PLoS ONE: Heat Shock Protein 60 overekspression er forbundet med Progression og Prognose i Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

Heat shock protein 60 (HSP60) er en chaperonin med væsentlige funktioner for celle fysiologi og overlevelse, og dens udtryk korrelerer med prognose i en række maligniteter. Formålet med denne undersøgelse er at bestemme forholdet af HSP60 status med klinisk-patologiske parametre og prognose i mavekræft.

Metoder

Niveauerne af HSP60 og matrix metallopeptidasen 9 (MMP-9) antigen var vurderet ved immunohistokemi i 223 gastriske carcinoma prøver. Sammenhængen mellem HSP60 og MMP-9, klinisk-patologiske parametre, og prognosen for mavekræft blev undersøgt.

Resultater

Niveauet af HSP60 protein blev signifikant associeret med dybde invasion, lymfeknude metastaser og scene af sygdom (alle

P

0,05). Både univariate og multivariate analyser afslørede, at HSP60 var en uafhængig prognostisk faktor for både samlet overlevelse (OS) og tilbagefald overlevelse (RFS) (begge

P

0,05). Endvidere blev HSP60 overekspression forbundet med en dårlig prognose hos patienter med fremskreden mavekræft i forskellige risikogrupper. Desuden HSP60 var signifikant korreleret med MMP-9 blandt 223 mavekræft væv (

P

0,001). Patienter, som havde HSP60 overekspression, hvor tumorceller viste høj invasiv, havde dårlig OS og kortere RFS.

Konklusion

HSP60 spiller en vigtig rolle på tumor aggressivitet og prognose, og kan fungere som en lovende mål for prognostisk forudsigelse

Henvisning:. Li Xs, Xu Q, Fu Xy, Luo Ws (2014) Heat Shock Protein 60 overekspression er forbundet med Progression og Prognose i Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (9): e107507. doi: 10,1371 /journal.pone.0107507

Redaktør: Francesco Cappello, University of Palermo, Italien

Modtaget: Juni 28, 2014, Accepteret: August 12, 2014; Udgivet 10. september, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inkluderet i papiret

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de førende årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan på grund af sin frekvens, dårlig prognose og begrænsede behandlingsmuligheder [1]. Fuldstændig resektion af tumoren og tilstødende lymfeknuder er den eneste effektive helbredende behandling [2]. Desværre, efter et komplet resektion, 5-års overlevelse er fortsat lav [3]. Flere undersøgelser har vist, at forskellige genetiske og epigenetiske ændringer er involveret i løbet af carcinogenese og progression af gastrisk cancer [4] – [6]. Men den molekylære mekanisme er involveret i udviklingen af ​​gastrisk cancer forbliver uklar.

Varmechokproteiner (HSP’er) er et sæt af evolutionært konserverede proteiner. HSP’er er blevet klassificeret i forskellige underfamilier baseret på deres molekylvægt [7] eller systematiske gen symboler [8]. I store træk i pattedyr, fire store familier af HSP’er anerkendes: HSP90 (HSP90α, HSP90β, GRP94), HSP70 (HSP70, hsc70, mHSP70, GRP78), HSP60 og små HSP’er (HSP27, aB-crystallin, HSP22). Ophobning af fejlfoldet protein i stressede celler, udløser udtryk for HSP’er, som forhindrer protein aggregering og letter genfoldning eller eliminering af fejlfoldede proteiner i deres egenskab af chaperones [9]. For nylig er det blevet rapporteret, at HSP’er er signifikant associeret med cancere [10].

