PLoS ONE: Genistein Øger epidermal vækstfaktor receptor signalering og Fremmer Tumor Progression i Advanced Menneskelig Prostata Cancer

Abstrakt

Genistein er en isoflavon findes i soja, og dens kemo-forebyggende og -therapeutic virkninger er blevet veletableret fra

in vitro

studier. For nylig, men dens terapeutiske virkninger

in vivo

er blevet afhørt på grund af modstridende rapporter fra dyreforsøg, der er afhængige af gnavere modeller eller implantation af cellelinier i dyr. At præcisere

in vivo Salg virkninger af genistein i avancerede prostatacancerpatienter, udviklede vi en patient-afledt prostatacancer xenograft model, hvor en klinisk prostatektomi prøve blev transplanteret ind immune deficiente mus. Vores resultater viste en øget lymfeknude (LN) og sekundære orgel metastaser i genistein-behandlede mus sammenlignet med ubehandlede kontroller. Interessant invasive maligne celler aggregeret til dannelse øer /mikrometastase kun i de sekundære organer i genistein-behandlede grupper, ikke i den ubehandlede kontrolgruppe. For at forstå den underliggende mekanisme for metastatisk progression undersøgte vi celleproliferation og apoptose på paraffin-sektioner. Immunologiske data viser, at tumorer af genistein-behandlede grupper flere prolifererende og færre apoptotiske cancerceller end hos den ubehandlede gruppe. Vores immunoblotting data antyder, at forøget proliferation og metastase er knyttet til forbedrede aktiviteter af tyrosinkinaser, EGFR og dens nedstrøms Src, i genistein-behandlede grupper. På trods af de kemoforebyggende virkninger foreslået af tidligere

in vitro

undersøgelser, kræft fremmende virkning af genistein observeret her antyder behovet for omhyggelig udvælgelse af patienter og sikrere planlægning af kliniske forsøg

Henvisning:. Nakamura H Wang Y, Kurita T, Adomat H, Cunha GR, Wang Y (2011) Genistein Øger epidermal vækstfaktor receptor signalering og Fremmer Tumor Progression i Advanced Menneskelig Prostata Cancer. PLoS ONE 6 (5): e20034. doi: 10,1371 /journal.pone.0020034

Redaktør: Robert Z. Qi, Hongkong Universitet for Videnskab og Teknologi, Hongkong

Modtaget: Februar 7, 2011; Accepteret: April 10, 2011; Udgivet: May 16, 2011

Copyright: © 2011 Nakamura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af den canadiske Institute of Health Research (MOP-86.730: YZW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret noncutaneous malignitet blandt nordamerikanske mænd [1]. I 2009 omkring 192, blev 280 nye tilfælde af prostatakræft diagnosticeret, og 27, blev der rapporteret 360 dødsfald i USA, ranking det næsthøjeste i dødeligheden efter lungekræft [2]. I forhold til USA, forekomsten og dødeligheden af ​​prostatakræft er betydeligt lavere i Asien [3], [4], [5]. Indvandring undersøgelser har vist, at asiater, der har vedtaget den vestlige kost efter indvandring til USA, havde en signifikant højere prostatakræft incidens end indfødte i de asiatiske lande [6], [7]. Blandt mange kosten forskelle mellem Nordamerika og Asien, er forskellen i soja forbrug er enestående. Det anslås, at asiater forbruge 20-50 gange flere soja-baserede fødevarer per indbygger sammenlignet med nordamerikanerne [8]. Tidligere epidemiologiske rapporter har indikeret en omvendt korrelation mellem soja forbrug og PCa risiko, hvilket tyder soja s kemoforebyggende virkninger [9]. Den primære aktive komponent i soja er en isoflavon kaldet genistein (4,5,7-trihydroxyisoflavone) [10], [11], [12], [13]. På grund af lignende molekylstruktur til estradiol, er genistein vides at udvise svag østrogen aktivitet ved binding til østrogenreceptoren (ER) og således modulere østrogen-regulerede gentranskription i målorganer [14], [15].

