PLoS ONE: MIR-886-3p Regulerer Cell Proliferation og migration, og dysreguleret i Familiær Ikke-medullær kræft i skjoldbruskkirtlen

Abstrakt

Baggrund

Den molekylære grundlag og egenskaber familiær ikke-medullær thyreoideacancer er dårligt forstået. I denne undersøgelse, vi udførte microRNA (miRNA) profilering af familiære og sporadiske papillære kræft i skjoldbruskkirtlen tumor prøver.

Metodologi /vigtigste resultater

Genome bred miRNA profilering af sporadisk og familiær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen blev udført . Differentielt udtrykte miRNA blev valideret ved kvantitativ RT-PCR. Ektopisk ekspression af MIR-886-3p i thyreoideacancer linier blev udført for at identificere veje er mål for miRNA, samt, at bestemme dets virkning på tumor- cellebiologi. Vi fandt fire differentielt udtrykte miRNA mellem familiære og sporadiske papillær kræft i skjoldbruskkirtlen tumor prøver. MIR-886-3p og miR-20a blev valideret at være forskelligt udtrykt af 3- og 4-gange. Pathway analyse af genom-dækkende udtryk data om celler, der overudtrykker miR-886-3p og target forudsigelse analyse viste gener involveret i DNA-replikation og fokale vedhæftning veje blev reguleret af miR-886-3p. Overekspression af miR-886-3p i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer betydeligt hæmmet cellulær proliferation, antallet og størrelsen af ​​sfæroider og cellulære migration. Derudover overekspression af miR-886-3p øget antallet af celler i S-fasen.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater for første gang antyder, at miR-886-3p spiller en vigtig rolle i skjoldbruskkirtlen cancertumor cellebiologi og regulerer gener involveret i DNA-replikation og fokal adhæsion. Således kan MIR-886-3p spille en rolle i initiering og eller progression af papillær thyreoideacancer

Henvisning:. Xiong Y, Zhang L, Holloway AK, Wu X, Su L, Kebebew E (2011) MIR-886-3p Regulerer Cell Proliferation og migration, og dysreguleret i familiær Ikke-medullær kræft i skjoldbruskkirtlen. PLoS ONE 6 (10): e24717. doi: 10,1371 /journal.pone.0024717

Redaktør: Marian Ludgate, Cardiff University, England

Modtaget: 10 juni, 2011; Accepteret: August 17, 2011; Udgivet: Oktober 5, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Intramural Research Program af National Cancer Institute, Center for Cancer Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i skjoldbruskkirtlen er en af ​​de hurtigst voksende kræftdiagnoser i USA med mere end 44.000 nye tilfælde skønnes at forekomme i 2011 [1]. Familiær ikke-medullær thyreoideacancer (FNMTC) kan forekomme som en mindre bestanddel af familiære cancer syndromer (Gardner, Cowden sygdom, Carney kompleks type 1, Werner-syndrom, McCune-Albright syndrom) eller som fremherskende funktionen [2]. De fleste tilfælde af FNMTC er papillær kræft i skjoldbruskkirtlen og har en autosomal dominant mønster af arv med ufuldstændig penetrans. FNMTC tegner sig for op til 8% af alle tilfælde kræft i skjoldbruskkirtlen [2], [3], [4], [5], [6]. I de familiære cancer syndromer nævnt ovenfor, er patienter til stede med distinkte ekstrathyroidale læsioner og modtagelighed gener, der er ansvarlige for disse syndromer kendt. Men de fleste ( 95%) af FNMTC tilfælde opstår som isolerede familiær nonmedullary skjoldbruskkirtlen kræfttilfælde, som modtagelighed gen (er) er ukendt

FNMTC defineres som når to eller flere førstegradsslægtninge. påvirkes med ikke-medullær kræft i skjoldbruskkirtlen. Den genetiske basis for FNMTC er dårligt forstået. I koblingsundersøgelser har adskillige grupper identificeret kromosomale loci forbundet med FNMTC: 1q21, 2q21, 6q22, 8p23.1-p22, og 19p13.2 [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Mutation analyse har vist, at Slægter med FNMTC ikke har kim line mutationer i

