observeret i kolorektale adenomer, hvilket tyder på en rolle for

MEIS1

i tarm tumorigenese [25].

På grund af forbindelserne mellem homeobox gener og kolorektal cancer, undersøgte vi status Meis1 i tyktarmen. I denne undersøgelse beskriver vi to nye Meis1 produkter udtrykt i murine mavetarmkanalen. Disse to proteiner udtrykkes i forskellige celletyper og subcellulære afsnit. Begge proteiner er oversat fra den

Meis1d

afskrift, en homeodomæne-mindre splejsning variant af

Meis1

.

MEIS1D

, den humane homolog af

Meis1d

, blev identificeret i normalt humant colon væv på både mRNA og protein niveau. Desuden vi observere nedregulering af

MEIS1D

udtryk i humane kolorektal kræft. Disse data tyder på, at

MEIS1D

er en roman suppressor af kolorektal tumorigenese og et potentielt terapeutisk mål for tyktarmskræft.

Materialer og metoder

Mus koloni

C57BL /6J (B6) mus blev opnået fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Musene blev opretholdt i AALAC-akkrediterede TJU dyr facilitet. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen, 343C, blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Thomas Jefferson University, tilladelsens nummer A3085-01.

retroviral infektion

HCT116 celler blev opnået fra American Type Culture Collection (katalog nr. CCL-247), hvor den uændrede cellelinjen blev bekræftet ved STR-analyse. MSCV-

Meis1d

MSCV-

Neo

plasmider blev transficeret i Phoenix celler ved hjælp af profection calciumphosphat kit (Promega, Madison, WI). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 24 timer til dannelse af viral medier. Viral medier blev tilsat til HCT116-celler i seks-brønds plader og centrifugeret ved 1.800 rpm i 45 minutter. Cellerne blev derefter inkuberet ved 32 ° C i 3 timer blev den virale mediet fjernet, og nye virale medier blev tilsat. Cellerne blev centrifugeret igen ved 1800 rpm i 45 minutter og inkuberet ved 32 ° C i 3 timer mere. Viral medium blev erstattet med DMEM, og cellerne blev flyttet til 37 ° C i 48-72 timer for at tillade translation af den indsatte sekvens.

Western blot-analyse Salg

B6 mus på 120 dage gamle blev aflivet af CO

2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation. Vævs- og celleprøver blev vasket i 1 x PBS og homogeniseret i lysepuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4; 150 mM NaCI; 2 mM EDTA; 10% glycerol; 1% Triton-X-100) med proteaseinhibitorer (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteinkoncentration blev kvantificeret under anvendelse af Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). 20 pg af hver prøve blev separeret ved SDS-PAGE (10% acrylamid) og overført til nitrocellulosemembraner. Membraner blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i 1 × TBST (20 mM Tris-HCI, pH 7,4; 150 mM NaCI; 0,05% Tween 20). Primære antistoffer blev anvendt natten over ved 4 ° C: Meis1-N; Meis1d-C; GAPDH (Abcam, Cambridge, MA); actin, histon H1, og cytokeratin 18 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Vector Laboratories, Berlingame, CA) blev anvendt ved en 1:2500 fortynding i 1 time ved stuetemperatur. Proteiner blev visualiseret ved hjælp SuperSignal kemiluminescerende substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Subcellulær fraktionering

væv og celleprøver blev vasket i 1 × PBS og homogeniseret i lysis buffer (10 mM Tris HCI, pH 7,4, 5 mM MgC

2; 1 mM DTT, 1 mM PMSF) med proteasehæmmere (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Lysater blev derefter ledt gennem en 25½g nål og centrifugeret ved 600 x g ved 4 ° C i 10 minutter. Supernatanten blev mærket den cytoplasmatiske fraktion. Pelleten blev resuspenderet i lysepuffer og mærket den nukleare fraktion.

