PLoS ONE: epitelcelle Transforming Sequence 2 i Human Oral Cancer

Abstrakt

Baggrund

epitelcelle omdanne sekvens 2 (ECT2) er en guanin nukleotid udveksling faktor for Rho familie GTPase, som har været impliceret i den maligne fænotype af humane cancere. Der vides kun lidt om virkningen af ​​et højt ECT2 i reguleringen oral cancercellelinie adfærd. I denne undersøgelse undersøgte vi inddragelse af ECT2 i mundtlig planocellulært karcinom (OSCC).

Metodologi /vigtigste resultater

Vi analyserede ECT2 ekspression i OSCC-afledte cellelinjer og primære OSCCs sammenlignet med matchet normalt væv (n = 96) af kvantitativ revers transkriptase-polymerasekædereaktion, Western blot, og immunhistokemi. Vi evaluerede derefter sammenhængen mellem ECT2 udtryk status i primære OSCCs og klinisk-patologiske træk. ECT2 udtryk var signifikant opreguleret i OSCCs

in vitro

in vivo

(

s

0,05). Blandt de kliniske variable analyseret, også højere ECT2 udtryk var forbundet med TNM stadie grading (

s

0,05). Da vi udførte funktionelle analyser af ECT2 i OSCC-afledte celler under anvendelse af shRNA systemet, faldt den cellulære proliferation af ECT2 knockdown celler betydeligt i forhold til kontrolcellerne (

s Restaurant 0,05). Cell cyklus analyse ved flowcytometri viste anholdelse af cellecyklusprogression ved G1 fase i ECT2 knockdown celler. Vi fandt også opregulering af Cip /Kip familie af cyclinafhængige kinase hæmmere, p21

CIP1 og p27

kip1 og nedregulering af cyklin D1, cyklin E, og CDK4. Disse data antydede, at den forhøjede Cip /Kip familie induceret hæmning af cyclin D1-CDK-kompleks aktivitet fører til standsning af cellecyklus ved G1 fasen.

Konklusioner /Signifikans

Vores resultater foreslået for første gang, at ECT2 er en indikator for celleproliferation i OSCCs og at ECT2 kunne være en potentiel terapeutisk mål for udviklingen af ​​nye behandlinger for OSCCs

Henvisning:. Iyoda M, Kasamatsu a, Ishigami T, Nakashima D, endo-Sakamoto Y, Ogawara K, et al. (2010) epitelcelle Transforming sekvens 2 i Human Oral Cancer. PLoS ONE 5 (11): e14082. doi: 10,1371 /journal.pone.0014082

Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: 18 juni 2010; Accepteret den 28. oktober 2010; Udgivet: November 29, 2010

Copyright: © 2010 Iyoda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en Grant-in-Aid Videnskabelig Forskning (nr 20.592.353) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Oral pladecellekræft (OSCC) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan, der tegner sig for 275.000 nye tilfælde og mere end 120.000 dødsfald om året [1]. Mange risikofaktorer er blevet identificeret, herunder tobak og alkohol brug [2], [3], [4]. Men nogle patienter udvikler OSCC uden risikofaktorer, tyder på, at vært modtagelighed spiller en vigtig rolle. Molekylære ændringer i en række onkogener og tumorsuppressorgener forbundet med udvikling af OSCC kunne være vigtige spor til at forebygge denne sygdom [4], [5].

Microarray teknologi har været nyttigt til at analysere ændringer i tusindvis af gener og identificere væsentlige mønstre. Vi har tidligere rapporteret genekspression profilering af OSCC at identificere cancerrelaterede gener [6]. Blandt generne, epitelcelle omdanne sekvens 2 (ECT2) var signifikant opreguleret i OSCC. ECT2 er en guanin nukleotid udveksling faktor (GEF) for Rho familie GTPase relateret til cytokinese [7], [8], [9], [10], [11]. GEFs katalyserer udvekslingen af ​​BNP for GTP, for derved at aktivere Rho GTPaser i signaltransduktion. ECT2 ekspression styres dynamisk under hele cellecyklen. Ved nedbrydning af kernemembranen under mitose, er ECT2 dispergeret hele cytoplasmaet, så ECT2 bliver lokaliseret til mitotiske spindler under metafase, spaltningen fure under telofase, og midten af ​​legemet i slutningen af ​​cytokinesen [8]. Rho GTPaser har været impliceret i den maligne fænotype af menneskelige kræftformer som følge af deres deltagelse i afvigende signalering i tumorceller [12], [13], [14], [15], [16], [17].

i den aktuelle undersøgelse blev ECT2 ofte overudtrykt i OSCC-afledte cellelinjer og primære OSCCs. Desuden viste en shRNA eksperiment, ECT2 nedregulering resulterede i nedsat cellulær proliferation ved cellecyklusstop G1 fasen. Derfor foreslog vi at ECT2 kunne være en biomarkør for spredning og potentiel terapeutisk mål for OSCCs.