de anticancer effekter af genistein er blevet godt studeret

in vitro

og rapporteres i flere cancer cellelinjer, herunder leukæmi, lunge, prostata og bryst [16], [17], [18], [19]. Data fra tidligere undersøgelser viser, at genistein har et bredt spektrum af biologiske virkninger, som omfatter: induktion af celledifferentiering og apoptose [17], [18], [19], [20], inhibering af cellevækst [19], [21 ], [22], [23], [24], og ophævelsen af ​​signaltransduktionsveje [25], [26], [27]. Genistein dermed har tiltrukket en betydelig mængde opmærksomhed i kræftforskning især for sin hæmmende virkning på proteintyrosinkinase (PTK) aktiviteter, som er vigtige i celle overlevelse og spredning [25], [26], [27].

på trods af sådanne lovende

in vitro

anticancer data nylig

in vivo

undersøgelser har rapporteret modstridende resultater vedrørende genistein virkninger på metastaser. Undersøgelser under anvendelse af TRAMP og PC-3 dyremodeller har vist, at genistein uventet forøget metastase [28], [29], medens en anden undersøgelse ved anvendelse af et PC-3M

in vivo

model viste den modsatte virkning [30]. Disse rapporter i kombination med ufyldestgørende foreløbige resultater fra kliniske fase II-forsøg [31], [32], er der behov for nærmere undersøgelse af virkningerne af genistein

in vivo

hjælp modeller, der er mere klinisk relevante end andre konventionelle

in vivo

modeller, der er afhængige af brugen af ​​cellelinjer.

i vores undersøgelse har vi udnyttet en subrenal xenograft teknik ansætte en lav passage af patient-afledt PCA modellen i ikke-overvægtige diabetiske, svær kombineret immun-deficiente (NOD-SCID) mus. De menneskelige kræft xenografter trofast bevare histopatologiske og genoptypiske karakteristika oprindelige kliniske prøve [33], [34]. Ved hjælp af vores patient-afledt PCa xenograft-systemet, har vi fundet, at genistein på farmakologisk dosis øger celleproliferation, nedsætter apoptose og fremmer metastase i et avanceret humant PSA. Sådanne tumorfremmende effekter af genistein er forbundet med øget phosphorylering af EGFR og Src tyrosinkinaser.

Metoder

1. Materialer og dyr

LTL163a tumor linje (www.livingtumorlab.com) er afledt fra en prøve prostatacancer high-grade opnået fra en patient, og xenograft tumor transplantation linje blev udviklet fra denne kliniske vævsprøve som tidligere beskrevet [33], [34]. Skriftligt samtykke blev opnået fra patienten samt etik godkendelse fra University of British Columbia-British Columbia Cancer Agency Research Ethics Board (UBC BCCA REB), Vancouver, Canada. Animal pleje og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra det canadiske Råd Animal Care (CCAC), og brugen af ​​dyr til vores eksperimenter blev undersøgt og godkendt af Animal Care udvalg University of British Columbia (tilladelse #: A10 -0100).

Kort fortalt blev tumorvæv skåret ensartet i flere små stykker, 1 × 3 × 3 mm, og podet under nyrekapslen af ​​NOD-SCID hanmus, der var 6-8 uger gamle [33 ], [34]. To stykker af tumor pr nyre blev placeret under renal kapsel. Host-mus blev suppleret med testosteron pellets (10 mg /mus), der blev fremstillet med en Parr pillepresse (PARR Instrument Co., Moline, Illinois) og implanteres subkutant til fremme cellevækst. Transplantaterne blev dyrket i den renale site for 60~90 dage, høstes, og dele af transplantaterne blev fikseret til histopatologisk analyse. At udvikle en tumor transplantation linje blev høstet tumor transplantater udviser hurtig vækst skåret i små stykker og re-podet på nyren af ​​nye værter. Efter tre transplanterede generationer blev hævede lymfeknuder bemærket, som blev halveret og histologisk undersøgt for metastaser. Når metastaser blev bekræftet, frisk lymfeknude væv, som indeholder metastatiske aflejringer blev re-transplanteret på nyrerne til at udvikle en metastatisk tumor linje og betegnet LTL163a. ​​