epitelcelle isolering

proximale og distale colon prøver blev skåret i 1 mm brede strimler. Prøverne blev inkuberet i 1 × PBS med 0,15% DTT i 30 minutter ved stuetemperatur med konstant omrøring ved omrørerstav for at fjerne slim. Mucosale strimler og omrører blev vasket i 1 x PBS og derefter inkuberet i 1 × PBS med 1 mM EDTA, pH 7,2 omrøring i 60 minutter ved stuetemperatur for at fjerne epitelceller. EDTA-opløsningen blev opsamlet og centrifugeret ved 470 x g i 5 min. Resterende væv blev inkuberet i EDTA-opløsningen for at fjerne resterende epitelceller og derefter homogeniseret i lyseringspuffer som beskrevet ovenfor. Epitel pellet blev resuspenderet i RPMI 1640 og inkuberet med collagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 50 enheder /ml i 30 min ved 37 ° C, vortexbehandling forsigtigt hvert femte minut. Prøver blev centrifugeret ved 200 x g i 5 min. Pelleten blev resuspenderet i 1 × PBS, centrifugeret igen og resuspenderet i RPMI. Den RPMI cellesuspension blev overlejret på en Percoll /PBS-blanding 50%. Percoll-gradient blev centrifugeret ved 470 x g i 20 min. Epitelceller blev udtaget fra toppen af ​​gradienten, fortyndet med RPMI, og centrifugeret ved 830 x g i 5 min. Cellepelleten blev resuspenderet i RPMI og igen centrifugeret ved 470 x g i 5 min. Den endelige cellepellet blev homogeniseret i western blot-lysepuffer anvendelse af en 25½g nål.

RT-PCR

Vævsprøver blev homogeniseret i 1 ml TRI Reagent Solution (Ambion, Inc, Austin, TX) og centrifugeret ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. 200 pi chloroform blev tilsat. Prøverne blev blandet i 15 sekunder, inkuberes ved stuetemperatur i 3 minutter og centrifugeret ved 12.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Det øverste lag blev blandet med 500 pi 2-propanol, inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter og centrifugeret ved 12.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. RNA-pelleten blev vasket med 75% ethanol og centrifugeret ved 7.500 x g i 5 min. RNA’et blev derefter lufttørret og resuspenderet i DEPC-behandlet vand. SuperScript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) blev anvendt til at danne cDNA. Alle Meis1 udskrifter blev opformeret i murine prøver, mens MEIS1D-specifikke primere blev anvendt i humane prøver.

Immunhistokemi

Væv blev fikseret i Formalde-Fresh 10% bufferet formalin løsning (Fisher Scientific) natten over ved 4 ° C og opbevaret i 70% EtOH. Faste væv blev indlejret i paraffin og væv blev skåret og monteret på objektglas ved KCC Translationel Research Core Facility. Væv blev deparaffineret hjælp citratbuffer, pH 6,0 (Vector Laboratories, Berlingame, CA) og farvet med Meis1-N antistof natten over ved 4 ° C. Anti-kanin sekundært antistof (Vector Laboratories, Burlingame, CA) blev anvendt ved en 1:200 fortynding i 1 time ved 37 ° C efterfulgt af ABC Linker Kit (Vector Laboratories, Berlingame, CA) i 30 minutter ved 37 ° C. Prøver blev udviklet ved anvendelse af DAB Peroxidase Substrat Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Farvning blev visualiseret på et Nikon Eclipse E600 mikroskop ved enten 4 × eller 20 × forstørrelse.

Etik

Patienterne blev givet samtykke ved hjælp af en skriftlig kirurgisk samtykkeerklæring, hvori det hedder affaldet fra kirurgi ville blive brugt til forskningsformål. Alle prøverne blev opnået ved Thomas Jefferson University Hospital. Thomas Jefferson University Institutional Review Board (IRB) undtaget denne undersøgelse fra anmeldelse, fordi de anses for at undersøgelsen ikke udgjorde mennesker forskning og frafaldes behovet for samtykke skyldes det faktum, at prøverne modtagne blev kodet til at fjerne identifikation.