Resultater

Evaluering af

ECT2

mRNA-ekspression i OSCC-afledte cellelinjer

for at undersøge mRNA udtryk for

ECT2

identificeret som en kræft-relateret gen af ​​vores microarray analyse [6], vi udførte kvantitativ revers transkriptase PCR (QRT-PCR) analyse ved hjælp seks OSCC-afledt celle linjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22, og SA3) og humane normale orale keratinocytter (HNOKs). mRNA ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH.

ECT2

mRNA var signifikant opreguleret i alle OSCC cellelinjer sammenlignet med HNOKs (figur 1A, *

s

0,05).

(A) Kvantificering af

ECT2

mRNA-niveauer i OSCC-afledte cellelinier ved QRT-PCR-analyse. For at bestemme mRNA udtryk for

ECT2

i Oral cancer, vi udførte QRT-PCR-analyse ved hjælp af seks OSCC-afledte cellelinier (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22, og SA3 ) og HNOKs. Væsentlige opregulering af

ECT2

mRNA ses i seks OSCC-afledte cellelinjer sammenlignet med i HNOKs. Data er udtrykt som gennemsnit ± SEM af værdier fra tre assays (*

s

0,05; Mann-Whitney

U

test). (B) Western blot-analyse af ECT2 protein i OSCC-afledte cellelinier og HNOKs. For at undersøge protein ekspression af ECT2 i Oral cancer, udførte vi western blot-analyse under anvendelse seks OSCC-afledte cellelinier (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22, og SA3) og HNOKs. ECT2 proteinekspression opreguleres i OSCC-afledte cellelinier sammenlignet med HNOKs. Densitometriske ECT2 protein data er normaliseret til a-tubulin proteinniveauer. Værdierne er udtrykt som en procentdel af de HNOKs.

Evaluering af ECT2 protein-ekspression i OSCC-afledte cellelinjer

Vi udførte Western blot-analyse for at undersøge ECT2 proteinekspression status i OSCC-afledte cellelinier og de HNOKs (figur 1b). Molekylvægten af ​​ECT2 var 112 kDa. En betydelig stigning i ECT2 proteinekspression blev observeret i alle OSCC cellelinjer sammenlignet med HNOKs. Expression analyse viste, at både transskription og oversættelse produkter af dette molekyle var stærkt udtrykt i OSCC-afledte cellelinjer.

Evaluering af ECT2 ekspression i primære OSCCs

Vi målte

ECT2

mRNA ekspressionsniveauer i primære OSCCs og parrede normale orale væv fra 96 ​​patienter. Svarende til data fra OSCC-afledte cellelinier, viste QRT-PCR-analyse, at

ECT2

mRNA-ekspression var opreguleret i 75 (78%) af 96 primære OSCCs forhold til de matchede normale orale væv. De relative mRNA ekspressionsniveauer i normale orale væv og primære OSCCs varierede fra 0,003 til 1,632 (median, 0,081) og 0,005 til 4,39 (median, 0,289), henholdsvis (figur 2,

s Restaurant 0,05).

for at undersøge

ECT2

mRNA ekspressionsniveauer i primære OSCCs og parrede normale orale væv fra 96 ​​patienter, vi udførte QRT-PCR-analyse. De relative mRNA ekspressionsniveauer i ubearbejdet OSCCs og den matchende orale væv (n = 96) i området fra 0,005 til 4,39 (median, 0,289) og fra 0,003 til 1,632 (median, 0,081), henholdsvis.

ECT2

mRNA-ekspression opreguleret i 75 (78%) af 96 primære OSCCs sammenlignet med matchede normale orale væv. Markant højere

ECT2

mRNA ekspression blev observeret i primære OSCCs end matchede normale orale væv (

P

0,05; Mann-Whitney

U

test).