2. Genistein behandling

For at undersøge de farmakologiske virkninger af genistein i metastase af human prostatacancer, vi valgte at bruge LTL163a metastatisk tumor linje, der blev afledt af 10

th transplantation generation. Tumorerne blev skåret i 1 × 3 × 3 mm stykker og podet i atten NOD-SCID hanmus med hver nyre har én tumor graft (2 grafts /mus). Testosteron pellets (10 mg) blev implanteret subkutant som beskrevet ovenfor i alle dyr på tidspunktet for podning at opretholde et passende serum testosteronniveau fordi genistein-behandling har vist sig at nedsætte serum testosteronniveau via hypothalamus /hypofyse /gonadale akse [35] . Syv dage efter transplantation blev dyrene tilfældigt opdelt i tre grupper; kontrol (ubehandlet), lavdosis og højdosis af genistein (renhed 99%, LC Laboratories, Woburn, MA). Mus i lavdosis gruppe fik genistein opløst i jordnøddeolie ved gavage ved 2 mg /dag (80 mg /kg legemsvægt /dag). Mus i højdosis gruppe blev givet 10 mg /dag (400 mg /kg /dag) af genistein. Kontrolmus modtog 0,1 ml kun olie-vehikel. Alle grupper blev fodret med samme gnaver kost (PicoLab Rodent Diet 20) og givet autoklaveret drikkevand. Genistein behandling blev påbegyndt én uge efter transplantation og fortsatte i tre uger. Transplantaterne blev dyrket på nyrerne for i alt 4 uger. Ved afslutningen af ​​4

th ugen, blodprøver og organer (nyre med tumor transplantater, lever, lunge, milt og lymfeknuder), blev opsamlet til analyserne.

3. Måling af serum genistein niveauer

LC-MS (væskekromatografi-massespektrometri) blev anvendt til at måle serumniveau af genistein. Først blev frosne serumprøver optøet på is, og 5 pi 1 ug /ml luteolin i ethanol blev tilsat til 25 pi serum som en intern standard (IS). Ekstraktionen blev udført ved hvirvelbehandling med 80 pi acetonitril og 5 pi 0,2 M HCI. Ekstrakten blev klaret ved centrifugering i 5 minutter ved 20.000 x g, og supernatanten opsamlet, fortyndet 1:01 med destilleret vand og centrifugeres i yderligere 5 minutter. De resulterende supernatanter blev analyseret. En Acquity UPLC med en 2,1 x 100 mm BEH 1,7 uM C18-søjle koblet til en PDA detektor i overensstemmelse med en Quattro Premier XE (Waters, Milford, MA) blev anvendt med vand og acetonitril indeholdende 0,1% myresyre som mobile faser. En 25-100% acetonitril gradient fra 0,2-2,0 minutter blev brugt, efterfulgt af re-ækvilibrering til start betingelser for en samlet køretid på 4,5 min. MS blev kørt ved enhed opløsning med 3 kV kapillar, 120 ° C og 350 ° C kilde- og desolvatisering temperaturer, 50 og 1000 l /time kegle og desolvatisering N

2 gasstrømme og Ar kollision gas indstillet til 5.0e

-3 mbar. M /z 287 89 og 287 153 blev anvendt til at detektere luteolin IS, og m /z 271 91 og 271 153 blev brugt til genistein med kegle spænding og kollisionsenergier optimeret til hver. OD data fra 210-600 nm blev opsamlet med PDA detektor og OD260 blev også brugt som et slutpunkt. En 5 point lineær kalibreringskurve fra 1-800 ng /ml med 218 ng /ml blev anvendt til kvantificering (R2 0,99; skævhed 10%). Genistein-glucoronid blev antaget at være den mest almindelige form for konjugat, og niveauerne blev anslået fra OD260 data med den antagelse, at ekstinktionskoefficienten svarer til den for genistein.