Resultater

To nye Meis1 isoformer er til stede i det murine mavetarmkanalen

Selvom nedregulering af

MEIS1

i human kolorektal cancer er for nylig blevet observeret, rolle af genet i gastrointestinale (GI) homeostase og tumorigenese er dårligt forstået. For at bestemme ekspressionen af ​​murine Meis1 isoformer i mavetarmkanalen, blev et Western blot udført på C57BL /6J (B6) GI lysater under anvendelse af et polyklonalt antistof rettet mod den N-terminale ende af Meis1 (Meis1-N). Produkter fra 43 kD og 51 kD blev observeret i de fleste prøver (figur 1A). Disse molekylvægte svarer til de kendte størrelser af to tidligere beskrevne isoformer, Meis1a og Meis1b hhv. To yderligere bånd blev observeret i nogle af prøverne: a ~32 kD protein til stede i maven og tyktarmen og en ~27 kD protein udtrykt i den proksimale colon og cecum (figur 1a). Den ~27 kD vare er den samme som den forudsagte vægt for Meis1d, en anden Meis1 isoform. Udskriften for

Meis1d

er tidligere identificeret under skærme af murine cDNA [26], [27]. Isoformen mangler alle exon 8, hvilket resulterer i en præmatur stopkodon i exon 9 og en teoretisk trunkeret proteinprodukt (figur 1c, d). Eksistensen af ​​en

in vivo

proteinprodukt har dog aldrig blevet bekræftet.

A) Western blot analyse af B6 gastrointestinale lysater ved hjælp af Meis1-N antistof. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. PSI, MSI, og DSI angiver lysater fra den proksimale, midterste og distale tyndtarmen hhv. PC og DC angiver lysater fra den proximale og distale koloner. B) Amplifikation af

Meis1

isoformer fra B6 proximal colon-cDNA under anvendelse af RT-PCR. Diagrammer over C) udskrifter og D) produkter fra Meis1a, Meis1b, og Meis1d isoformer er inkluderet. Placeringerne af de to Meinox domæner (M1 og M2) og homeodomænet (HD) er mærket.

Meis1d, en afkortet Meis1 isoform, udtrykkes i murine coecum og proksimale colon

Hvis 27 kD Meis1 produkt er Meis1d, derefter på

Meis1d

afskrift bør kunne påvises i den proksimale colon. For at afgøre, om

Meis1d

udskrift er til stede,

Meis1

splejsning varianter blev amplificeret fra B6 proksimale colon cDNA prøver ved hjælp af RT-PCR. Primere blev designet til at forstærke tværs exon 8, idet der skelnes

Meis1d

fra fuld længde isoformer,

Meis1a

og

Meis1b

. PCR-reaktionen amplificerede produkter på ca. 758 og 904 bp i længde, den forudsagte størrelse af produkter fra

Meis1d

og

Meis1a /b

udskrifter (figur 1b). Størrelsen Forskellen mellem de to produkter svarer til den kendte længde af exon 8 (146 bp), hvilket antyder, at det mindre produkt mangler denne exon. Ekstraktion og sekventering af det mindre PCR-produkt bekræftede fraværet af exon 8 fra PCR-produktet (data ikke vist), hvilket viser tilstedeværelsen af ​​

Meis1d

transkript i murine proksimale colon.