Vi analyserede derefter ECT2 proteinekspression ved immunhistokemi (IHC). Repræsentative IHC resultater for ECT2 protein i normal oralt væv og primære OSCC er vist i figur 3A og B. Positiv immunreaktion for ECT2 blev påvist i kernen og cytoplasmaet. Stærke ECT2 immunreaktioner blev påvist i OSCCs, mens normale orale væv viste negativ immunfarvning. De ECT2 IHC snesevis af normale orale væv og OSCCs varierede fra 8,33 til 85,33 (median, 44.00), og 55,67 til 211,33 (median, 163,33), hhv. De ECT2 IHC scoringer i ubearbejdet OSCCs var væsentligt højere end i normale væv (figur 3C,

s

0,001). Korrelationerne mellem de clinicopathologic egenskaber ved patienter med OSCC og status for ECT2 proteinekspression under anvendelse af IHC scoringssystem er vist i tabel 1. Blandt de kliniske klassificeringer blev ECT2-positive OSCCs korreleret med tumorstørrelse (

s

= 0,043) og TNM stadieinddeling af OSCC (

s

= 0,044) (tabel 1).

(A, B) repræsentant IHC resultater af ECT2 i normal oral væv og primær OSCC. (A) Normal oralt væv har ingen ECT2 proteinekspression. Original forstørrelse, × 100. Målestokke 50 uM. (B) ECT2-positive tilfælde af OSCC. Positiv immunreaktion for ECT2 detekteres i kernen og cytoplasmaet. Original forstørrelse, × 400. Målestokke 10 um. (C) State of ECT2 proteinekspression i nomal oral væv og primær OSCC. For at undersøge protein udtryk for ECT2 i primære OSCCs, vi udført IHC. De ECT2 IHC score er beregnet som følger: IHC score = 1 × (række svage farvede celler på området) + 2 x (antal moderat farvede celler i marken) + 3 × (antal intenst farvede celler i felten) . De ECT2 IHC scorer for OSCCs og normale orale væv spænder fra 55,67 til 211,33 (median, 163,33), og 8,33 til 85,33 (median, 44.00), hhv. Den ECT2 proteinekspression niveau i OSCCs er betydeligt højere end i normale orale væv (

s

0,001; Mann-Whitney

U

test).

Etablering af ECT2 knockdown celler

for at opnå en stabil ECT2 knockdown transfektanter, brugte vi ECT2 shRNA (shECT2) plasmid og kontrollen shRNA (Mock) plasmid. For at vurdere ECT2 mRNA og proteinekspression i shECT2-transficerede celler, udførte vi QRT-PCR og Western blot-analyser. Figur 4A viser, at

ECT2

mRNA-ekspression i shECT2-transficerede celler var signifikant lavere end i Mock-transficerede celler. ECT2 proteinniveauer i shECT2-transficerede celler også faldet markant sammenlignet med Mock-transficerede celler (figur 4B). ECT2 protein ekspressionsniveauer var i overensstemmelse med mRNA-ekspression i transfektanterne.

For at opnå stabile ECT2 knockdown transfektanter udførte vi transfektion af ECT2 shRNA (shECT2) og kontrollen shRNA (Mock) i OSCC cellelinier (Sa3 og H1). Vi udførte QRT-PCR og Western blot-analyser for at undersøge ECT2 mRNA og proteinekspression i shECT2-transficerede celler. (A) Angivelse af

ECT2

mRNA i shECT2- og Mock-transficerede SA3 celler. (B) Western blot-analyse af ECT2 protein i shECT2- og Mock-transficerede celler. Den ECT2 mRNA og proteiner er betydeligt nedreguleret i shECT2-transfekterede celler.

Reduceret cellevækst i ECT2 knockdown celler

For at undersøge antiproliferative effekter i shECT2-transfekterede celler, cellulære væksten blev overvåget i 7 dage. De shECT2-transficerede celler viste et signifikant fald i cellulær vækst i forhold til Mock-transficerede celler (figur 5).

For at bestemme virkningen af ​​shECT2 på cellulær proliferation, shECT2- og Mock-transficerede celler blev podet i 6 Tja plader ved en tæthed på 1 x 10

4 levedygtige celler pr. shECT2- og Mock-transficerede celler tælles på 7 dage i træk. Væksten i shECT2-transfekterede celler hæmmes betydeligt i forhold til de Mock-transficerede celler efter 7 dage. Resultaterne er udtrykt som middel ± SEM af værdier fra tre assays. Stjernerne viser signifikante forskelle mellem Mock- og shECT2-transfekterede celler (

s

0,01; Mann-Whitney

U

test).

