PLoS ONE: Cryptochrome en overekspression korrelerer med Tumor Progression og dårlig prognose hos patienter med kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Ur gener kører omkring 5-15% af genom-dækkende mRNA-ekspression, og afbrydelse af døgnrytmen ur kan deregulere cellens normale biologiske funktioner. Cryptochrome 1 er et centralt regulator af circadian feedback loop og spiller en vigtig rolle i organismer. Den foreliggende undersøgelse blev udført for at undersøge ekspressionen af ​​Cry1 og dens prognostisk betydning i kolorektal cancer (CRC). Endvidere blev funktionen af ​​Cry1 i human CRC undersøgt i cellekulturmodeller.

Metoder Salg

Real-time kvantitativ PCR, Western blot-analyse og immunohistokemi blev anvendt til at udforske Cry1 ekspression i CRC celle linjer og primære CRC kliniske prøver. MTT og kolonidannelse assays blev anvendt til at bestemme virkningerne på cellulær proliferation evne. Dyret model blev brugt til at udforske Cry1 indvirkning på tumor celleproliferation evne

in vivo

. Transwell assays blev udført for at detektere migration evne til cellelinier. Statistiske analyser blev anvendt til at vurdere den diagnostiske værdi og sammenslutninger af Cry1 udtryk med kliniske parametre.

Resultater

Cry1-ekspression op reguleret i de fleste af de CRC cellelinjer og 168 primær CRC klinisk prøver på proteinniveauet. Klinisk patologisk analyse viste, at Cry1 udtryk var signifikant korreleret med lymfeknude metastaser (

s

= 0,004) og TNM stadie (

s

= 0,003). High Cry1 ekspression blev forbundet med dårlig samlet overlevelse i CRC patienter (

s

= 0,010). Eksperimentelt, fandt vi, at opregulering af Cry1 fremmet udbredelsen og migration af HCT116 celler, mens nedregulering af Cry1 hæmmede kolonidannelse og migration af SW480 celler.

Konklusioner

Disse resultater tyder på, at Cry1 sandsynligvis spiller vigtige roller i CRC udvikling og progression andCry1 kan være en prognostisk biomarkør og en lovende terapeutisk mål for CRC

Henvisning:. Yu H, Meng X, Wu J, Pan C, Ying X, Zhou Y, et al. (2013) Cryptochrome en overekspression korrelerer med Tumor Progression og dårlig prognose hos patienter med kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (4): e61679. doi: 10,1371 /journal.pone.0061679

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 10. januar, 2013; Accepteret: 13 Mar 2013; Udgivet 23. april, 2013 |

Copyright: © 2013 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Basic Research Program Kina (973 Program, No. 2011CB504805, No. 2010CB52994), fra National Natural Science Foundation of China (30.973.448) og Guangdong Rekruttering Program for Creative Research Group. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

døgnrytmen er daglige svingninger i forskellige biologiske processer. I de senere år har reguleringen af ​​døgnrytmen forstås bedre. Den molekylære mekanisme af døgnrytmen svingninger i suprachiasmatic kerner (SCN) og perifere celler er baseret på feedback sløjfer af otte centrale døgnrytmen gener [1], [2]:

periode1 (Per1)

,

perioden2 (Per2)

,

Period3 (Per3)

,

Ur

,

Bmal1

,

Caseinkinase I ε (CKIε)

,

Cryptochrome1 (Cry1) og Cryptochrome2 (Cry2)

. Blandt de otte gener, de Crys ophobes i cytoplasmaet og derefter indtaste kernen, fremme dannelsen af ​​stabile Per /Cry /CK1ε komplekser. Når i kernen, de Crys bryde fra hinanden Bmal1 /Ur-associeret transkriptionel kompleks, hvilket resulterer i hæmning af Cry og Per transskription og derepression af Bmal1 transskription. Den molekylære ur af de perifere væv koordinerer transkription af cirkadiske gener. De døgnrytmen gener er stort set væv specifikke og forbinde de vigtigste væv funktioner døgnrytmen miljø, så disse vigtige funktioner til at være til rådighed på bestemte tidspunkter, hvor der er mest brug [3], [4], [5].