BRAF

,

RAS

, og

RET /PTC

gener, der er almindeligt muterede somatisk i skjoldbruskkirtelkræft af follikulær celle oprindelse [2]. Desuden analyse af somatiske mutationer (

BRAF

,

RAS

, og

RET /PTC

) i sporadiske og familiære papillære kræft i skjoldbruskkirtlen tumor prøver viste ingen forskel i hastigheden og type mutationer i disse histologier [2], [6], [14]. Således er det ukendt, hvis den molekylære profil sporadisk versus familiær kræft i skjoldbruskkirtlen er anderledes. Desuden er det også ukendt, hvis der er en molekylær basis for tidligere alder debut og mere aggressiv sygdom opførsel observeret i FNMTC forhold til sporadisk sygdom [6], [15], [16].

MikroRNA’er ( miRNA) er små (~21-nukleotid-lang) kodende RNA, som regulerer genekspression og spiller en væsentlig rolle i mange biologiske processer, herunder tumorigenese [1] – [2]. En specifik miRNA kan fungere enten som et onkogen eller som en tumorsuppressor ved at regulere ekspressionen af ​​target onkogen (er) og tumor-suppressor gen (er), henholdsvis. I de fleste tilfælde miRNA binder til 3′-utranslaterede regioner (3′-UTR’er) af mål-mRNA’er, der fører til mRNA nedbrydning eller undertrykkelse af translation. I kræft i skjoldbruskkirtlen, har en fælles enkelt-nukleotid polymorfisme i præ-MIR-146a blevet rapporteret at inhibere modne miRNA ekspression og øge risikoen for at udvikle papillær thyroidcancer [17]. Så vidt vi ved, har ingen undersøgelser udført sammenligne miRNA profiler af familiære og sporadiske kræft generelt og specifikt til kræft i skjoldbruskkirtlen.

I denne undersøgelse har vi udført miRNA profilering af familiære og sporadiske papillær kræft i skjoldbruskkirtlen tumor prøver. Vi fandt, at MIR-886-3p blev nedreguleret i papillær thyreoideacancer sammenlignet med normalt og udtrykkes forskelligt i familiær papillær thyreoideacancer sammenlignet med sporadisk papillær kræft i skjoldbruskkirtlen. Pathway analyse af genom-dækkende udtryk data om celler, der overudtrykker miR-886-3p og target forudsigelse analyse viste gener involveret i DNA-replikation og fokal vedhæftning vej blev reguleret af miR-886-3p. Faktisk overekspression af miR-886-3p i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer betydeligt hæmmet cellulær proliferation, antallet og størrelsen af ​​sfæroider og migration.

Materialer og Metoder

Thyroid vævsprøver

Thyroid vævsprøver blev lynfrosset i flydende nitrogen ved thyroidectomy. The National Cancer Institute Review Board godkendte denne forsøgsprotokol efter informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle deltagere. Alle vævsprøver blev underkastet yderligere histologisk bedømmelse af en endokrin patolog at bekræfte diagnosen og identificere prøver med mere end 80% af tumorcellerne. Vi brugte 28 konventionelle papillære kræft i skjoldbruskkirtlen tumor prøver (21 sporadisk, 7 familiær) og 10 normale skjoldbruskkirtlen vævsprøver for miRNA-array profilering. En familie historie spørgeskema blev brugt til at fastslå, om tumorer bør kategoriseres som sporadisk eller familiær. FNMTC blev defineret, når 2 eller flere første slægtninge blev ramt med kræft i skjoldbruskkirtlen af ​​follikulært celle oprindelse. Tilfælde af kræft i skjoldbruskkirtlen blev bekræftet i påvirket familiemedlemmer. Alle de FNMTC tumorprøver var fra forskellige familier. I 5 af 7 tumor prøver af FNMTC der var tre første slægtninge berørte og i 2 af 7 var der to første slægtninge påvirket. De tumor prøver blev matchet for alder (+/- 2 år), køn og TNM stadium af kræft (ved en 3:01 forhold af sporadiske-til-familiær tilfælde).

miRNA microarray

i alt 28 mikroarrays (Exiqon ™) blev kørt sammenligne både familiære og sporadiske papillær skjoldbruskkirtelkræft til en pulje af normal skjoldbruskkirtel væv. Loggen