HSP60 (også kaldet Cpn60) er hovedsagelig indeholdt i den mitokondriske matrix, selv om det også er blevet detekteret ved ekstra-mitokondriske sites [11 ]. HSP60 bistår foldningen af ​​mitokondrielle proteiner og letter proteolytisk nedbrydning af fejlfoldet eller denaturerede proteiner i en ATP-afhængig måde [12]. For nylig, er dens rolle og applikationer i menneskelig udvikling og ledelse af kræft i øjeblikket aktivt undersøgt, og resultaterne er meget opmuntrende [13]. HSP60 synes at have potentiale inden for diagnose, prognose, og forebyggelse og behandling af forskellige menneskelige kræftformer, herunder spiserøret pladecellekræft [14], bronkial carcinogenese [15], kolorektal cancer [16] og glioblastom [17]. Imidlertid forbliver den rolle HSP60 på prognosen af ​​patienter med gastrisk cancer, uklar.

I den foreliggende undersøgelse vurderede vi niveauet af HSP60 i gastrisk cancer væv ved immunohistokemi. Korrelationer af HSP60 status med klinisk-patologiske parametre og overlevelse mavecancerpatienter blev derefter analyseret. Desuden er det blevet rapporteret, at MMP-9 spiller en vigtig rolle i gastrisk cancer tilbagefald og prognose [18]. Derfor undersøgte vi også forholdet mellem HSP60 og MMP-9 protein i mavekræft.

Patienter og metoder

Patienter og Prøver

Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review bestyrelse og menneskelige etiske komité af tilknyttede Hospital i Guilin Medical University. Skriftligt samtykke til at bruge prøverne til forskningsformål blev opnået fra alle patienter før operation.

Gastric karcinom væv blev opnået fra gastrektomi eksemplarer af 223 patienter fra afdelingen for almen kirurgi, den Tilknyttede Hospital i Guilin Medical University ( Guilin, Kina). Alle operationer blev udført mellem januar 2005 og december 2008. Kriterierne for den aktuelle undersøgelse støtteberettigelse var som følger: (1) en patologisk undersøgelse, der bekræfter tilstedeværelsen af ​​mavekræft og erfaren radikal kirurgi, (2) komplette grundlæggende kliniske data, (3 ) der ikke foreligger nogen forudgående behandling for kræft, og (4) ingen alvorlige komplikationer eller anden malign sygdom. Der var 144 mænd og 79 kvinder (median alder, 58,0 år; sortiment, 22-82 år). Relevante kliniske patologiske træk (tabel 1) blev alle fremstillet af patienternes filer. Tumor etape blev klassificeret i henhold til det 7. Union International Cancer Kontrol (UICC) TNM [19].

Immunhistokemi farvning

I alt 223 gastrisk karcinom prøver blev anvendt i immunhistokemi (IHC) analyse. Ifølge protokollen [20] for IHC på paraffinindstøbte vævssnit blev paraffinindlejrede blokke sektioneret på omkring 4 um tykkelse. Objektglas blev bagt ved 60 ° C i 2 timer, afparaffiniseret med xylen og rehydreret under anvendelse af en alkohol-gradient (100% alkohol, 95% alkohol, 80% alkohol og 70% alkohol). De væv Objektglassene blev derefter behandlet med 3% hydrogenperoxid i methanol i 30 min for at standse endogen peroxidaseaktivitet, og antigenerne blev hentet i 0,01 M natriumcitratbuffer (pH 6,0) ved anvendelse af en mikrobølgeovn. Efter 30 minutters præinkubation i 10% normalt gedeserum til at forhindre ikke-specifik farvning blev prøverne inkuberet natten over under anvendelse et primært antistof, enten anti-HSP60 (Abcam, # ab31115, UK, fortynding 1:200) eller anti-MMP-9 ( Abcam, # ab38898, UK, fortynding 1:200), i en fugtig beholder ved 4 ° C. Vævet Objektglassene blev behandlet med en ikke-biotin peberrodsperoxidasekonjugeret påvisningssystem i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner (Gene Tech). IHC Resultaterne blev evalueret af to uafhængige forskere blindet til patientens identitet og klinisk status. I afvigende tilfælde, en patolog revideret sagerne, og en blev opnået enighed

HSP60 og MMP-9 farvningsintensiteter blev bedømt på en skala fra 0-3 efter procentdelen af ​​positive tumor (0, 5% positive celler; 1, 5-10%, 2, 11-50%, eller 3, 50%). Niveauet er meget lavt i 0, lav i 1, moderat for 2 og høj for 3 (fig. 1). Niveauerne af HSP60 og MMP-9 blev klassificeret som negative for scoringer ≤1 og positiv for scoringer ≥2.