Removal af exon 8 fra

Meis1d

transkript forårsager et rammeskift i exon 9. resultatet af denne rammeskift er produktion af trunkeret proteinprodukt med fem hidtil ukendte aminosyrer på C-terminalen (fig 1d). Da disse rester ikke er til stede på fuld længde Meis1 isoformer, blev en brugerdefineret antistof rettet mod unik epitop (Meis1d-C), der genereres. For at bestemme om den tilpassede antistof genkender ~27 kD Meis1 produkt blev kolon lysater fra B6 mus probet med antistofferne Meis1d-C og Meis1-N. Proksimale colon og distale colon lysater blev anvendt som positive og negative kontroller, henholdsvis. Som forventet Meis1-N antistof hentede tidligere identificerede ~27 kD bånd i den proksimale colon, men ikke den distale colon (figur 2a). Det samme ekspressionsmønster blev observeret i prøverne probet med Meis1d-C-antistof, hvilket viser, at Meis1d-C-antistof detekterer ~27 kD Meis1 produkt og indikerer, at produktet er Meis1d (figur 2a). For at bestemme den rumlige ekspressionsmønster af Meis1d proteinet, blev lysater fra et panel af B6 organer probet med Meis1d-C-antistof. Meis1d ekspression var begrænset til coecum og proximale colon (figur 2b, c).

A) Western blot-analyse af B6 proximale og distale colon lysater med Meis1-N og Meis1d-C-antistoffer. Positionerne af Meis1, Meis1b, og de to nye Meis1 produkter mærkes. B) og C) Lysater fra et panel af B6 organer blev probet med Meis1d-C-antistof. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.

posttranslationel modifikation af Meis1d korrelerer med subcellulære lokalisering

homeodomæne-mindre isoformer af andre homeodomæneproteiner har vist sig at fungere gennem to mekanismer. Homeodomænet-mindre proteiner kan sekvestrere fuld længde isoformer i cytoplasmaet gennem dominant negative interaktioner. Homeodomæne-mindre isoformer kan også fungere som nukleare bindingspartnere for andre transkriptionsfaktorer, ændring af aktivering af downstream målgener. Derfor kan den subcellulære lokalisering af Meis1d indikere den funktionelle rolle af isoformen i tyktarmen. For at bestemme den subcellulære lokalisering af Meis1d blev B6 proksimale colon lysater adskilt i nukleare og cytoplasmiske fraktioner og probet med Meis1-N antistof. Som forventet, fuld længde Meis1 var til stede i den nukleare fraktion (figur 3a). Den 32 kD Meis1 produkt var også til stede i kernen. Den 27 kD Meis1d protein imidlertid blev kun observeret i den cytoplasmatiske fraktion (figur 3a). Disse lokalisering data indikerer, at Meis1d ikke handler som en transskription faktor eller sekvestrering fuld længde Meis1 udenfor kernen, hvilket tyder på, at isoformen har nye cytoplasmatiske funktioner.

A) B6 proksimale colon prøver blev adskilt i nukleare og cytoplasmatiske fraktioner og probet med Meis1-N antistof. Histon H1 blev anvendt til at bekræfte den subcellulære fraktionering. B) Western blot-analyse af B6 proksimal kolon og HCT116 celler, der udtrykker Meis1d ORF under anvendelse af Meis1-N antistof. C) HCT116 celler blev retroviralt inficeret med Meis1d ORF eller en tom MSCV vektor. Celler blev taget 72 timer efter infektion, fraktionerede og probet med Meis1-N antistof. Positionerne af Meis1a, nuklear Meis1d (Meis1d

32), og cytoplasmatisk Meis1d (Meis1d

27) er mærket i givet fald.

For at undersøge effekten af ​​

Meis1d

ekspression

in vitro

, den åbne læseramme (ORF) af

Meis1d

blev retroviralt inficeret ind i HCT116 coloncancercellelinie. Western blot analyse af cellelysater afslørede tilstedeværelsen af ​​et 32 ​​kD protein, der blev detekteret af Meis1-N antistof, men ikke Meis1d-C-antistof (figur 3b). Dette

in vitro

Meis1d produkt er ~ 5 kD større end den forventede 27 kD-protein forudsagt af Meis1d transkriptet og observeret

in vivo

(figur 3b). Imidlertid molekylvægten matcher det hidtil ukendte 32 kD Meis1 isoform tidligere observeret i B6 mave og kolon lysater (figur 1a). Molekylvægten af ​​

in vitro

Meis1d blev bekræftet i både murine 3T3 og simian COS-1-celler, hvilket indikerer, at den forøgede størrelse er ikke cellelinie specifikke (data ikke vist). Posttranslationel modifikation af

in vitro

Meis1d produkt kan være årsagen til den øgede molekylvægt, samt manglende evne til Meis1d-C antistof til at detektere proteinet.