i pattedyr er omkring 5-15% af genom-dækkende mRNA-ekspression drevet af døgnrytmen gener, herunder centrale cellecyklus regulatorer (såsom

cyklin D1

), onkogener og tumor undertrykkere, såsom

c myc

og

WEE-1 Hotel (en slags kinase, der blokerer celledeling) [6]. Afbrydelse af døgnrytmen ur kan deregulere normale cellulære biologiske funktioner og få væsentlig indvirkning på menneskers sundhed, forårsage sygdomme såsom søvnforstyrrelser, gastrointestinale og kardiovaskulære sygdomme og depression. Den døgnrytmen ur er også forbundet med en øget forekomst af flere epiteliale cancere [7], [8], [9], [10], [11], [12]. I musemodeller, transplanterede tumorer vokser dobbelt så hurtigt i SCN-læderede mus som i sham-læderede dyr [13]. Disse resultater tyder på, at der eksisterer en tæt sammenhæng mellem døgnrytmen organisation og udvikling af forskellige kræftformer. Forholdet mellem døgnrytmen gener og kræft er blevet påvist i de senere år. Værten døgnrytmen ur er blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i den endogene kontrol for tumorprogression [14] .Cry1, et medlem af Cryptochrome familien, har vist sig at være afgørende for den negative arm af døgnrytmen feedback loop [15] , [16].

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de tre førende årsager til kræft dødelighed på verdensplan [17]. CRC patienter ofte udvikle lymfeknudemetastaser i de tidlige stadier af sygdommen. I de fremskredne stadier, størstedelen af ​​patienterne også udvikle lever, lunge og bughinden metastaser. De involverede i CRC metastaser faktorer er stort set ukendt; imidlertid er dysregulering af molekylære processer for at føre til vækst og metastase af CRC. Derfor er betydningen af ​​markører, der fremmer udviklingen af ​​CRC blevet understreget, da de kan give terapeutiske mål [18], [19].

Men undersøgelser, der vurderer relationer Cry1 udtryk for klinisk-patologiske træk og resultater i tarmkræft er ikke blevet rapporteret. Vi har derfor vurderet ekspressionsniveauerne af Cry1 i humane kolorektale cancer væv og matchede ikke-tumor slimhinde og analyseret den kliniske betydning af Cry1 udtryk inCRC patienter. Vore data viser, at Cry1 ekspression er signifikant korreleret med TNM stadie og lymfeknude-status. Således kan Cry1 tjene som en ny diagnose markør og terapeutisk mål for CRC-terapi.

Materialer og metoder

Patienter og opfølgende

Et hundrede og otteogtres kolorektal kræftpatienter i alle TNM stadier på Cancer center of Sun Yat-sun University mellem september 1999 og december 2005 blev inkluderet i undersøgelsen. Ti parrede væv fra de 168 prøver blev anvendt til en q-PCR-analysen.

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Sun Yat-sen University Cancer Center Institutional Board, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle af patienterne.

Kliniske data, herunder alder, køn, tumorstørrelse, tumor placering, præoperativ carcinoembryonisk antigen (CEA) niveauer og kulhydrat-antigen 19-9 (CA199) niveauer, blev indsamlet fra ubehandlet tilfælde rapporter.

patologiske parametre, såsom tumor invasiv dybde, differentiering kvalitet og histologisk mønster blev opsamlet fra patologiske rapporter og kontrolleret af patologer. Patienterne blev fulgt op hver tredje måned i de første to år, en gang hver sjette måned i de tredje og fjerde år, og en gang om året efter det femte år postoperativt.

Alle patienter blev kontaktet telefonisk til kontrollere deres sundhedstilstand; den sidste opfølgning dato var 1. marts 2012. sygdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS) gange blev beregnet fra driften dato metastase eller fornyet dato eller datoen for død, eller den sidste censor tid.