4. Histopatologi og immunhistokemi

Høstede tumor transplantater blev skåret i halve på det tykkeste sted af tumoren. Den ene halvdel blev fikseret i 10% neutral bufferet formalin til histologisk /immunhistologisk (IHC) analyser. Den anden halvdel var lynfrosset til proteinanalyse. Den faste væv blev behandlet til paraffin og indlejret med midterlinjen skærefladen nedad i paraffin blok, så sektioner begyndte på det oprindelige snit midterlinjen overflade. Fremstilling af paraffinindlejrede væv og IHC analyser blev udført som tidligere beskrevet [34]. De primære antistoffer anvendt i denne undersøgelse er Ki67 (Dako, Carpinteria, CA), caspase-3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ERa (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og ERp (Biogenex Laboratories, San Ramon , CA). Alle vævssnit var counter-farvet med 5% (w /v) Harris hematoxylin og dækglas med Permount (Fisher /Thermo Scientific, Waltham, MA).

5. Lokale invasion og metastase analyser

For at undersøge metastatisk forekomst, lunge, lever, nyre, pancreas, lænde og thorax lymfeknuder blev indsamlet fra hver mus. Hvert af disse organer blev fikseret og forarbejdet som ovenfor for IHC analyse. Snit blev farvet med et anti-humant specifikt mitokondrier antistof (Millipore, Billerica, MA) og screenet for tilstedeværelse af metastatiske celler. Billeder af IHC-farvede sektioner fra hvert organ blev taget med en AxioCam HR CCD monteret på en Axioplan 2 mikroskop og Axiovision 3.1 software (Carl Zeiss, Toronto, ON), med afsluttende forstørrelser af × 400. Procentdele af dyr, der indeholder humane metastatiske celler i enten lumbale eller thorax lymfeknuder blev beregnet. (I nyre- og pancreas lymfeknuder, alle dyr i tre grupper viste tegn på humane cancerceller, uanset behandling således udeladt i beregningen.) For lunge og lever, blev antallet af positivt farvede celler tælles inden tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter pr eksemplar .

6. Celleproliferation og apoptose analyser

Proliferation index (PI) blev vurderet ved IHC under anvendelse af en human specifik proliferation markering, Ki67. Billeder af IHC-farvede snit fra hvert transplantat blev fanget som ovenfor. Midtersektionen af ​​transplantatet med de mest tætbefolkede humane cancerceller blev udvalgt til billeddannelse til alle tumorer. Antallet af Ki67 positive og negative-humane celler blev talt inden for hele mikroskopisk felt for hvert transplantat af alle dyr og gennemsnittet beregnes. Baseret på den gennemsnitlige celletal for hver behandlingsgruppe, blev PI beregnes som følger:. PI (%) = (Ki67 positive celletal /total menneskelig celletælling) × 100

Ligeledes Apoptotisk Index (AI) var beregnet ud fra spaltede-caspase-3 farvede IHC dele af tumor transplantater. Antallet af apoptotiske celler pr 10.000 humane celler blev talt for hver tumor transplantat og gennemsnittet beregnes. AI blev beregnet som ovenfor.

7. Western blot-analyse

De resterende halvdele af de høstede tumorvæv var lynfrosset til proteinanalyse, hvorfra muse nyrevæv blev fjernet kirurgisk under anvendelse af et dissektionsmikroskop inden frysning. Disse frosne væv blev homogeniseret under anvendelse af en morter og støder i NP-40 lysispuffer (150 mM natriumchlorid, 1,0% NP40, og 50 mM Tris-HCI pH 8,0) på is, centrifugeret ved 12.000 rpm i 20 minutter ved 4 grader Celsius i en mikrocentrifuge, og supernatanten blev opsamlet. Den bicinchoninsyre (BCA) assay (Thermo Scientific, Waltham, MA) blev udført i overensstemmelse med virksomhedens anvisninger for at måle protein koncentration for hver tumor prøve, og absorbansen blev målt ved 562 nm. For gelelektroforese blev proteinprøver kogt i 5 minutter, og 20 ug protein blev separeret på SDS-PAGE (polyacrylamidgelelektroforese) gel og elektrooverført til en PVDF-membran. Membranen blev blokeret med 5% bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) eller 5% fedtfri mælk i Tris saltvand (pH 7,4) indeholdende 0,1% Tween 20 (TBST) og inkuberet med primære antistoffer mod alfa actin, phospho (p) -tyrosin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), total EGFR, p-EGFR (tyr1068), p-Src (tyr416) ​​og total Src (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Efter primære antistof inkubation blev membranerne vasket med TBST og probet med passende HRP-konjugeret sekundært anti-muse (Pierce, Rockford, IL) eller anti-kanin (Fisher /Thermo Scientific, Waltham, MA) antistoffer. For at detektere proteiner af interesse, blev en forøget kemiluminescens vestlige Blotting kit bruges (Pierce, Rockford, IL).