Knockdown af ECT2 fremmer cellecyklusstop

for at undersøge den mekanisme, hvorved ECT2 er relateret til cellecyklus, udførte vi FACS-analyse af shECT2-transficerede celler. Procentdelen af ​​G1-fasen i shECT2-transficerede celler var signifikant højere end i Mock-transficerede celler (figur 6A,

s Restaurant 0,05), hvilket antyder, at nedregulering af ECT2 inhiberede cellulær proliferation ved induktion af G1 arrestere. At identificere den mekanisme, ved hvilken ECT2 blokke G1 progression vurderede vi ekspressionsniveauet af cyclinafhængige kinaseinhibitorer (p16

INK4a, p21

CIP1, p27

kip1), cyclin D1, cyclin E og CDK4 (figur 6B). PCR-data viste opregulering af

p21

CIP1

og

p27

kip1

nedregulering af

cyklin D1

,

cyklin E

,

og CDK4

i shECT2-transficerede celler.

for at undersøge cellecyklusprogression, analyserede vi Flowcytometrisk bestemmelse af DNA-indhold ved en FACScalibur i G0-G1, S og, G2-M-faser. Vi derefter bestemmes ekspressionsniveauet af cyclinafhængige kinaseinhibitorer (p16

INK4a, p21

CIP1, og p27

kip1), cyclin D1, cyclin E og CDK4 at identificere den mekanisme, ved hvilken ECT2 blokke G1 progression. (A) Flowcytometrisk analyse blev udført for at undersøge cellecyklus i shECT2- og Mock-transficerede celler. Antallet af celler i G1 er steget markant i de ECT2 knockdown celler. (B) QRT-PCR blev udført for at undersøge mRNA-niveauer af cellecyklus beslægtede gener. PCR viser opregulering af

p21

CIP1

og

p27

kip1

nedregulering af

cyklin D1

,

cyklin E

,

og CDK4

. Data er udtrykt som gennemsnit ± SEM af værdier fra tre assays (*

s

0,05; Mann-Whitney

U

test).

Diskussion

Vores tidligere microarray data [6] viste signifikant opregulering af

ECT2

i OSCC-afledte cellelinjer. I nærværende undersøgelse blev ECT2 mRNA og protein stærkt udtrykt

in vitro

in vivo

i OSCC. Regional kopitallet af 3q26 stigninger i flere kræftformer, såsom hoved og hals, lunge, og livmoderhalsen [18], [19]. Denne region har cancerrelaterede gener (PRKC1 og Sox2) samt ECT2. Derfor vil genomisk ubalance være grunden til ECT2 overekspression i OSCC. De ECT2 protein ekspressionsniveauerne i ubearbejdet OSCCs blev korreleret med TNM stadie grading (tabel 1) (

s

0,05). Disse resultater antydede, at ECT2 har en vigtig rolle i OSCC udvikling og progression. Men lidt om mekanismen for ECT2 i OSCC progression. For at bestemme om ECT2 funktion er relevant for OSCC progression, udførte vi den shECT2 eksperiment og fandt, at cellulær proliferation faldt betydeligt som følge af standsning af cellecyklus ved G1 fasen i ECT2 knockdown-celler med opregulering af p21

CIP1 og p27

kip1 og nedregulering af cyclin D1, cyclin E og CDK4, hvilket indikerer, at ECT2 funktion nøje er relateret til OSCC progression.

GEFs, herunder ECT2, katalysere udveksling af BNP for GTP, for derved at aktivere de Rho GTPaser i signaltransduktion [7], [8], [9], [10], [11]. Aktiverede Rho GTPaser binde til og aktivere flere nedstrømseffektorer, hvilket fører til flere biologiske processer, såsom cellulær størrelse, cellecyklusprogression, apoptose, overlevelse, morfologi, cellulær polaritet, cellulær adhæsion, og membran handel [20], [21]. Opregulering af Rho GTPase aktivitet, ofte forbundet med tumorigenese [22], er blevet påvist i adskillige humane tumorer, herunder pancreascancer, brystcancer, melanoma, lungecancer, colorektal cancer, og gastrisk cancer [12], [23]. På den anden side, Rho GTPaser spille en vigtig rolle i fremme G1-S progression gennem modulering af cyclin og cyclinafhængige kinaseinhibitorer (CDKIs) [24], [25]. Yamamoto et al. rapporterede, at når Rho GTPase blev inhiberet af den