2-forhold af Cy5 at Cy3-intensitetssignalerne blev beregnet for hver miRNA på hver array (med ingen baggrund subtraktion) og dataene blev normaliseret ved print spids løss normalisering [18], [19]. Da enkelte miRNA var repræsenteret ved fire sonder på array, blev medianen normaliserede log forholdet mellem replikere sonder

2 (for dem med mere end én unflagged sonde), der anvendes som værdien for miRNA. Den sammenfattet log

2 nøgletal for hvert forsøg blev derefter brugt i modererede t-statistik og p-værdi beregning ved hjælp af limma pakke i R /BioConductor [20], [21] med justering for falsk opdagelse sats ved hjælp af Benjamini-Hochberg fremgangsmåde [22]. Mirna microarray data, som er MIAME kompatibel, er blevet deponeret i GEO-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

humant thyreoideastimulerende cancercellelinier FTC-133 (follikulær thyreoideacancer) og TPC-1 (papillær thyroidcancer) blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) med 4.500 mg /l D-glucose, L-glutamin og 110 mg /L natriumpyruvat) suppleret med 10% serum, thyreoidea-stimulerende hormon (TSH) (10 mU /ml), penicillin (10.000 U /ml), streptomycin (10.000 U /ml), Fungizone (250 mg /ml) og insulin ( 10 (mg /ml) i en standard befugtet inkubator ved 37 ° C i en CO 5%

2 og 95% O

2 atmosfære. Begge cellelinjer er etableret og bekræftet kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. The TPC-1-cellelinien blev tilvejebragt af Dr. Nabuo Satoh (Japan) og FTC-133-cellelinien blev tilvejebragt af Dr. Peter Goretzki (Tyskland). Serum fri medier (DMEM- F12-medium) suppleret med 4 hormoner (insulin [10 ug /ml], somatostatin [10 ng /ml], transferrin [5 ug /ml], og hydrocortison [0,36 ng /ml]) blev anvendt til de funktionelle studier.

miRNA transfektion

Ældre miRNA forløber (pre-miR-886-3p, Applied Biosystems, Foster City, CA) blev transficeret i celler ved hjælp af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) efter producentens anvisninger . En tilfældig sekvens pre-miR (præ-MIR-negativ kontrol) (Applied Biosystems) blev anvendt som negativ kontrol (MIR-NC).

RNA-isolering og kvantitativ real-time RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. TaqMan miRNA Assays (Applied Biosystems) blev anvendt til at måle miRNA ekspressionsniveauet. Totalt RNA blev revers transkriberet med en miRNA-specifik primer, efterfulgt af realtids-PCR med TaqMan prober. U6 blev anvendt som den endogene kontrol. Den relative mængde af mRNA’er blev bestemt under anvendelse TaqMan assay (Applied Biosystems) på en ABI 7900 HT system, ved hjælp humant GAPDH som en endogen kontrol. Den ΔΔ Ct fremgangsmåde blev anvendt til beregning ekspressionsniveauer.

Proliferationsassay

Celleproliferation blev bestemt under anvendelse CyQUANT celleproliferationsassay (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Fluorescensintensiteten blev målt ved hjælp af en fluorescens mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Migration assay

vandrende evne skjoldbruskkirtlen cancerceller blev vurderet af bunden sår assay i celler dyrket i monolag. Ca. 150.000 celler blev transficeret med præ-MIR-886-3p (25 nM) eller MIR-NC (25 nM) og derefter udpladet i plader med 6 brønde og fik lov til at vedhæfte og vokse i 44 timer. Derefter blev tre lodrette sår lavet med en steril 10 pi pipettespids og en vandret linje blev foretaget på tværs af de tre linjer tillade registrering af celler i samme punkt. Cellerne blev inspiceret hver 6. time og målinger op til 22 timer fra den oprindelige sår.