I modsætning de 27 kD Meis1d produkt, er den 32 kD Meis1 isoform lokaliseret til kernen i den proximale colon. For at bestemme om

in vitro

Meis1d også lokaliseret til kernen, HCT116 celler, der udtrykker Meis1d blev fraktioneret. De 32 kD

in vitro

Meis1d produkt var til stede i de nukleare lysater, den gentog den

in vivo

subcellulære lokalisering af romanen 32 kD isoform (figur 3c). Disse data tyder på, at både de 27 kD og 32 kD Meis1 isoformer observeret i murine mavetarmkanalen oversættes fra

Meis1d

udskrift. Det cytoplasmatiske formular (Meis1d

27) er den forudsagte molekylvægt på Meis1d, mens den nukleare formen (Meis1d

32) er større, mest sandsynligt på grund af posttranslationel modifikation.

Nuclear og cytoplasmatisk Meis1d er gensidigt udelukkende i colon

tyktarmen består af et enkelt lag af epitelceller, der dækker lamina propria og flere muskellag. Colon cancer stammer fra stamceller placeret i epitellaget [28]. For at bestemme om enten Meis1d

27 eller Meis1d

32 udtrykkes i tyktarmsepitelet, epiteliale celler blev isoleret fra B6 proksimale og distale colon prøver. Lysater fra de isolerede epitelceller og lamina propria /muskellag blev probet med Meis1-N antistof. Den Meis1d

27-protein blev udelukkende udtrykt i epitelcellerne af den proximale colon (figur 4a). Meis1d

32 dog blev udtrykt i lamina propria /muskellag fra både den proksimale og den distale colon (figur 4a). Den fulde længde Meis1 isoformer, Meis1a og Meis1b, var også til stede i kun lamina propria /muskel prøver (figur 4a). Disse data indikerer, at de nukleare og cytoplasmiske former af Meis1d ikke er til stede i de samme cellepopulationer i det murine colon. Desuden Meis1d

27 udtrykkes i colon epitelceller i fravær af fuld længde Meis1. For yderligere at bekræfte epitelcelle ekspression af Meis1d

27, B6 colon prøver blev farvet med Meis1-N antistof. Stærk cytoplasmatisk farvning blev observeret i epitelet af den proximale colon, men ikke den distale colon (figur 4b). Dette ekspressionsmønster rekapitulerer ekspressionen af ​​Meis1d

27, hvilket igen antyder, at Meis1d

27 er til stede i de epiteliale celler af den proximale colon.

A) B6 proksimal og distal colon prøver blev separeret i epitel og ikke-epiteliale fraktioner. De ikke-epiteliale fraktioner består af lamina propria og muskellag i colon. Fraktionerne og helcellelysater fra begge kolon segmenter blev probet med Meis1-N antistof. Cos-1-celler, der udtrykker Meis1d blev anvendt til at sammenligne

in vitro

og

in vivo

molekylvægte på Meis1d

32. B) B6 proksimale og distale colon prøver blev farvet med Meis1-N antistof. Farvning blev visualiseret på 20 × forstørrelse.

Ekspression af MEIS1D protein nedreguleres i humane kolorektal kræft

Meis1 er højt konserverede i eukaryoter og fjernelse af exon 8 fra det menneskelige MEIS1 mRNA ville kode for et forventet proteinprodukt med 99% homologi til murint Meis1d. Baseret på den evolutionære bevarelse af Meis1, vi har forsøgt at karakterisere ekspressionen af ​​MEIS1D i colon hos mennesket. En western blot blev udført på humane kolon lysater ved hjælp af Meis1-N antistof. Et bånd den forudsagte størrelse af MEIS1D

27 blev observeret i human colon prøver (figur 5b). For at bekræfte ekspressionen af ​​MEIS1D transkriptet, blev RT-PCR udført på human colon-cDNA (figur 5a). Et 758 bp band blev forstærket, hvilket indikerer, at

MEIS1D

mRNA transskriberes i menneskets tyktarm.