Clostridium botulinum

C3 toksin eller en dominant negativ mutant, blev G1-S cellecyklusprogression væsentligt forringet [26]. Den forringet aktivering af GTPaser er forbundet med konstitutivt forhøjede niveauer af p21

CIP1 og p27

kip1, forårsager celler til at akkumulere i G1 fasen [27], [28], [29], [30], [31 ], [32]. Vi spekulerede at ECT2 knockdown fører til forringet aktivering af Rho GTPase, og i overensstemmelse med det, vi fandt ikke kun opregulering af Cip /Kip familie (p21

CIP1 og p27

kip1), men også nedregulering af cyclin D1, cyclin E og CDK4, hvilket fører til standsning af cellecyklus ved G1 fasen, i ECT2 knockdown celler.

cyklin D1, cyclin E og CDK4 er også en kritisk regulator af G1 progression og G1-S overgang. Hæmning af cyklin D1, cyklin E, og CDK4 udtryk blokerer G1-S overgangen i cellecyklus [33], [34], [35], [36]. Cycliner D1-D3 og E familier og deres respektive kinase partnere, CDK4 /6 og CDK2, er ansvarlig for at regulere overgangen fra G1 til S-fasen. Aktiviteterne af cyklin-CDK komplekser moduleres af to typer CDKIs, Cip /Kip (p21

Cip1, p27

Kip1, og p57

Kip2) og INK4 (p15

INK4B, p16

INK4a, p18

INK4C, og p19

INK4D) familier, som begge regulerer cellecyklusprogression [37]. Medlemmer af Cip /Kip familie binder til cyklin-CDK-komplekser og hæmmer deres aktiviteter, hvilket fører til reduceret phosphoryleret retinoblastoma protein og G1 cellecyklusstop.

I konklusion, vores resultater viste, at ECT2 er overudtrykt hyppigt i OSCC . Desuden ECT2 knockdown hæmmede celleproliferation

in vitro

ved at arrestere cellecyklusprogression ved G1 fasen ved at modulere ekspressionen af ​​cellecyklus-relaterede molekyler, som i sidste ende fører til hæmning af cyklin D1-CDK kompleks aktivitet. Disse data antydede, at ECT2 spiller en vigtig rolle i OSCC celleproliferation. ECT2 udtryk vil sandsynligvis være en biomarkør for spredning og et potentielt terapeutisk mål for udvikling af lægemidler mod cancer i primære OSCCs.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle patienter forudsat informeret samtykke til en protokol revideret og godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelse Chiba University. De skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

OSCC-afledte cellelinier og vævsprøver

HSC-2, HSC-3, HSC-4, og Ca9-22 cellelinier, afledt fra menneskelige OSCCs, blev købt fra human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). H1 og SA3 cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af Dr. S. Fujita på Wakayama Medical University (Wakayama, Japan). Primære dyrkede HNOKs blev opnået fra tre raske donorer [38], [39]. Alle celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium /F-12 HAM (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Sigma) og 50 enheder /ml penicillin og streptomycin (Sigma).

Vævsprøver fra 96 ​​ubeslægtede japanske patienter med primær OSCC der blev behandlet på Chiba Universitetshospital blev opnået under kirurgisk resektion. De operativt fjernede væv blev delt i to dele, hvoraf den ene blev frosset straks og opbevares ved -80 ° C indtil RNA-isolering, og hvoraf det andet blev fikseret i 10% pufret formaldehydopløsning for patologisk diagnose og IHC. Histopatologisk analyse af væv blev udført i overensstemmelse med World Health Organization kriterier ved Patologisk Institut, Chiba Universitetshospital. Clinicopathologic iscenesættelse blev bestemt ved TNM klassifikationen af ​​Den Internationale Union mod Kræft. Alle patienter havde OSCC der var histologisk bekræftet, og tumor prøver blev kontrolleret for at sikre, at tumorvæv var til stede i mere end 90% af prøven.