8. Statistisk analyse

Metastatisk Forekomst, sammenligning af serumniveauer, PI og AI blev vurderet ved hjælp af en to-halet uparret Students

t

-test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, hvis

s

værdier var mindre end 0,05.

Resultater

Serum niveau af genistein

For at sikre, at genistein-behandlede grupper fik en farmakologisk dosis af forbindelsen, serumkoncentrationen af ​​genistein blev målt ved hjælp af høj-performance liquid schromatografi massespektrometri (HPLC-MS). Vores HPLC-MS-analyse viste, at den ubehandlede kontrolgruppe havde en meget lav spor af serum genistein (0,002 ug /ml), hvis mest sandsynlige kilde er deres chow (PicoLab Rodent Diet 20, Delta, BC). Til sammenligning lavdosis og højdosis behandlede dyr havde 1,30 ug /ml til 6,63 ug /ml fri genistein hhv. I vores behandlede mus, indtages genistein dannet glucuronidkonjugater, og kun en lille del af genistein forblev som frie aglyconer i blodet. Niveauerne af både gratis og konjugerede genistein var signifikant højere i lav (

s

0,04) og høj dosis-behandlede mus (

s

0,0006) end i kontrolgruppen (figur 1).

til behandling blev seks dyr i lav dosis gruppe givet genistein opløst i jordnøddeolie ved gavage ved 2 mg /dag (80 mg /kg legemsvægt /dag). Seks mus i højdosis gruppe blev givet 10 mg /dag (400 mg /kg /dag) af genistein. Fem kontrol mus (en døde før behandlingens afslutning) modtog 0,1 ml køretøj alene. Blod blev opsamlet ved slutningen af ​​den 3-ugers behandling.

Kolonner

:. Betyde serumkoncentration af genistein ± SD

Tumor vækst i patient-afledt PCa xenograft efter genistein behandling

Effekter af genistein på metastaser af avancerede menneske PCa blev undersøgt ved hjælp af vores patient-afledte PCa xenograft tumor transplantation linje, LTL163a, som blev udviklet fra en prostatektomi prøve af fremskredent stadium og udvalgt til metastatisk aktivitet. Tumorer fra 10

th transplantation generation af LTL163a tumor linje blev skåret i ensartet størrelse stykker (1 × 3 × 3 mm) og dyrket under nyre kapsler (en tumor stykke /nyre, to tumor transplantater /mus) af atten mandlig NOD SCID-mus suppleret med en 10 mg subkutan testosteron pellet. Syv dage efter podning blev de værtsdyr tilfældigt placeret i tre behandlingsgrupper; ubehandlet kontrol, lavdosis og højdosis genistein. Oral administration af genistein eller olie (til kontrolgruppen) blev fortsat i tre uger. På tidspunktet for høst blev forstørrede nyrer med godt dyrkede tumorer kendt for alle tre grupper. Den gennemsnitlige mængde af tumorer til kontrol, lav-dosis og høj-dosis grupper er; 650 mm

3, 655 mm

3 og 670 mm

3. Trods stigende tumorvolumen tendens til genistein behandling, var der ingen statistisk signifikans mellem grupperne. Ud over den opadgående ekspansive tumorvækst fra nyren overflade, tumorer fra alle tre grupper invaderede lokalt ind i nyren (data ikke vist).