De nederste paneler i (A) og (B) repræsenterer forstørret billeder af indrammede område i den tilsvarende øvre paneler. Skalaen søjle repræsenterer 100 um.

Opfølgende

Den opfølgende varighed blev defineret som intervallet mellem datoen for operationen og datoen for død eller sidste opfølgning . Undersøgelsen blev censureret den 30. september 2013. Den mediane opfølgningsperiode var 27,0 måneder (interval, 4-82 måneder) i 223 patienter. Alle patienter blev fulgt op hver 1-3 måned i det første år og hver 3-6 måneder derefter. Gentagelse blev bekræftet af tumormarkører niveauer, herunder CEA, AFP, CA199, CA125 og CA724, B-typen ultralyd inspektion hver 3 møl, og computertomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging (MRI) hver 6. måned efter gastrektomi. De væsentligste dødsårsager var mavekræft tilbagefald. Samlet overlevelse (OS) blev beregnet fra tidspunktet for kirurgi til datoen for død eller sidste opfølgning. Gentagelse overlevelse (RFS) blev defineret som fra tidspunktet for operationen frem til datoen for tilbagefald eller fra den periode resektion til datoen for den sidste observation taget.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS-software (version 16.0, Chicago, IL, USA). Sammenhængen mellem HSP60 og kliniske data blev beregnet ved anvendelse af chi-square test, og vises på tværs af tabeller. Korrelation af HSP60 med MMP-9 blev beregnet af Pearson χ2 test. Overlevelseskurver blev afbildet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og analyseret under anvendelse af log-rank test. Alle indberettede

P

værdier var tosidede og

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Foreningen af ​​HSP60 med klinisk-patologiske variabler

for at belyse den biologiske betydning af HSP60 i gastrisk cancer, undersøgte vi den immunhistokemiske niveau af HSP60 i gastrisk cancer væv (fig. 1). HSP60 farvning hovedsageligt placeret i cytoplasma af tumorceller. Den positive sats på HSP60 var 58,3% (130/223) i mavekræft prøver.

Ifølge resultaterne af immunhistokemi, vi korreleret HSP60 status i 223 mavekræft prøver med otte andre bredt anerkendte clinicopathologic parametre (tabel 1 ). Vores analyser viser, at niveauet af HSP60 i mavekræft var signifikant korreleret med dybden af ​​invasion (

P

= 0,043), lymfeknude metastaser (

P

= 0,018) og stadium af sygdommen (

P

= 0,048), men var ikke forbundet med køn, alder, tumorstørrelse, tumor websted og kvalitet af differentiering (

P

0,05) (tabel 1). Især korrelationen mellem HSP60 status med fremtrædende serosale invasion og lymfeknude metastaser positivitet foreslog en potentiel rolle HSP60 i øget invasion og metastase af mavekræft.

Effekt af tumor HSP60 proteinniveau på prognose

for yderligere at bestemme virkningerne af HSP60 på OS og RFS, vi uropført univariat analyse af traditionelle clinicopathologic variabler for prognose. Resultaterne af den univariate analyse er vist i tabel 2. Overekspression af HSP60 (

P

= 0,001), større tumorstørrelse (

P

0,001), tumorstedet (

P

= 0,014), fremtrædende serøse invasion (

P

0,001) og lymfeknude metastaser (

P

0,001) var signifikant associeret med de fattige OS på mavecancerpatienter . Desuden Kaplan-Meier analyse viste, at HSP60 overekspression (