Udarbejdelse af cDNA

Samlet RNA blev isoleret ved hjælp af Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev dannet fra 5 ug totalt RNA under anvendelse Ready-To-Go Du-Prime First-Strand Beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og oligo (dT) primer (Sigma Genosys, Ishikari, Japan), ifølge producentens instruktioner .

mRNA ekspressionsanalyse

Real-time QRT-PCR blev udført for at vurdere ekspressionsniveauerne af målgener (

ECT2

,

p16

INK4a

,

p21

CIP1

,

p27

kip1

,

cyklin D1

,

cyklin E

, og

CDK4

) i OSCC-afledte celler og primære OSCCs. QRT-PCR blev udført med en metode under anvendelse af en LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green 1 Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland). Følgende primere blev anvendt: ECT2, fremadrettet 5′-ATTTTCATGTCGCCCGTTGT-3 ‘og revers 5′-CCCATGTGATGGACCAATGTC-3’; p16

INK4a, frem 5′-CAGACATCCCCGATTGAAAGAAC-3 ‘og omvendt 5′-GGTAGTGGGGGAAGGCATATATCT-3’; p21

CIP1, frem 5′-CCCAGTTCATTGCACTTTGATTAGC-3’and omvendt 5′-CAGTCTAGGTGGAGAAACGGGAAC-3 ‘; p27

kip1, frem 5′-CCGGCTAACTCTGAGGACAC-3’and omvendt 5′-AGAAGAATCGTCGGTTGCAG-3 ‘; cyclin D1, frem 5′-GCATGTTCGTGGCCTCTAAGA-3’and omvendt 5’-CGGTGTAGATGCACAGCTTCTC-3 ‘; cyclin E, frem 5′-TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC-3’and omvendt 5’-TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC-3 ‘; CDK4, frem 5′-TGCAACACCTGTGGACATGTG-3’and omvendt 5’-ATTTTGCCCAACTGGTCGG-3 ‘. Amplificerede produkter blev analyseret ved 3% agarosegelelektroforese at fastslå størrelse og renhed. PCR reaktioner under anvendelse LightCycler apparat blev udført i et slutvolumen på 20 pi af en reaktionsblanding bestående af 2 pi FirstStart DNA Master SYBR Green I mix, 3 mM MgC

2, og l pM af primerne ifølge producentens anvisninger. Reaktionsblandingen blev anbragt i glas kapillarrør og underkastes en indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 45 runder af amplifikation ved 95 ° C (10 sek) til denaturering, 62 ° C (10 sek) til annealing, og 72 ° C (10 sek) for udvidelse, med en temperatur hældning på 20 ° C /sek. Udskriften beløb for målgener blev estimeret ud fra de respektive standard kurver og normaliseret til glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) (fremadrettet 5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’and omvendt 5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ‘) udskrift opgjorte beløb i tilsvarende prøver.

Protein ekstraktion

cellerne blev vasket to gange med kold phosphatpufret saltopløsning (PBS) og centrifugeret kortvarigt. Cellepellets blev inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter i en lysepuffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% w /v CHAPS, og 10 mM Tris pH 7,4) med proteinase inhibitor cocktail (Roche). Proteinkoncentrationen blev målt med BCA Protein Assay Kit (Thermo, Rockford, IL).

Western blot-analyse

Protein ekstrakter blev underkastet elektroforese på 4-12% Bis-Tris-gel, overført til nitrocellulose membraner (Invitrogen), og blokeret i 1 time ved stuetemperatur i Blokering One (Nacalai tesque, Kyoto, Japan). Membranerne blev vasket tre gange med 0,1% Tween 20 i Tris-bufret saltvand og inkuberet med 2 pg /ml affinitetsoprenset kanin-anti-humant ECT2 polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) natten over ved 4 ° C. Membranerne blev vasket igen og inkuberet med en 1:10,000 af gede anti-kanin IgG (H + L) HRP-konjugat (Promega, Madison, WI) som et sekundært antistof i 2 timer ved stuetemperatur. Endelig blev detekteret membranerne under anvendelse SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrat (Thermo) og immunoblotting blev visualiseret ved at udsætte membranerne til ATTO Light-Capture II (ATTO, Tokyo, Japan). Signal intensiteter blev kvantificeret ved hjælp af CS Analyzer version 3.0 software (ATTO).

transfektion

OSCC cellelinjer (SA-3 og H1) blev stabilt transfekteret med ECT2 shRNA (shECT2) eller kontrol shRNA (Mock) (Santa Cruz Biotechnology) konstruere af lipofectamin LTX og Plus Reagenser (Invitrogen). Efter transfektion af cellerne stabilt shECT2 blev isoleret ved dyrkningsmediet indeholdende 2 ug /ml puromycin (Invitrogen). 2-3 uger efter transfektion blev levedygtige kolonier samles op og overført til nye retter. shECT2- og Mock-transficerede celler blev anvendt til yderligere eksperimenter.