Genom-dækkende mRNA-ekspression microarray

TPC-1 celler blev transficeret med præ-MIR-886- 3p og præ-mIR-NC. Tooghalvfjerds timer efter transfektion blev cellerne vasket tre gange med PBS. Totalt RNA blev fremstillet ud fra tredobbelte cellekulturer under anvendelse af RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) kit ifølge producentens anvisninger. RNA kvalitet blev sikret, før mærkning ved hjælp af Agilent RNA 6000 Nano kit og Bioanalyzer 2100. Et hundrede halvtreds ng af total RNA blev anvendt til at udføre cDNA revers transkription, syntese, amplifikation, fragmentering og terminal mærkning med GeneChip WT Sense Target Mærkning og Kontrol Reagenser (Affymetrix, Santa Clara, CA). Ca. 25 ng /pi cDNA blev hybridiseret til Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array GeneChip. De arrays blev vasket og farvet ved hjælp af fluidik protokol FS450_0007 procedure på en Affymetrix Fluidik Station 450. probe intensiteter blev scannet af GeneChip Scanner 3000. De rå data blev normaliseret og analyseret ved hjælp af Partek Genomisk Suite (Partek Inc., St. Louis, MO , USA). Variansanalyse blev anvendt til at bestemme disse probesæt signifikant forskellig mellem de to grupper. Genet liste blev filtreret med en fold-change afskæring på 2. Dette resulterede i produktion af gen liste med gener, der har betydelig differentiel ekspression på P≤0.001 og 2 gange eller flere forskelle. Pathway-analyse blev udført ved anvendelse David bioinformatik ressourcer.

Cell cyklus flowcytometrianalyse

Virkningerne af MIR-886-3p overekspression på cellecyklusprogression blev vurderet ved anvendelse af propidiumiodid flowcytometri. Kort beskrevet blev TPC-1 og FTC-133-celler transficeret med præ-MIR-886-3p eller præ-MIR-NC i 72 timer til 120 timer. Cellerne blev vasket med PBS, høstet, og fikseret i 70% ethanol. Derefter blev cellerne behandlet med (500 U /ml) DNase-fri RNase og farvet med propidiumiodid. Celleprøver blev analyseret på en FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA), og G

0G

1, S og G

2M fase fraktioner blev bestemt under anvendelse ModFitLT software (Topsham, ME).

Apoptose flowcytometri analyse

virkningerne af miR-886-3p overekspression på celledød blev vurderet af Annexin V- FITC og propidiumiodid flowcytometri bruge ApoAlert Annexin V (Clontech, Mountain View, CA). TPC-1 og FTC-133-celler blev transficeret med præ-MIR-886-3p eller præ-MIR-NC i 72 timer til 120 timer. Cellerne blev høstet og farvet med Annexin V- FITC og propidiumiodid ifølge fabrikantens protokol. Celleprøver blev analyseret på en FACSCalibur, og apoptotiske fraktioner blev bestemt.

Luciferase Reporter Assay

1160 basepar 3′-UTR af

CDC6

blev klonet ind i det tomme luciferase reporter vektor pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), generering af et vildtype

CDC6

UTR luciferase-reporterkonstruktion (pEZX-WT-UTR). Mutationer i 3′-UTR af

CDC6

blev udformet for de første fire nukleotider (CACC til GTGG) eller de sidste tre nukleotider (CGC til GCG) af 7-mer frø region af det formodede bindingssted miR-886-3p, genererer to mutanter betegnes som pEZX-Mut-UTR-01 og pEZX-Mut-UTR-02, hhv. Alle konstruktioner blev sekvensspecifik verificeret ved DNA-sekventering. For den dobbelte luciferase-assayet blev TPC-1-celler udpladet i tredobbeltbestemmelse i 12 brønd plader og co-transficeret med 0,25 ug af reporterkonstruktet og 15 pmol af præ-MIR-886-3p eller præ-MIR-NC ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Efter 24 timer blev cellerne lyseret og analyseret for både ildflue og Renilla luciferase under anvendelse Luc-Pair ™ miR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) på en SpectraMax M5E mikropladelæser (Molecular Device, Sunnyvale, CA) i overensstemmelse med producentens ‘anvisninger.