P

= 0,002), større tumor størrelse (

P

0,001), tumor websted (

P

= 0,008), fremtrædende serøse invasion (

P

0,001) og lymfeknude metastaser (

P

0,001) var negative prognostiske faktorer for RFS i gastrisk kræftpatienter (tabel 2). Endvidere at evaluere den uafhængige virkning af HSP60 overekspression på OS og RFS, en multivariat Cox regressionsmodel justeret for tumorstørrelse, tumorstedet, dybde invasion, lymfeknudemetastase og HSP60 udførtes. Vores resultater viste, at HSP60 status var en dårlig uafhængig prognostisk faktor for OS i mavecancerpatienter (hazard ratio, 1,594; 95% CI, 1,114-2,280). Desuden positive HSP60 udtryk patienter næsten 1,5 gange større sandsynlighed for at lide af tilbagefald end dem med negativ HSP60 udtryk (hazard ratio, 1.460; 95% CI, 1,024-2,081). Tumor størrelse, dybde invasion og lymfeknude metastaser alle havde selvstændig prognostisk værdi i den multivariate analyse (tabel 3).

Survival analyse viste, at OS og RFS var signifikant forskellige blandt 223 patienter efter til niveauet for HSP60 (

P

= 0,001,

P

= 0,002) (fig. 2A). Den postoperative median OS og RFS var 26,0 måneder og 20,0 måneder. De postoperative median OS gange i HSP60-positiv (n = 130) og HSP60-negative (n = 93) gastrisk kræftpatienter undergruppe var 17,5 måneder og 36,0 måneder, og medianen af ​​RFS gange var 14,0 måneder og 33,0 måneder. Desuden OS og RFS satser på 5 år var 30,2% og 29,3% for HSP60-positive patienter sammenlignet med 48,9% og 43,5% for HSP60-negative patienter, henholdsvis (

P

= 0,001 og

P

= 0,002;. tabel 2)

Alle patienter blev stratificeret efter tumorstørrelse, dybde invasion og lymfeknude metastaser. Kaplan-Meier overlevelsesrater skøn og log-rank tests blev anvendt til at analysere den prognostiske betydning af HSP60 i alle patienter (A), og hver undergruppe (B-G).

For yderligere at evaluere den prognostiske værdi af HSP60 i forskellige undergrupper blev patienterne stratificeret efter tumorstørrelse (fig. 2B, C), dybde invasion (fig. 2D, E) og lymfeknudemetastaser (fig. 2F, G). Niveauet af HSP60 fastholdt prognostisk værdi til at forudsige kortere OS og RFS i undergrupperne for tumorstørrelse. For undergrupperne af T3 /T4 og N1-3 patienter blev signifikante korrelationer fundet mellem HSP60 status og OS (

P

= 0,003 og

P

= 0,002, henholdsvis) og RFS (

P

= 0,008 og

P

= 0,003, henholdsvis). HSP60 havde nogen prognostisk værdi med hensyn OS eller RFS for patienter med T1 /T2 og N0 (alle

P

0,05). Derfor ser det ud til, at HSP60 kan tjene som en magtfuld prognostisk faktor for patienter med fremskreden mavekræft i forskellige risikogrupper.

HSP60 overekspression forudser dårlig prognose uafhængig af tumorindtrængen

For bedre at forstå den kliniske betydningen af ​​HSP60 på aggressivitet i gastrisk cancer, undersøgte vi forholdet mellem HSP60 med dybde invasion og lymfeknudemetastaser i gastrisk cancer. De positive satser HSP60 var 63,7% og 63,3% i den mere fremtrædende serosale invasion gruppe (T3 /T4) og hyppigere lymfekirtelinvolvering gruppe (N1-3), mens der var kun 50,0% og 46,2% i T1 /T2 og n0 (

P

= 0,043 og

P

0,018 henholdsvis) (tabel 1). Desuden blev niveauet af HSP60 signifikant korreleret med MMP-9 i 223 gastriske carcinoma prøver. Af 93 patienter med lavt niveau af HSP60, 65 patienter (69,9%) havde lavt niveau af MMP-9, mens 77 ud af 130 patienter (59,2%) med høj grad af HSP60 også havde højt MMP-9 (

P

. . 0,001) (figur 3)

(A, blev B) IHC farvning for HSP60 og MMP-9 udført i tumorer fra 223 mavecancerpatienter. Repræsentative eksempler på HSP60 og MMP-9-farvning i serielle snit fra de samme tumorprøver er vist i (A), og procentdele af prøver udviser lavt eller højt niveau af HSP60 i forhold til MMP-9 niveau er vist i (B). Skalaen søjle repræsenterer 200 um.