IHC

IHC af 4-um snit af paraffinindlejrede prøver blev udført under anvendelse af kanin-anti-ECT2 polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology ). Kort fortalt, efter afparaffinering og hydratisering, blev den endogene peroxidaseaktivitet standset ved 30-minutters inkubation i en blanding af 0,3% hydrogenperoxid-opløsning i 100% methanol, hvorefter snittene blev blokeret i 2 timer ved stuetemperatur med 1,5% blokerende serum ( Santa Cruz Biotechnology) i PBS før reaktion med anti-ECT2 antistof (1:100 fortynding) ved 4 ° C i et fugtigt kammer natten over. Efter inkubation med det primære antistof blev prøverne vasket tre gange i PBS og behandlet med Envision reagens (DAKO, Carpinteria, CA) efterfulgt af farveudvikling i 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAKO). Objektglassene blev derefter let modfarvet med hematoxylin, dehydreret med ethanol, renset med xylen og monteret. Ikke-specifik binding af et antistof til andre proteiner end antigenet undertiden forekommet. For at undgå ikke-specifik binding, blev et immuniserende peptid blokerer eksperiment udført. Som en negativ kontrol blev tredobbelte sektioner immunfarvet uden eksponering primære antistoffer, som bekræftede farvning specificitet. For at kvantificere staten ECT2 proteinekspression i disse komponenter, vi brugte IHC score systemer beskrevet tidligere [6], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45] , [46], [47]. Kort fortalt blev de farvede celler bestemmes i mindst fem tilfældige felter ved 400 ganges forstørrelse i hver sektion. Intensiteten af ​​ECT2 immunreaktion i cellen blev scoret som følger: 1+, svag; 2+, moderat; og 3+, intens. Celleantallet og farvningsintensitet blev derefter multipliceret til fremstilling af en ECT2 IHC score. Sager med en score på over 85,33 (den højeste score for normalt væv) blev defineret som ECT2-positive. To uafhængige patologer, som begge blev maskeret til patienternes kliniske status, gjorde disse domme.

Cellular spredning

For at undersøge effekten af ​​shECT2 på celleproliferation, shECT2- og Mock-transficeret celler blev podet i 6-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

4 levedygtige celler pr. Ved de angivne tidspunkter blev cellerne trypsinbehandlet og talt ved anvendelse af et hæmocytometer i tre eksemplarer.

Cellecyklusanalyse

For at bestemme cellecyklusfordeling, blev cellerne høstet, vasket med PBS, og probet med CycleTEST Plus DNA reagenskittet (Becton-Dickinson, San Jose, CA) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev cellerne koncentreret til 5,0 x 10

5 celler /ml blev centrifugeret ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Så tilføjede vi 250 pi af opløsning A (trypsin-buffer) til røret og forsigtigt blandet. Vi tillod trypsin at reagere i 10 minutter ved stuetemperatur. Dernæst har vi tilføjet 200 pi opløsning B (trypsininhibitor og RNase i en puffer) og forsigtigt blandes. Vi inkuberet med blandingen i 10 minutter ved stuetemperatur. Endelig har vi tilføjet 200 pi opløsning C (propidiumiodid farveopløsning). Og vi forsigtigt blandet som ovenfor og inkuberes i 10 minutter i mørke på is. Flowcytometrisk bestemmelse af DNA-indhold blev analyseret ved en FACScalibur (Becton-Dickinson). Fraktionerne af cellerne i G0-G1, S og G2-M-faser blev analyseret under anvendelse Flow Jo software (Tree Star, Ashland, OR).

Statistisk analyse

Den statistiske signifikans de ECT2 ekspressionsniveauer blev evalueret under anvendelse af Fishers eksakte test eller Mann-Whitney

U

test.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Dataene er udtrykt som gennemsnit ± SEM.

Tak

Vi takker Lynda C. Charters til redigering dette manuskript, og Drs. Hiroshi Nakajima og Hiroaki Takatori, Institut for Molekylær Genetik, Graduate School of Medicine, Chiba University, for nyttige diskussioner og kritisk gennemgang af manuskriptet.