Cellekultur

de humane CRC cellelinier SW480, SW620, HCT116, HT29, den humane embryoniske nyrecellelinie GP293 og den normale colon epitel cellelinie FHC blev opnået fra American Type Culture Collection . De THC8307 celler blev opnået fra vores eget laboratorium kollektion. CRC cellelinier blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA). De FHC celler blev dyrket i DMEM: F12-medium indeholdende 0,005 mg /ml insulin, 10 ng /ml choleratoxin, 100 ng /ml hydrocortison og 0,005 mg /ml transferrin og suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 ng /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin. Alle cellelinier blev dyrket i et befugtet kammer med 5% CO

2 og ved 37 ° C.

Kvantitativ revers transskription-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol Reagens ® (DSBIO, Guangzhou, Kina) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Komplementær DNA (cDNA) blev syntetiseret fra 2 ug totalt RNA ved anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI). cDNA blev amplificeret ved AmpliTaq® Gold DNA-polymerase (Applied Biosystems, Foster, CA) og genspecifikke primere. Følgende primere blev anvendt til Cry1, 5’GAGTATGATTCTGAGCCCTTTG-3 ‘(fremad), 5′-GGTTGTCCACCATTGAGT-3’ (revers). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol.

Western Blot-analyse

Total cellulære proteiner blev ekstraheret og separeret i SDS-PAGE geler og Western Blot-analyse blev udført ifølge standardprocedurer. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol på den samme membran. De primære antistoffer, der blev anvendt omfattede monoklonalt anti-Cry1 (1:1000, Abcam, USA) og anti-GAPDH (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, USA). Proteiner blev visualiseret ved hjælp af ECL procedure (Amersham Biosciences, USA).

Cell transfektion

Den kodende sekvens af Cry1 blev forstærket og klonet ind i

NotI

BamHI

site af pcDNA3.1

+ for at generere en pcDNA3.1

+ – Cry1 udtrykke vektor; den resulterende konstruktion blev bekræftet ved sekventering. Cry1 siRNA (GCAAGAGAAUUUGCUUAAUTT) og kontrol siRNA (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) blev købt fra Shanghai Genepharma Co Ltd (Shanghai, Kina).

For transient transfektion, SW480 celler (6 x 10

5 celler pr) og HCT116-celler (5 x 10

5 celler per brønd) blev podet i plader med 6 brønde ved 60% konfluens og transficeret med 100 nM af oligonukleotider eller 4 ug plasmid, under anvendelse af Lipofectamine 2000 ((Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. efter 6 timers inkubation ved 37 ° C blev transfektionsmediet udskiftet med 3 ml komplet medium indeholdende 10% FBS. Celler blev opsamlet til Western blot, spredning og invasion-assays på forskellige tidspunkter.

Retrovirus pakning og transduktion

Cry1 og controlsequences blev klonet i

Xho

i og

Cla

jeg stedet for pLNCX2 retrovirusvektoren. virus pakning blev udført i GP293 celler. GP293 celler blev dyrket i DMEM med 10% FBS i en 37 ° C inkubator med 5% CO

2. Otteogfyrre timer efter transfektion blev supernatanten opsamlet ved centrifugering ved 1000 g i 10 min. De HCT116-celler blev transduceret med retrovirus indeholdende Cry1 eller kontrolsekvenser plasmider. Otteogfyrre timer efter infektion, G418 (600 ug /ml) blev tilsat til medierne for 2 uger at udvælge de stabile celler inficeret med retrovirus. Western blotting-assays blev anvendt til at detektere ekspressionen af ​​Cry1 i to stabile cellelinier som beskrevet ovenfor

Cellelevedygtighed assay

3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl). – 2 blev 5-biphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay anvendes til at detektere celleproliferation. HCT116-celler blev udpladet i 96 brønde ved 1 x 10

3 celler /brønd. Den spektrofotometriske absorbans af hver prøve blev målt ved 490 nm. Alle forsøg blev gentaget tre gange, og de gennemsnitlige resultater blev beregnet.