Genistein fremmer lymfeknude og sekundære organ metastase

for at vurdere den fjerne spredning af tumorceller, har vi samlet pancreas, thorax, lænde- og renale lymfeknuder samt indre organer. Alle grupper viste tegn på menneskelige kræftceller i nyre- og pancreas lymfeknuder uanset behandling (data ikke vist). Men i lændehvirvelsøjlen og thorax knudepunkter, kontrolgruppe havde ingen eller lav forekomst af metastase (0% i lændehvirvelsøjlen og 17% i thorax). I modsætning hertil udviste både lavt og højt doser genistein behandlinger højere metastatisk forekomst i disse to knudepunkter i sammenligning med den ubehandlede kontrolgruppe (figur 2a); (17% for lav dosis og 50% for høj dosis i lændehvirvelsøjlen node. 50% for lav dosis og 83% for høj dosis i thorax node). Ligeledes er antallet af metastatiske cancerceller i sekundære organer såsom lunge og lever var signifikant højere i genistein-behandlede grupper end kontrol (figur 2b). Selv om der blev observeret spredte cancerceller i sekundære organer i alle mus (figur 2c), viste kun genistein-behandlede mus aggregering af cancerceller ( 75 celleaggregater) i disse organer til dannelse øer /mikrometastase som vist i figur 2d. Således ved flere kriterier, genistein havde en dosisafhængig metastase fremmende virkning på LN og sekundære organer i vores model.

På tidspunktet for høst, lunge, lever og fire lymfeknuder herunder nyre-, pancreas, lænde og thorax knuder blev indsamlet fra alle dyr. Hvert af disse organer blev fikseret, behandlet, farvet med et anti-humant specifikt mitokondrier antistof og screenet for tilstedeværelse af humane metastatiske celler. Billeder af IHC-farvede sektioner fra hvert organ blev taget med en AxioCam HR CCD monteret på en Axioplan 2 mikroskop med endelige forstørrelser af × 400. a) Procentdele af dyr, der indeholder humane metastatiske celler i enten lumbale eller thorax lymfeknuder blev beregnet. I nyre- og pancreas lymfeknuder, alle dyr i alle tre grupper viste tegn på humane cancerceller, uanset behandling (data ikke vist) således udeladt i beregningen. Imidlertid viste genistein-behandlede grupper øget forekomst af metastase i lændehvirvelsøjlen og thorax knudepunkter sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe. Den metastatisk spredning i lumbal og thorax lymfeknuder præsenteres som gennemsnit procent i mus, der bærer LTL163A tumor transplantater fra tre grupper (ubehandlede-kontrol, lav-dosis og højdosis genistein).

Sort søjle: metastatisk forekomst af thorax lymfeknude. Hvid søjle: metastatisk forekomst af lændehvirvelsøjlen lymfeknude

. b) For lunge og lever, blev antallet af positivt farvede celler tælles inden tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter.

Kolonne

: gennemsnitligt antal invaderende cancerceller per mikroskopisk felt observeret i lunge og lever af de tre grupper ± SD. Resultater blev analyseret statistisk ved t-test på 95% konfidensintervallet. c) Ki67-IHC farvning af repræsentative dele af sekundære organer (lever og lunge) fra ubehandlet kontrol og genistein-behandlede mus. Ki67-antistof anvendes i denne undersøgelse er humant specifikt. Alle forstørrelser er × 400. d) Ki67-IHC farvning af leveren fra en genistein-behandlede dyr viser sammenlægning af invaderende cancerceller. Rød cirkel angiver en lille ø /mikrometastase fokus indeholdende 75 humane kræftceller, som blev kun observeret i genistein-behandlede mus. Forstørrelse er × 400.

Genistein påvirker celledeling og apoptose

Fordi vores data viste, at genistein fremmet udbredelsen af ​​humane kræftceller i musen værter, vi undersøgte dens virkninger på tumorceller spredning og apoptose. Immunhistokemi under anvendelse af en human-specifikt Ki67-antistof blev udført for at måle hastigheden af ​​tumorcelleproliferation. Resultatet viste stærk positiv intensitet inden tumor transplantater af alle grupper samt i lokalt invaderede region af muse nyre (data ikke vist). Proliferation index (PI) blev målt fra den midterste del af tumor graft område. Sammenligningen mellem grupper viste, at både lavt og højt dosisgrupper havde højere PI (77,3% og 86,1%, henholdsvis) end ubehandlede kontrol (70,0%), men kun i højdosis-gruppen var signifikant forskellig fra den ubehandlede kontrolgruppe (

p = 0,004

) som vist i figur 3.