Dataanalyse

data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien. For at bestemme statistisk signifikans blev Mann-Whitney U test, t-test og variansanalyse anvendes efter behov. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Resultater

miRNA profilering af sporadisk og familiær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen

Vi sammenlignede miRNA udtryk profil familiær og sporadisk papillær kræft i skjoldbruskkirtlen tumorprøver anvender hel-genom miRNA microarray analyse. Prøverne blev matchet baseret på alder og køn af patienterne, og TNM tumor fase. Mirna ekspression i tumorprøver blev sammenlignet med normale skjoldbruskkirtlen vævsprøver. Der var 232 miRNA i sporadisk og 135 miRNA ved familiær papillær thyroidcancer, som blev dysreguleret sammenlignet med normale skjoldbruskkirtlen vævsprøver (figur 1A) (p 0,05). Et hundrede ni af de dysregulerede miRNA var unik for sporadisk, 13 var enestående for Familiær, og fire miRNA blev væsentligt differentielt udtrykt mellem sporadisk og familiær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen (figur 1A og 1B). To af de fire miRNA blev valideret at være signifikant differentielt udtrykt mellem familiær og sporadisk papillær thyroidcancer ved kvantitativ realtids RT-PCR (figur 2). Både MIR-20a og MIR-886-3p blev også signifikant nedreguleret i sporadisk cancer papillær skjoldbruskkirtlen sammenlignet med normal thyroid væv (p = 0,032 og p = 0,0032, henholdsvis) (figur 1B).

A) Sammenligning af udtrykkes forskelligt miRNA i sporadisk og familiær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen i forhold til normal skjoldbruskkirtel væv. Den sporadiske cirkel angiver denne gruppes forhold til normale thyreoideavæv den familiær cirkel angiver denne gruppes forhold til normale thyreoideavæv og familiær-sporadisk cirkel indikerer sammenligning mellem familiære og sporadiske tumorer. B) Relativ procent miRNA udtryk forskellen mellem familiære og sporadiske tumorer normaliseret til normale vævsprøver. * P-værdi. 0,05

MIR-20a var 4 gange og miR-886-3p var 3 gange højere i familiær papillær kræft i skjoldbruskkirtlen i forhold til sporadisk (p = 0,025 for miR-20a , p = 0,028 for mIR-886-3p, p = 0,37 for mIR-195, p = 0,46 for mIR-29c). Værdier er gennemsnitlige udtryk plus og minus standardafvigelsen af ​​middelværdien. Y-aksen repræsenterer forholdet mellem miRNA og U6 RNA ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode, og den laveste værdi af prøven blev sat til 1,0.

Target gener og veje for MIR-886- 3p i skjoldbruskkirtlen kræftceller

i betragtning af den funktion miR-886-3p i tumor cellebiologi er ukendt, var vi først interesseret i at bestemme target gen (er) og sti (er), der kan reguleres ved miR -886-3p. Vi anvendte to fremgangsmåder til bestemmelse MIR-886-3p mål: miRNA target forudsigelse og hele genomet mRNA-ekspression analyse i celler overudtrykker MIR-886-3p (figur 3). Vi fandt 730 forudsagde target gener for miR-866-3p bruger mål forudsigelse databaser (Miranda, miRBase, Target-scanninger). Ved at udføre Kegg pathway analyse af mRNA dysreguleret i miR-886-3p mindre under udtrykte celler, fandt vi gener involveret i DNA-replikation og fokale vedhæftning veje blev fejl-udtrykt på miR-886-3p overekspression i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer. Integration af disse bioinformatik tilgange identificeret seks gener i fælles mellem analyserne. Disse gener er derfor forventes at være miR-886-3p mål.

For yderligere at imødegå denne hypotese, valgte vi fire af disse gener for validering upon miR-886-3p overekspression. Vi fandt signifikant nedregulering af alle fire gener upon MIR-886-3p overekspression ved kvantitativ RT-PCR (figur 4). Af disse gener, vi var især interesseret i

CDC6

da dette gen koder for en potent regulator af DNA-replikation og onkogenese [27]. Interessant nok viste western blot-analyse nedregulering af

CDC6

proteinekspression inden for 72 timer MIR-886-3p overekspression (figur 5). For yderligere at vurdere, om

CDC6

er et direkte mål for miR-886-3p regulering, transfektion af 3’UTR

CDC6

vildtype vektor i skjoldbruskkirtlen cancerceller med miR-886-3p overekspression viste signifikant nedregulering af luciferaseaktivitet tyder på, at

CDC6

var et direkte mål for miR-886-3p (figur 6). Mutationer i den forudsagte frø region for miR-886-3p i 3’UTR af

CDC6

afskaffet denne effekt, yderligere tyder på, at miR-886-3p direkte regulerer

CDC6

udtryk (figur 6 ).