For kolonidannelse analysen, HCT116 celler (4 × 10

3 celler pr 10 cm

2 plade) overekspression Cry1or kontrol GFP og SW480-celler (5 x 10

3 celler pr 10 cm

2 plade) nedreguleres til ekspression af Cry1 af siRNA eller en negativ kontrol blev udsået i komplet medium. Cellerne blev dyrket i 14 dage ved 37 ° C i 5% CO

2 befugtet luft. Kolonidannelse og vækst blev visualiseret ved krystalviolet-farvning. Antallet af kolonier indeholdende 50 celler blev bestemt, og 12 felter blev talt

In vitro

migration assay

Migrationen evne celler blev målt i Transwell kamre. (8 um pore, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Den nederste kammer blev fyldt med 700 pi DMEM indeholdende 10% FBS. For migrationen assay tumorceller (1 x 10

5 celler i et samlet volumen på 200 pi) blev anbragt i det øvre kammer og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 befugtet luft. Efter 24 timer dyrket, ikke-migrerende celler på den øvre overflade af membranen blev fjernet, og de celler, der migrerede til undersiden af ​​polycarbonatmembran blev fikseret med ethanol og farvet med krystalviolet i 10 minutter. Antallet af migrerende celler blev derefter bestemt fra 5 uafhængige mikroskopiske felter. Gennemsnittet af tredobbelte analyser for hver eksperimentel betingelse blev anvendt til analyse.

immunhistokemisk assay

Udtrykket af Cry1 i primære tumorer og tilstødende noncancerous kolorektal slimhinde blev undersøgt ved hjælp af en immunhistokemisk analyse. Den immunhistokemiske analyse blev udført inden for fem dage efter sektion forberedelse. Paraffinsnit blev skåret til en tykkelse på 4 um og monteret på silaniserede objektglas. Snittene blev derefter afvokset, rehydreret og blokeret med 0,3% hydrogenperoxid. Vævsantigener blev hentet med en mikrobølgeovn indstillet til 95 ° C i 25 minutter og afkølet til stuetemperatur i 10 mmol /natriumcitratpuffer (pH 6,0). Hver skive blev derefter vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) og inkuberet natten over ved 4 ° C med Cry1 (1:400, klon ab54649, Abcam, Cambridge, UK). Primære antistoffer blev fortyndet med baggrund reducere komponenter (S2022, Dako, Glostrup, Danmark). Det sekundære antistof blev ansat i Envision Detection Kit (Dako). Objektglassene blev farvet i 2 minutter med diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) og derefter modfarvet med hematoxylin. Væv behandlet med antistof fortynding opløsning blev anvendt som en negativ kontrol. Alle kontroller givet tilfredsstillende resultater.

Evaluering af farvning

Prøverne blev evalueret af to efterforskere, der var uvidende om det kliniske resultat og der selvstændigt revideret de farvede objektglas. Hver slide blev vurderet under mikroskopi ved × 200 forstørrelse. Ekspressionen af ​​Cry1 blev evalueret under anvendelse H-score. H-scores bestod af en vurdering af intensiteten af ​​farvning og procentdelen af ​​farvningen område har en given intensitet. Kun farvede maligne celler blev vurderet. Prøverne blev inddelt i følgende fire kategorier baseret på intensiteten af ​​nuklear farvning: ingen (0), svag (1), medium (2) og stærk (3). Den indekserede beløb blev opnået ved at multiplicere intensiteten klasse ved procentandelen af ​​farvningen område.

Cry1 ekspressionsniveauet blev dikotomiseret ifølge DFS og OS af en ROC-kurve. Cut-off værdien af ​​den positive sats var maksimeret summen af ​​følsomhed og specificitet point.