proliferation index (PI) blev vurderet ved IHC under anvendelse af en human specifik proliferation markering, Ki67. Antallet af Ki67 positive og negative-humane celler blev talt inden for tilfældigt udvalgte mikroskopisk felt for hver tumor transplantat af alle dyr og gennemsnittet beregnes. Proliferation Index (%):. (Ki67 positive celletal /total menneskelig celletælling) × 100

Vi har også undersøgt, om genistein påvirket satser for programmeret celledød, apoptose. Immunohistokemisk analyse med et anti-caspase 3-antistof viste, at tumorer i genistein-behandlede mus havde færre caspase-3-positive celler end dem i kontrolgruppen (figur 4). Kontrolgruppen havde den højeste apoptotiske indeks (AI) på 0,18%, mens begge lavt og højt dosisgrupper havde en AI på kun 0,07% (

p = 0,05

: Figur 4a), hvilket indikerer en signifikant reduceret hastigheden af ​​celledød i genistein-behandlede tumorer.

Apoptotisk Index (AI) beregnedes fra caspase-3 farvede IHC afsnit af tumor transplantater fra alle mus. Antallet af apoptotiske celler pr 10.000 humane celler blev talt for hver tumor transplantat og gennemsnittet beregnes. a) Apoptotisk Index (%) = (caspase-3 positive celletal /total menneskelig celletælling) × 100. b) Caspase-3 immunhistologisk farvning af tumor transplantater fra ubehandlede og behandlede dyr. Røde pile angiver positive /apoptotiske celler. Alle forstørrelser er × 400. Indsat er et forstørret billede af positive celler.

Genistein øger phosphorylering af protein tyrosinkinaser

Forrige

in vitro

undersøgelser har vist, at genistein modulerer tyrosin signalveje ved ændrer kinase aktiviteter [25], [26], [27]. For at bestemme om forøget metastase observeret i genistein-behandlede mus var knyttet til ændrede phosphorylering mønstre, blev Western blot-analyse udført på tumorafledte proteinlysater anvendelse af et anti-phosphotyrosin-antistof. Immunoblotting viste, at genistein-behandlede tumorer havde højere phosphorylering på en 60 kDa proteinbånd i forhold til den ubehandlede kontrolgruppe. Interessant, ved længere eksponeringer af røntgenfilm, blev mere intenst bånd observerede mønster for højere molekylvægt proteiner i genistein-behandlede gruppe sammenlignet med kontrol (figur S1). Af særlig interesse var et bånd ved 170 kDa. Længere eksponering afslørede bånd i genistein-behandlede gruppe, mens ikke blev observeret nogen fosforylering i kontrolgruppen på denne særlige størrelse protein.

For at undersøge det nærmere, vi udført immunoblotting med antistoffer rettet mod specifikke tyrosinkinaser. De mulige kandidater til 60 kDa og 170 kDa-proteinerne (pile i figur 5 og figur S1) er Src og dens potentiale opstrøms molekyle, epidermal vækstfaktor receptor (EGFR). Som vist i figur 6a, genistein forøget total EGFR proteinekspression lidt sammenlignet med kontrolpatienter. Mens næsten alle ubehandlede kontroldyr tumorer (undtagen én) udviste meget lidt at ingen phosphorylering af dette protein, viste de fleste genistein-behandlede tumorer høj band-intensitet (figur 6a). Tilsvarende Src, et mål af EGFR, udviste svag opregulering af totalt protein ekspression sammenlignet med kontrolgruppen. Igen blev ingen phosphorylering af Src observeret i kontrolgruppen (undtagen én tumor ved en længere eksponering), mens der blev observeret en signifikant højere grad af phosphorylering i genistein-behandlede tumorprøver (figur 6b). Disse specifikke EGFR og Src immunoblot båndmønstre (figur 6) bekræfter de generelle p-tyrosin farvningsmønstre observeret tidligere (figur 5).