A) RT-PCR-amplifikation af

MEIS1D

udskrift fra menneskelige kolon cDNA. B) Western blot-analyse af lysater fra humane colorektale tumorer (T) og matchet normal mucosa (N) under anvendelse af Meis1-N antistof. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Prøver repræsenterer alle fire sektioner af human colon:. Opstigende, tværgående, faldende, og sigmoid

Ekspression af fuldlængde MEIS1 vides at blive dysreguleret i flere faste tumorer [29], [30]. For at bestemme status for MEIS1 i kolorektal cancer, blev western blots udført på matchet normal colon og primære kolorektale tumorlysater vha Meis1-N antistof. MEIS1A og MEIS1B blev udtrykt i både tumor og normale prøver, mens MEIS1D

32 var ikke til stede i enten sæt af prøver (data ikke vist). Men 83% (10/12) af normale colon mucosa prøver udtrykte detekterbare niveauer af MEIS1D

27-protein (figur 5b). Ekspression blev reduceret eller helt tabt i alle matchede tumorprøver fra disse patienter (figur 5b). De resterende to patienter udtrykte detekterbare niveauer af MEIS1D

27 i både normal slimhinde og tumorvæv (figur 5b). Disse

in vivo

data viser, at MEIS1D

27 udtryk nedreguleres under tarm tumorigenese.

Diskussion

Alternativ splejsning er kendt for at producere to

Meis1

isoformer,

Meis1a

og

Meis1b

, i både mus og mennesker. Både Meis1a og Meis1b proteiner er fuld længde, der indeholder de to Meinox domæner involveret i protein-protein interaktioner og DNA-bindende homeodomæne (figur 2d). Proteinprodukterne af disse splejsningsvarianter afviger i C-terminalen, på grund af splejsning ud af exon 12 fra

Meis1b

kodende sekventering (fig 2c, d). Tyder på, at de to tilsvarende isoformer kan aktivere transkription af forskellige delmængder af gener [31]. Skærme af cDNA-biblioteker indikerer, at en lang række yderligere alternativt splejsede transkripter fremstilles fra

Meis1

locus [26], [27], [32]. I modsætning til

Meis1a

og

Meis1b

dog proteiner til andre

Der er ikke observeret Meis1

udskrifter

in vivo

. Derfor er det fortsat uklart, om disse udskrifter er funktionelt relevante eller blot artefakter genereret af forkert alternativ splejsning.

I dette papir, har vi beskrevet to proteinprodukter af

Meis1d

splejsning variant, en isoform tidligere identificeret i cDNA skærme.

Meis1d

transkript mangler exon 8, hvilket resulterer i et forudsagt 27 kD protein, der mangler homeodomænet (figur 2c, d). Dette 27 kD produkt blev observeret i cytoplasmaet i proximale colon epithelceller (fig 3a, 4a). Et andet, 32 kD Meis1d produkt forekommer i kerner af ikke-epiteliale celler i maven og tyktarmen (3a, 4a). De cytoplasmatiske og nukleare former for Meis1d er blevet navngivet Meis1d

27 og Meis1d henholdsvis

32,. Den større molekylvægt og nuklear lokalisering af Meis1d

32-protein kun delvis i celler transficeret med

Meis1d

ORF (figur 3b). Ekspression af MEIS1D

27 i human colon prøver blev også observeret, hvilket viser evolutionære bevarelse af denne hidtil ukendte isoform (figur 5).