In vivo

proliferationsassays

Female athymiske BABL /c nøgne mus ( 4-5 uger gamle) blev købt fra Medical Animal center Guangdong-provinsen (Guangdong, Kina). Alle dyreforsøg blev udført ioverensstemmelse med NIH dyr useguidelines og de nuværende kinesiske regler og standardson brugen af ​​forsøgsdyr. For at bestemme udbredelsen kapacitet af cellen linesstably højt udtrykkende Cry1

in vivo

, alt 1 × 10

6-celler blev injiceret subkutant i venstre side af nøgne mus og den negative kontrolgruppe blev injiceret i højre (n = 9). Tumorvolumenet blev vurderet ved anvendelse af følgende formel:. Tumorvolume = 4π /3 × (bredde /2)

2 × (længde /2) .Four uger efter injektion blev dyrene aflivet

Statistisk analyse

Alle data er præsenteret som gennemsnit ± SEM medmindre andet er angivet. En parret

t

test blev anvendt til at teste for forskellene i Cry1 udtryk mellem matchede tumor og godartet slimhinde. Den statistiske signifikans af

in vitro

studier blev analyseret ved hjælp af Students

t

-test. Kaplan-Meier og log-rank test af lighed mellem de overlevende blev brugt til at trække overlevelseskurverne af høj versus lav Cry1 IHC score (som defineret af ROC-kurve). Alle

s

værdier var tosidet, og

P

0,05 var niveauet for statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS softwarepakke, udgave 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

Karakteristik af patienter og tumorer

I alt af 168 patienter, som fik radikal resektion mellem januar 1999, og december 2005, var undersøgt. Karakteristika for alle de patienter er opsummeret i tabel 1. Den gennemsnitlige patientens alder var 54,6 år (SD, 14,3). Den mediane follow-up periode var 84 måneder (interval 4 til 146). Femogfirs tumorer (50,6%) blev placeret i tyktarmen. Ti ud af de 168 tumorer (6,0%) var T1 eller T2. Ninety-fire tumorer var TNM stadie I-II (56.0.0%). Den mediane antal høstede lymfeknuder var 19 (mellem 0 og 48). Cry1 protein ekspressionsniveauer blev anvendt til immunhistokemisk analyse. Cry1 var farves hovedsageligt i cytoplasmaet og nukleare områder af cellerne. High Cry1 proteinekspression blev påvist i 101 prøver (60,1%) og svag eller negativ farvning blev observeret i 67 tumorprøver (39,9%, figur 1).

Repræsentative immunohistokemiske billeder af colorektal cancer vævsprøver indikerer negativ eller svagt detekterbar Cry1-farvning (A og B); moderat Cry1 farvning (C); og stærk Cry1 farvning (D) er vist. Forstørrelse er × 200 (A, B, C og D).

Cry1 er overudtrykt i kolorektal cancer væv

Cry1 mRNA-ekspression i kolorektal cancer blev undersøgt ved hjælp af RT PCR; analyser af Cry1 mRNA blev henrettet på ti matchede par af tyk- og endetarmskræft prøver og tilstødende noncancerous vævsprøver. Cry1 mRNA blev udtrykt ved højere niveauer i otte af de kolorektale cancer vævsprøver end i tilstødende noncancerous væv. Den differentielle høj ekspression varierede fra 1,1 gange til 13,1 gange (figur 2D). I overensstemmelse med disse data, blev Cry1 protein også op reguleret i tarmkræft sammenlignet med matchede kontrol vævsprøver (figur 2A-C).

(A) Et repræsentativt billede af Cry1 farvning i kolorektal cancer væv vises. (B) Et repræsentativt billede af Cry1 farvning i tilstødende noncancerous væv vises. (C) Cry1 proteinekspression niveau var højere i tumorvæv sammenlignet med tilstødende kontrol væv som påvist ved immunoblotting (gennemsnit ± SEM, n = 109; * **,

P

0,001). (D) Gennemsnit T /N-forhold på Cry1 mRNA-ekspression i parret kolorektal cancer (T) og normalmucosa væv (N) blev kvantificeret ved qPCR og normaliseret til GAPDH. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien (SD), beregnet i tre parallelle forsøg. Forstørrelse er × 200.

associering mellem Cry1 udtryk og klinisk-patologiske variabler

Foreningen af ​​Cry1 udtryk og klinisk-patologiske variabler blev yderligere analyseret. Cry1 ekspression og alle de andre klinisk-patologiske parametre blev dikotomiseret i to grupper. Resultaterne er opsummeret i tabel 1. Der var en signifikant korrelation mellem Cry1 udtryk og både TNM stadie (

s

= 0,003) og lymfeknude status (

s

= 0,004).