Transfektion af præ-miR-886-3p faldt betydeligt mRNA niveauerne af fire målgener (

CDC6

,

PIP5K1C

,

PXN

,

ZYX

) i A) TPC-1-cellelinien og B) FTC-133 cellelinje (* p 0,05; ** p 0,01). Y-aksen er forholdet mellem det specifikke målgen og GAPDH anvendelse af 2

-ΔΔCt metode, og værdien på MIR-NC gruppe blev sat til 1,0 for at tillade sammenligning af fold forskelle blandt forskellige cellelinier og gener.

A) repræsentative western blot image

CDC6

proteinekspression ved 72 timer efter transfektion med præ-mIR-886-3p sammenlignet med negativ kontrol (mIR-NC). B) Band densitometri kvantificering af

CDC6

proteinekspression. Den software ImageJ (Maryland, USA) blev anvendt til densitometrisk analyse af Western blotting.

A) pEZX-WT-UTR vektor med både Renilla luciferase (hRLuc) blev anvendt som en intern kontrol og ildflueluciferase (hLuc) var opstrøms for 3′-UTR-konstruktionen. B) Formodede bindende site af MIR-886-3p på

CDC6

3’UTR sammen med mutationerne i det forudsagte frø region. C) Venstre figur viser luciferaseaktivitet af pEZX-WT-UTR i TPC-1-celler ved co-transficeret med præ-MIR-886-3p eller præ-MIR-NC, s 0,05. Midterste og højre tal showluciferase aktivitet af pEZX-Mut-UTR-01 og pEZX-Mut-UTR-02 i TPC-1-celler ved co-transficeret med præ-MIR-886-3p eller præ-MIR-NC hhv. Alle luciferase målinger blev foretaget i tre eksemplarer og aflæsninger blev udført ved 24 timer efter transfektion.

MIR-886-3p regulerer cellecyklus og spredning, og kugleformet dannelse og migration

Fordi vi fandt miR-886-3p regulerer gener involveret i DNA-replikation og fokale vedhæftning veje, vi var interesserede i at bestemme rollen som miR-886-3p på cellecyklus og celleproliferation, samt, kugleformet dannelse og migration. Vi først bestemmes den basale udtryk for miR-886-3p i fire velkarakteriseret og autentificeret kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer og fandt, at FTC-133 og TPC-1 havde højeste og laveste niveau af miR-886-3p udtryk, henholdsvis (figur 7A ). Vi anvendte disse cellelinier til at analysere virkningen af ​​MIR-886-3p på celleproliferation. Overekspression af MIR-886-3p signifikant inhiberede celleproliferation med 79% i FTC-133-celler efter 144 timer (p 0,001) og 77% i TPC-1-celler på 120 timer (p 0,001) sammenlignet med præ-miR- NC (Figur 7B).

A) Baseline udtryk for miR-886-3p i fire kræft i skjoldbruskkirtlen linjer. B) Effekt af miR-886-3p overekspression på kræft i skjoldbruskkirtlen celleproliferation. Pre-MIR-886-3p signifikant hæmmet kræft i skjoldbruskkirtlen celleproliferation. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse for middelværdi. * P≤0.001.

I betragtning af den dybtgående virkning af miR-886-3p overekspression på cellulær proliferation, vi ønskede at næste udforske mekanismen for miR-886-3p medierede væksthæmning. Vi således udført flowcytometri og Annexin V assays til bestemmelse af virkningen af ​​MIR-886-3p på cellecyklusprogression og apoptose hhv. Overekspression af MIR-886-3p markant stigning i antallet af celler i S-fase (12-16%), mens mindske antallet af celler i G

0 /G

1 (11-22%) (p 0,001 ). Vi fandt imidlertid ingen signifikant stigning i antallet af celler i apoptose med og uden MIR-886-3p overekspression. Disse data tyder på, at miR-886-3p regulerer cellecyklus og spredning i overensstemmelse med vores miR-886-3p vej og mål forudsigelse analyser.