Efter tre ugers behandling af genistein, tumorer blev høstet, og protein blev ekstraheret fra seks genistein-behandlede og fem ubehandlede-kontrol mus (en af ​​de kontrolmusene døde under behandling). Western blot-analyse blev udført på tumorafledte proteinlysater for phosphotyrosin som beskrevet i Materialer og Metoder. Den samme blot blev farvet med et anti-alfa aktin antistof for at evaluere protein loading. Lanes repræsenterer proteiner fra individuelle tumorer.

a) Genistein øger phosphorylering af EGFR på tyrosin 1068 rest. Nedenfor er kvantificeringen af ​​bandet intensitet for phosphoryleret EGFR fra proteinlysater af 5 ubehandlet kontrol og 6 genistein-behandlede tumorer.

Kolonner

: betyder forholdet mellem phosphoryleret EGFR /total EGFR protein band intensitet ± SD. b) Genistein påvirker phosphorylering af Src ved tyrosin 416-rest. Aktiveret Src-ekspression er betydeligt højere i genistein-behandlede tumorer end i ubehandlet kontrol. Lanes repræsenterer proteiner fra individuelle tumorer.

Diskussion

Prostatakræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i Nordamerika. Siden indførelsen af ​​androgen ablation terapi af Huggins og Hodges i 1940’erne, er hormon manipulation blevet anvendt som det vigtigste behandling for avanceret PCa [36]. Trods indledende tumorregression efter hormonbehandling, kan nogle resterende PCA celler overleve denne terapi, erhverve androgen uafhængighed og blive hormon refraktær [37]. Når sygdommen skrider frem til hormonresistent tilstand, er der ingen effektiv behandling til rådighed [38]. Derfor har en betydelig indsats blevet investeret i strategier til behandling af fremskreden PSA. Tidligere

in vitro Salg undersøgelser har antydet, at genistein har kemoterapeutisk potentiale på hormonafhængige cancercellelinier. Men genistein s

in vivo

handlinger er for nylig blevet udfordret af modstridende rapporter [28], [29], [30], [39], [40], [41], [42]. For eksempel er en undersøgelse rapporterede, at genistein inhiberede PC3 knogle tumorvækst i SCID-mus [43], og en anden viser, at genistein faldt lunge metastase i androgen receptor-negative PC3-M implanterede mus, som blev fodret genistein-beriget foder [30]. I modsætning hertil Raffoul

et al.

Fandt, at genistein indtagelse fører til en stigning i lymfeknudemetastaser i deres PC3 implanteret dyremodel [29]. I 2009 Touny og Banerjee demonstrerede tofasede virkninger af genistein hjælp af TRAMP mus (transgene adenocarcinom mus prostata) model. Genistein hæmmede dårligt differentieret PCa i disse mus, når de indgår i deres kost før tumor initiering (dvs. når musene blev fodret genistein-diæt mellem 4~12 ugers alderen). Men hvis genistein-kost blev givet til de ældre TRAMP mus ved alderen 12~20 uger, når prostata intraepitelialneoplasi (PIN) allerede var til stede, det fremmet PCa progression og induceret lymfeknude metastaser [28]. Fra disse oplysninger, kan det være underforstået, at livsvarig moderat forbrug af (eller tidlig udsættelse for) genistein er vigtig i forebyggelsen af ​​sygdommen, men at genistein kan ikke udvise kemoterapeutiske effekt

in vivo

når PCa har allerede blevet etableret eller udviklet sig til et fremskredent stadium.

for at afklare det omstridte af genistein virkninger

in vivo

, vi udviklet en klinisk relevant xenograft model, der er genereret fra en patient prostatektomi eksemplar. Den resulterende patient-afledte prostatatumor linje anvendes i vores undersøgelse, LTL163a, er blevet passeret for kun 10 generationer i immun-deficiente mus og har fastholdt de oprindelige histopatologiske og genoptypiske karakteristika oprindelige prøvemateriale [33], [34]. Vores data viser, at både lave og høje doser genistein behandlinger fremmer metastase i denne avancerede menneske PCa transplantation linje. Selv tumorstørrelsen var ikke signifikant forskellig mellem kontrol- og genistein-behandlede grupper efter 3 ugers behandling, metastatisk forekomst var større i genistein-behandlet vs ubehandlede kontroller. Den metastatiske progression observeret i vores model var præget af øget celledeling og nedsat apoptose.