Blandt de 168 kolorektal kræftpatienter, blev ingen signifikant korrelation fundet mellem Cry1 udtryk og køn, alder, placering af primær masse, tumorstørrelse, tumor differentiering kvalitet, histologisk type, Præoperativ CA199 eller CEA-niveau (

p

. 0,05)

associering mellem Cry1 udtryk og overlevelse

anvendelsen af ​​Cry1 udtryk som en prognostisk markør for CRC patienter blev også undersøgt. Ved slutningen af ​​opfølgningsperioden (marts 1, 2012), var 32 patienter døde af kolorektal cancer-relaterede sygdomme. De fem-års overlevelse på DFS var 74,7% for Cry1 high-udtryk gruppe. Dette var signifikant lavere end overlevelsesraten (89,1%) for lav-udtryk gruppe (

s

= 0,011). Tilsvarende fem års overlevelse på OS var 77,6% i Cry1 høj udtryk gruppen og 92,3% i lav-udtryk gruppe (

s

= 0,010) (Tabel 2 og figur 3).

Kaplan-Meier kurver med univariat analyse (log-rank) for kolorektal cancer patienter med høj Cry1 udtryk (n = 101) versus lav eller ingen Cry1 udtryk for samlet overlevelse (n = 67) (A) og sygdomsfri overlevelse (n = 67) (B) er vist. Højere udtryk for Cry1 positivt korreleret med de fattige patientoutcomes.

Cry1 er stærkt udtrykt i de fleste af CRC cellelinjer

For at undersøge den potentielle rolle Cry1 i tumorigenese af kolorektal cancer, blev ekspression af Cry1 mRNA og protein bestemmes for fem CRC cellelinier (SW480, HT29, SW620, THC8307 og HCT116) og en normal colon epitel celle linje, FHC. Cry1 mRNA-ekspression var højst 10 gange højere i de kolorektale cancercellelinjer end i FHC celler (figur 4A). Cry1 protein blev højt udtrykt i de kolorektale cancercellelinjer og kun svagt udtrykt i FHC celler (figur 4B).

Ekspression af Cry1 mRNA og protein i kolorektale cancercellelinjer (SW480, SW620, HT29, THC8307, og HCT116) og FHC blev undersøgt ved qPCR (A) og Western blotting (B). Ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien (SD) beregnet ud fra tre parallelle eksperimenter, *,

P

0,05

Cry1 fremmer tumorvækst og proliferation

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​Cry1 manipulation (gennem gain-of-funktion og tab af funktion) om spredning af kræftceller.

vi eksogent overudtrykt Cry1 i HCT116 celler, som har en lavere endogen ekspression. Virkningen af ​​Cry1 på celleproliferation blev derefter evalueret ved hjælp MTT og klonogene assays. Resultaterne viste, at overekspression af Cry1 kan fremme cellulær proliferation i øjeblikkelige transfektion HCT116 celler (

s Restaurant 0,001, figur 5B.). I modsætning hertil udviste kontrolgruppen ingen signifikant virkning på cellulær proliferation. De kolonidannelse analyser viste også, at overekspression af Cry1 markant stigning i antallet af kolonier dannet efter 14 dages dyrkning sammenlignet med kontrolgruppen celler (

s

= 0,033, fig. 5C, D). Forbindelsen mellem Cry1 og tyktarmskræft cellevækst blev yderligere fastslået ved hjælp af koloni dannelse analyser efter Cry1 knockdown. Som vist i figur 5E og 5F, knockdown af endogen Cry1 udtryk ved siRNA resulterede i en dramatisk hæmning af klon dannelse ved SW480-celler (

p

= 0,007)