Vi udforskes yderligere påvirkning af tumorindtrængen på den prognostiske værdi af HSP60 i gastrisk cancer ved hjælp MMP-9 som en indikator for den invasive potentiale af individuelle tumorceller. Alle patienter blev stratificeret i enten en lav invasivitet undergruppe (lav MMP-9; n = 118) eller en høj invasionsevne undergruppe (høj MMP-9; n = 105) i henhold til niveauet af MMP-9-indekset. Kaplan-Meier overlevelseskurver blev derefter plottet til at undersøge sammenhængen mellem HSP60 status og overlevelse (fig. 4). I high tumorindtrængen undergruppe blev HSP60 overekspression forbundet med kortere OS (

P

= 0,013) og RFS (

P

= 0,032) i forhold til OS og RFS hos patienter med lavt niveau af HSP60, mens der ikke var nogen prognostisk værdi med hensyn OS eller RFS i den lave invasiv undergruppe.

Kaplan-Meier-overlevelse skøn og log-rank test blev anvendt til at analysere sammenhængen mellem HSP60 status og samlet overlevelse eller fornyet-fri overlevelse hos patienter med lavt invasivitet (lav MMP-9; n = 118) eller høj invasivitet. (høj MMP-9; n = 105)

Discussion

i den foreliggende undersøgelse niveauet af HSP60 blev undersøgt i 223 gastriske carcinoma væv ved immunohistokemi. Vi fandt, at HSP60 status var signifikant associeret med dybde invasion og lymfeknudemetastase. Derudover Kaplan-Meier overlevelse analyse afslørede, at overlevelsestider (OS og RFS) af mavecancerpatienter med HSP60 overekspression var signifikant kortere end dem med lavt niveau af HSP60. Desuden multivariat Cox model analyse viste, at HSP60 status var en uafhængig faktor for både prognose indekser (OS og RFS) i gastrisk cancer. Dette fund tyder på, at HSP60 spiller en vigtig rolle i tumor prognose og kunne være en potentiel prognostisk faktor af gastrisk cancer. Vores resultater var konsistente med tidligere rapporterede resultater. I flere undersøgelser er det blevet vist, at den unormale ekspression af HSP60 i cancerceller er associeret med tumorudvikling. Tanaka et al. [21] rapporterede, at positivitet på H. pylori HSP60 var signifikant højere hos patienter med diffus-typen gastrisk cancer end i H. pylori-positive patienter uden mavekræft, som foreslået, at H. pylori HSP60 kan være forbundet med gastrisk carcinogenese, især i tilfælde af diffuse cancer. Faried et al. [14] sammenlignet korrelationen af ​​HSP60 status med klinisk-patologiske parametre og prognose i øsofageal pladecellecarcinom og foreslog, at HSP60 korreleret med patientens prognose i human øsofageal pladecellecarcinom. Desuden Cappello et al. [22] vurderes tilstedeværelsen og ekspressionen af ​​HSP60 og Hsp10 i tarm karcinomer med lymfeknude metastaser og fandt, at HSP60 og Hsp10 overekspression funktionelt var relateret til tumor progression i tarm karcinomer. Imidlertid Cappello et al. [23] sammenlignede HSP60 og Hsp10 ekspression i lungekræft med den af ​​kronisk obstruktiv lungesygdom ved immunhistokemi og fundet modstridende resultater, at tabet af HSP60 og Hsp10 immunopositivitet er relateret til udviklingen og progressionen af ​​bronkial cancer hos rygere med kronisk obstruktiv pulmonal sygdom.