Meis1d

er kun den tredje

Meis1

isoform for hvilken en oversat proteinprodukt er blevet bekræftet, og er også den første homeodomænet-mindre Meis1 produkt observeret i enten mus eller humane væv.

homeodomæne-mindre isoformer er blevet beskrevet til mange homeobox gener, herunder adskillige medlemmer af Hox familien. Kun få af disse isoformer, dog er blevet identificeret i fortælling superfamilie gener, en gruppe, herunder Meis1. Tabet af homeodomænet forhindrer direkte binding til DNA målsekvenser og normal transkriptionel aktivering. Homeodomæne-mindre isoformer af TALE transkriptionsfaktorer har imidlertid tidligere vist at stadig regulere transkription gennem to forskellige mekanismer. De trunkerede isoformer kan have dominerende negative virkninger, udskille proteiner i fuld længde i cytoplasmaet og forebyggelse transkriptionel aktivering af downstream mål [33], [34]. Homeodomænet-mindre proteiner kan også interagere indirekte med DNA ved at binde andre transkriptionsfaktorer til at danne heterodimerer. Tilstedeværelsen af ​​de trunkerede proteiner ændrer DNA-bindende site af proteinkompleks, aktivere en distinkt delmængde af downstream mål [35].

Siden homeodomæne-mindre isoformer af beslægtede gener har distinkte mekanismer i cytoplasmaet og kernen, de subcellulære lokaliseringer af Meis1d og eventuelle potentielle bindingspartnere kan foreslå en cellulær funktion. I den foreliggende undersøgelse blev Meis1d observeret i enten kernen eller cytoplasmaet afhængigt celletype. Meis1d

27 udtrykkes i cytoplasmaet i proximale colon epithelceller (3, 4). Fuld længde isoformer er til stede i den nukleare fraktion af proksimale colon lysater, hvilket indikerer, at Meis1d

27 ikke sekvestrere andre Meis1 isoformer i cytoplasmaet (figur 3, 4). Yderligere beviser indikerer, at Meis1d

27 udtrykkes ikke i de samme celler som Meis1a eller Meis1b, forhindrer enhver form for dominant negativ interaktion (figur 4). Det cytoplasmatiske form af Meis1d kan stadig binde andre ukendte transkriptionsfaktorer og forhindre kernelokalisering. Det isoform kan også have en ny homeodomæne-uafhængig funktion relateret til transkriptionel aktivering.

Den potentielle funktion Meis1d

27 er uklart, fordi dataene ikke passer hverken kendt mekanisme homeodomæne-mindre fortælling proteiner. Proteinet kan ikke fungere som en dominant negativ, da det ikke er udtrykt i de samme celler som andre Meis1 isoformer. Meis1d

27 også kan ikke aktivere nedstrøms transkription inde i kernen, da proteinet er lokaliseret til cytoplasmaet. Den nukleare form af Meis1d, kan imidlertid stadig passe hver af disse mekanismer i lamina propria eller muskel omgiver colon. Det nukleare lokalisering af Meis1d

32 betyder proteinet kan fungere som en bindende partner for andre transkriptionsfaktorer. Meis1d

32 stadig fastholder motiverne er nødvendige for PBX interaktion og homodimerisering [36]. Disse data antyder, at den trunkerede isoform stadig kunne fungere som en co-faktor med disse andre homeodomæneproteiner. Den Meis1d

32 protein kan også fungere som dominant negative isoform inde i kernen, hvilket forhindrer association mellem fuld længde Meis1 proteiner og promotorområder i DNA’et. Yderligere dissektion af lamina propria og det underliggende muskel lag er nødvendigt for at afgøre, om Meis1d

32 og eventuelle bindende partnere udtrykkes i den samme population af celler. Identifikation af funktionelle roller for både Meis1d

32 og Meis1d

27 vil hjælpe med at forklare relevansen af ​​

Meis1

splejsning i tarmfunktionen og homeostase.

På trods af manglen på en defineret funktion vi har dokumenteret, at MEIS1D

27 nedreguleres i primære tarmkræft sammenlignet med normal slimhinde (figur 5b).