(A) Cry1 protein niveauer var opreguleret i HCT116-celler og nedreguleres i SW480-celler. (B) MTT assays på HCT116 celler 24, 48 og 72 timer efter transfektion med Cry1 eller GFP kontrol (***, p 0,001). (C-D) Colony dannelse assay af HCT116 celler transficeret med Cry1 eller GFP-kontrol (*,

s

= 0,033). (E-F) Hæmning af SW480 celle kolonidannelse kapacitet ved Cry1 siRNA i forhold til kontrol (**,

s

= 0,007). Forsøgene blev gentaget mindst tre gange, og repræsentative data præsenteres;

barer

, SD *,

P

. 0,05; **,

P

0,01, ***,

s

. 0,001

Cry1 fremmer themigration af kolorektal cancer celler

Som for Cry1 udtryk var forbundet med lymfeknude status, blev virkningen af ​​Cry1 for migration af kolorektal cancer celler undersøgt ved hjælp af transwell assay for at undersøge effekten af ​​Cry1 overekspression eller deletion. I transwell assays blev HCT116 celler transficeret med Cry1 eller GFP kontrol plasmider podet i kamrene, og deres potentielle migration blev bestemt 24 timer efter transfektion. Analyserne viste, at migrationen kapacitet HCT116 celler overeksprimerer Cry1 blev forøget med 112% i forhold til kontrol-celler (

s

= 0,019, Fig. 6A).

(A) Migration analyser af HCT116 celler transficeret med Cry1 eller GFP kontrol. (N = 3, *,

s

= 0,019) (B) Migration assays af SW480-celler transficeret med Cry1-siRNA eller negativ kontrol. (N = 3, ***,

s

0,001). Repræsentative billeder er vist ovenfor, og det gennemsnitlige antal celler pr ved de angivne tidspunkter er vist nedenfor. Dataene er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg.

Bekræftelse af, at Cry1 fremmet migrationen af ​​kolorektal cancer celler blev vurderet af transfektion af SW480 celler med Cry1-siRNA eller negativ siRNA. Efter 24 timer af kultur, blev migrationen kapacitet i knock-down Cry1 SW480 celler reduceret med 52,4% i forhold til kontrol-celler (

s

. 0,001, figur 6B).

Cry1 forfremmet CRC vækst

in vivo

for yderligere at undersøge onkogene egenskaber Cry1

in vivo

, vi konstrueret en retrovirus vektor overexpressingCry1 og etableret to stabile cellelinier, der var opkaldt ctrl-HCT116 og Cry1-HCT116 (fig. 7A). Disse to cellelinjer var injectedsubcutaneously ind flankerne af nøgne mus. Tumorprogression blev undersøgt over tid. Ved 4 uger efter implantation, blev musene aflivet, og tumorerne blev fjernet. Som shownin fig. 7B-C, volumen og vægt af tumorerne som følge af injektion af Cry1-HCT116 celler var signifikant større og tungere end de stammede fra ctrl-HCT116 celler. Takentogether, disse observationer er i overensstemmelse med de

in vitro

resultater og indikerer, at Cry1 har evnen til at fremme CRC cellevækst

in vivo

.

(A) Udtrykket af Cry1 blev markant forøget i stalden cellelinie Cry1-HCT116 sammenlignet med kontrol stabil cellelinje ctrl-HCT116. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. (B) Repræsentative billeder af tumorer afledt Cry1-HCT116 eller ctrl-HCT116, efter subkutane xenograft transplantationer i nøgne mus (C) Overekspression af Cry1 fremmet kolorektal kræft vækst. Tumorceller blev injiceret subkutant i nøgne mus. Mus blev aflivet efter 4 uger, og volumenet af hver tumor blev målt hver 4. dag. Barer, ± SEM; *

P

0,05, **

s

= 0.01

Diskussion

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse til. evaluere protein ekspressionsniveauer af Cry1 i human colorectal cancer. Det er klart, Cry1 ekspression var højere i cancerøse væv og celler end i normale væv og celler. Vi studerede også forholdet mellem ekspressionsniveauerne af Cry1 til patientresultater og klinisk-patologiske træk. Vores resultater tyder på, at overekspression af Cry1 gen kunne være en nyttig indikator for lymfeknude metastaser, TNM stadie og dårlige resultater hos patienter med colorectal cancer.