Fordi miR-886-3p vej og mål analyser viste gener, der regulerer omdrejningspunkt vedhæftning var fejl-udtrykt, vi også bestemt effekten af ​​miR-886-3p overekspression på kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinje klumpformet dannelse og cellulære migration. FTC-133 cellelinjen danner sfæroider ved dyrkning i ultralow adhærente dyrkningskolber inden for 72 timer. Overensstemmelse med virkningen af ​​MIR-886-3p overekspression i monolag celler observerede vi et fald i antallet og størrelsen af ​​sfæroider i FTC-133 thyreoideacancer cellelinie, som blev opretholdt i op til 2 uger i kultur (figur 8). Derudover MIR-886-3p overekspression faldt de multiple cellulære gren-lignende strukturer observeret i de negative kontrolceller. Derefter bestemte vi effekten af ​​MIR-886-3p overekspression på den cellulære migration under anvendelse af scratch såret assay. Overekspression af MIR-886-3p signifikant inhiberede vandring af TPC-1-cellelinien (p 0,001) (figur 9)

Pre-MIR-886-3p reducerede størrelsen og antallet af sfæroider i FTC. -133 cellelinie. A) Repræsentant billede af sfæroider i kultur med miR-886-3p overekspression. B) Kvantificering af sfæroide forskel med MIR-886-3p overekspression. Det samlede areal besat af sfæroider i et billede blev målt ved omgiver omkredsen af ​​hver sfæroide, mærkning hele området, og beregning af pixel tal ved hjælp ImageJ software (Maryland, USA). Forsøgene blev gentaget tre gange, og lignende resultater blev observeret. (*** Angiver p 0,001).

Pre-miR-886-3p faldt betydeligt celle migration på 22 timer (p 0,001). A) repræsentativt billede af sår assay til tiden 0 og 22 timer efter bunden. B) Kvantificering af viklet bredde lukning med MIR-886-3p overekspression. Seks forskellige steder blev visualiseret og fotograferet under et fase-kontrast omvendt mikroskop (10 ganges forstørrelse) i hver plade på forskellige tidspunkter, og tre plader blev anvendt til hver gruppe. Såret bredde i de 10 × billeder blev målt under anvendelse af en standard skydelære. Forsøgene blev gentaget tre gange, og lignende resultater blev observeret. (*** Angiver p 0,001).

Diskussion

I denne undersøgelse har vi udført miRNA profilering af familiære og sporadiske papillær kræft i skjoldbruskkirtlen tumor prøver. Vi fandt fire miRNA udtrykkes forskelligt mellem disse grupper, hvoraf to, MIR-886-3p og MIR-20a blev valideret at være differentielt udtrykt af 3- og 4-gange. Begge disse miRNA blev nedreguleret i papillær thyreoideacancer sammenlignet med normal thyroid væv ved 3,5-4 gange. Genom-dækkende genekspression vej og mål forudsigelse analyser påvist gener involveret i DNA-replikation og fokale vedhæftning veje blev rettet af miR-886-3p. Overekspression af miR-886-3p i skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer betydeligt hæmmet cellulær proliferation, antallet og størrelsen af ​​sfæroider, og cellulær migration. Desuden overekspression af miR-886-3p øget antallet af celler i S-fasen og faldt antallet af celler i G

0G

1 fase med ingen effekt på apoptose.