Klinisk fase er den vigtigste faktor, der påvirker prognosen for mavecancerpatienter. Flere systemer er tilgængelige til at klassificere mavekræft. Blandt dem, Union International Cancer Kontrol (UICC) TNM er et af de mest udbredte. Selvom TNM systemet med succes har gradueret patienter på deres prognose ifølge klinisk-patologiske variabler, har det nået sin grænse i at levere vigtige oplysninger, der kan påvirke behandlingsstrategi. Det er svært for gastrointestinale kirurger at forudsige præcist, hvilke individer vil opleve tilbagefald blandt avancerede patienter, der har gennemgået helbredende behandling. For at overvinde begrænsningerne ved disse traditionelle systemer, har mange molekylære markører blevet undersøgt og har vist at have potentiale prædiktiv betydning. Men til dato, biomarkører, der kunne lagdele gastriske cancerpatienter med helbredende excision i TNM stadie III /IV stadig er væsentligt begrænset. I vores stratificeret analyse, fandt vi, at HSP60 status havde klart prognostisk værdi for OS og RFS i T3 /T4 og lymfeknude metastaser (N1-3) patienter. Disse data indebærer, at HSP60 kan virke som en forudsigende værktøj til at identificere patienter med fremskreden mavekræft med høj risiko for tilbagefald.

Det er kendt, at nedbrydningen af ​​ekstracellulær matrix (ECM) var et signal for begyndelsen af ​​invasionen og metastase, og MMP’er er vigtige molekyler involveret i ECM nedbrydning under invasion og metastase [24]. Chu et al. [18] rapporterede, at cancer MMP-9 blev signifikant korreleret med dybden af ​​invasion og lymfeknudemetastase og MMP-9-positive mavekræft patienter havde dårligere resultater end dem med MMP-9-negative tumorer. Zhao et al. [25] fandt, at MMP-9 målrettet RNA-interferens var i stand til at undertrykke MMP-9-ekspression og inhiberer cellevækst og invasion af SGC7901 mavekræft in vitro og in vivo. Desuden Lin et al. [26] rapporterede, at varmechokprotein 60 af H. pylori forøget migration af gastriske cancerceller og fremmes dannelse rør øvrigt kunne det accelerere udviklingen af ​​kræft i vejen for at udtrykke de pro-inflammatoriske cytokiner. Det er blevet rapporteret, at HSP60 foreslås som mål for tumorterapi [27]. Vores resultater viste, at niveauet for HSP60 og MMP-9 blev korreleret med hinanden, hvilket indikerer højere invasive og metastaserende aktivitet i HSP60-positive cancerceller. Desuden blev HSP60 stærkt udtrykt i dybden af ​​invasion, især i T3 og T4 carcinomer. Så vidt lymfeknude status angik, patienter med lymfeknudemetastaser tendens til at vise forhøjede HSP60-ekspression. Endvidere patienter, der havde HSP60 overekspression, hvori tumorceller viste høj invasionsevne, havde dårlig OS og kortere RFS. Kollektivt, HSP60 i gastrisk cancer fremme tumor aggressivitet antyder, at HSP60 kunne være et muligt mål ved cancerterapi.

Sammenfattende vi demonstreret, at HSP60 kan spille en vigtig rolle i tumorinvasion, metastase og prognose, og kunne arbejde som et lovende mål for prognostisk forudsigelse i gastrisk cancer. Bestemmelse af HSP60 kan bidrage til at identificere patienter mavekræft høj risiko og dermed hjælpe valget af passende behandlinger. Yderligere undersøgelser er nødvendigt at præcisere den rolle, HSP60 i udviklingen af ​​mavekræft.

Tak

Vi takker de kliniske data, som patologi afdelingen (Tilknyttede Hospital i Guilin Medical University).