Flere tidligere undersøgelser har sammenlignet ekspressionsniveauerne af Cry1 mellem kræft væv og tilstødende normal slimhinde. En undersøgelse viste, at Cry1 og andre døgnrytmen gen (Cry2, Per2 og BamlI) mRNA ekspressionsniveauerne var ens i tyktarmskræft og tilstødende normal slimhinde [20]. En anden undersøgelse viste, at mRNA ekspressionsniveauer af Cry2 og Per2 ned var reguleret i kolorektal cancer. Denne undersøgelse viste også højere Cry1 udtryk i tumor slimhinde af kræft placeret i distale kolorektale segmenter. Cry1mRNA niveauer i CRC væv blev også signifikant associeret med patientens alder og køn [21]. I human epithelial ovariecancer, Cry1 mRNA-ekspression niveau var klart højere i cancervæv end i normale væv [22]. Vores resultater er i delvis uenighed med disse undersøgelser. I vores undersøgelse, Cry1 gen protein ekspressionsniveauer var højere i cancervæv end i tilstødende noncancerous væv. De samme resultater blev fundet i colorektale tumorceller og normale celler, og overekspression af Cry1 fandtes at fremme vækst og migration i colorektale tumorceller. Der blev dog ikke signifikant sammenhæng fundet mellem Cry1 udtryk og køn, alder, placering af primær masse, tumorstørrelse, tumor differentiering kvalitet, histologisk type, præoperativ CA199 eller CEA-niveau (

s

0,05). Disse resultater synes at være rimeligt af følgende grund. Cry1 proteinekspressionsniveauer kan være inkonsekvent forbundet med mRNA ekspression niveauer for disse miljømæssige faktorer. Men proteinerne spiller den vigtigste rolle i de biologiske effekter, og vi registrerer protein udtryk for Cry1 i CRC væv.

Vi undersøgte også relationer Cry1 udtryk med klinisk-patologiske funktioner og patientresultater. De Cry1 proteinniveauer var signifikant associeret med AJCC /TNM fase (med de højeste detekteret i TNM-niveauer stadie III-IV) og lymfeknuder (med de højeste påviste i tilfælde af positive lymfeknuder niveauer). Døgnrytmen gener er blevet impliceret i cellecyklusregulering [23]. Cry1 mutante mus har et forhøjet niveau af Wee1 i mange væv, herunder leveren. Wee1 kinase blokerer celledeling ved at hæmme G2-M overgang. High Cry1 ekspression kan inhibere evnen hos Wee1 til at fremme celleproliferation, hvorved der tilvejebringes en overlevelsesfordel for CRC [24] .Moreover er Cry1 proteinet vides at kompleks med adenylylcyclase, og overekspression af Cry1 reducerer cAMP-produktion som respons på PGE2, isoproterenol, og selv den direkte adenylylcyclase aktivator, forskolin [25]. Undersøgelser har rapporteret, at høje koncentrationer af cAMP kan inhibere migration og metastase af humane prostatacancerceller. PKA er en proteinkinase, der er relateret til cAMP-signalvejen. Undersøgelser har antydet, at PKA hæmmer aktiviteten og funktionen af ​​RhoA [26], [27]. RhoA er et centralt medlem af Rho-familien af ​​små GTP-bindende proteiner og medierer signalering relateret til cytoskelet arrangement, migration, proliferation og genekspression [28], [29], [30]. Tidligere undersøgelser har vist, at invasive vækst og metastase var undertrykt i en række forskellige cancerceller (herunder CRC-celler), når RhoA aktivitet blev inhiberet [26], [31]. De nyeste resultater tyder på, at en Cry1-cAMP /PKA-RhoA medieret vej er involveret i migration og metastase af CRC.

Vores Immunofarvning data enige i disse studier. Højere TNM stadie og tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastase var signifikant korreleret med højere niveauer af Cry1 ekspression, hvilket antyder, at Cry1 kan anvendes som en markør til bestemmelse af progressionen af ​​CRC.