Vi er ikke bekendt af andre undersøgelser, der har sammenlignet den miRNA profilen af ​​tumorer, der er forbundet med familiær cancer syndromer med deres sporadisk forekommende modstykker. En sådan analyse giver et vigtigt indblik i de genetiske veje, der kan være forskellige i histologisk lignende tumorer, de vigtige mål for disponerende genetiske ændringer, og i tilfælde af FNMTC, den molekylære basis. Selv om de fleste forskere har foreslået, at FNMTC er et særskilt arvelig syndrom, argumenter mod dette omfatte, at 1) den samme følsomhed gen (er) og eller ikke er blevet observeret loci over adskillige bindingsstudier, 2) ikke-maligne skjoldbruskkirteltumorer er almindelige og dermed en skjoldbruskkirtlen kræftdiagnose kan være en grundlæggervirkning eller i øvrigt opdaget, og 3) ekspressivitet er variabel [2]. På den anden side, understøtter flere undersøgelser FNMTC som en særskilt arvelig syndrom fordi, 1) flere slægter er blevet rapporteret at have multigenerational forekomst af FNMTC, 2) der er en højere sats for kræft i skjoldbruskkirtlen hos mænd og børn inden FNMTC stamtavler, 3 ) der er en tidligere alder for præsentation, og 4) der er mand-til-mand transmission. Endelig epidemiologiske undersøgelser viser, at risikoen for kræft i skjoldbruskkirtlen i en første grads slægtning af en patient diagnosticeret med kræft i skjoldbruskkirtlen er 5-fold højere [28]. I betragtning af denne kontrovers, vi satte sig for at bestemme, om udtrykket profiler af familiær og sporadisk papillær kræft i skjoldbruskkirtlen var anderledes. Et stort antal miRNA blev dysreguleret i både familiær og sporadisk papillær thyreoideacancer sammenlignet med normal thyroid væv. Vi udførte miRNA profilering i tumor prøver fra patienter, som blev matchet for alder, køn og TNM kræft scenen. En sådan fremgangsmåde blev brugt til at minimere forstyrrende faktorer, der kan medføre forskellige miRNA udtryk profil på grund af forskellig grad af sygdom, histologiske undertyper af tumor, og differentiering status for tumor [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Derfor mener vi, vores omhyggelig undersøgelse design og analyse giver resultater, som for første gang, understøtter en molekylær forskel i familiær og sporadisk papillær kræft i skjoldbruskkirtlen.

Blandt de differentielt udtrykte miRNA mellem familiær og sporadisk papillær kræft i skjoldbruskkirtlen, to miRNA valideret at være differentielt udtrykt af kvantitativ RT-PCR. Både miR-20a (13q31.3) og miR-886-3p (5q31.2) ikke er placeret i kromosomale loci tidligere identificeret som modtagelighed loci ved sammenkædning studier i Slægter med FNMTC. Betragtning af de små nucleotid længder af miRNA, er det ikke overraskende, at genetiske ændringer i den kromosomale loci koder for MIR-20a og MIR-886-3p kan have været savnet i disse undersøgelser, selv med brug af høj opløsning SNP arrays [13]. I fremtiden kan kønsceller sekvensanalyse bruges til at afgøre, om disse miRNA er kandidat modtagelighed gener for FNMTC. Derudover vil det være vigtigt at afgøre, i fremtidige undersøgelser mekanismen for den generelle MIR-886-3p nedregulering i kræft i skjoldbruskkirtlen skyldes kopiere nummer variation, inaktivere mutationer eller sletning.

Vi var interesseret i at studere den rolle af miR-886-3p i skjoldbruskkirtlen carcinogenese af flere grunde. Hovedsageligt, funktionen af ​​MIR-886-3p er ukendt, er MIR-886 genets kromosomal placering på 5q31 delt med transformerende vækstfaktor β1, en vigtig regulator i epitel carcinogenese, og niveauet af MIR-886-3p ekspression forskel mellem familiær og sporadisk papillær kræft i skjoldbruskkirtlen var stort (3 gange). I overensstemmelse med vores resultater, viste en nylig undersøgelse MIR-886-3p blev nedreguleret i planocellulært lungecancer sammenlignet med normalt lungevæv, hvilket antyder en potentiel tumor suppressor rolle for denne miRNA [5]. Anvendelse af to velkarakteriserede skjoldbruskkirtlen cancercellelinier med forskellige niveauer af basal MIR-866-3p ekspression, demonstreret vi, at MIR-886-3p spiller en kritisk rolle i cellulær proliferation og migrering, og regulerer gener involveret i DNA-replikation og fokal adhæsion pathways. Vi valgte

CDC6

, en potent regulator af DNA-replikation og onkogenese [27], til yderligere analyse og fandt, at

CDC6

var et direkte mål for miR-886-3p. Selv om vores funktionelle studier blev udført i skjoldbruskkirtlen kræft linjer, vores data tyder på, at miR-886-3p er en vigtig regulator af tumor cellebiologi i kræft i skjoldbruskkirtlen [26].

Overekspression af miR-886-3p forårsagede dramatisk ændringer i ekspression af gener, der regulerer DNA-replikation og fokal adhæsion. Fire gener (

CDC6

,

PIP5K1C

,

PXN

,

ZYX

) havde 4 gange knockdown med øget miR-886-3p udtryk .