PLoS ONE: Molekylær underskrifter prostata stamceller Reveal Novel signalveje og give indsigt i Prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

De globale genekspression profiler af voksne og føtale murine prostata stamceller var fast besluttet på at fastlægge fælles og unikke regulatorer hvis misexpression kunne spille en rolle i udviklingen af ​​prostatakræft.

Metodologi /vigtigste resultater

et karakteristisk kerne af transkriptionelle regulatorer fælles for både føtal og voksne primitive prostata celler blev identificeret såvel som molekyler, der er eksklusivt for hver population. Fælles bestanddele føtale og voksne prostata stamceller indbefatter udtryk profiler af Wnt, Shh og andre veje identificeret i stamceller fra andre organer, underskrifter af aryl-carbonhydrid-receptoren, og opregulering af komponenter af aldehyddehydrogenase /retinoidsyrereceptor akse . Der er også en betydelig lipidmetabolisme signatur, præget af overekspression af lipid enzymer og tilstedeværelsen af ​​det bindende motiv for Srebp1. Den føtale stamceller befolkning, kendetegnet ved en hurtigere spredning og selv-fornyelse, udtrykker regulatorer af cellecyklus, såsom E2F, Nfy, Tead2 og Ap2, på et højt niveau, mens voksne stamceller viser en signatur, hvor TGF-β har en fremtrædende rolle. Endelig sammenligning af underskrifter fra primitive prostata celler med tidligere beskrevne profiler af humane prostata tumorer identificerede stamceller molekyler og veje med deregulerede udtryk i prostata tumorer, herunder kromatin modifikatorer og onkogen, Erg.

Konklusioner /Betydning

Vores data indikerer, at voksen prostata stam- eller progenitorceller kan erhverve karakteristika af selvfornyende primitive føtale prostataceller under onkogenese og foreslå, at afvigende aktivering af komponenter af prostata stamcelle pathways kan bidrage til udviklingen af ​​prostatatumorer.

Henvisning: Blum R, Gupta R, Burger PE, Ontiveros CS, Salm SN, Xiong X, et al. (2009) Molekylær underskrifter Prostata stamceller Reveal Novel signalveje og give indsigt i prostatakræft. PLoS ONE 4 (5): e5722. doi: 10,1371 /journal.pone.0005722

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Februar 13, 2009; Accepteret: April 3, 2009; Udgivet: May 29, 2009

Copyright: © 2009 Blum et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health, CA132641 (ELW), CA 90.593 (DM), National Research service Award (NRSA) fra National Institutes of Health, National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme, 5F32DK071468 (CSO), Amgen Inc. og Helen L og Martin S Kimmel center for Stem Cell Biology ved NYU School of Medicine. Amgen forskere havde en rolle i denne undersøgelse ved at deltage i analysen af ​​data og i udarbejdelsen af ​​RNA anvendt i mircroarray eksperimenter. Ingen andre finansieringskilder havde en rolle i denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Blandt andet støtte dette arbejde blev også støttet af en forskningsbevilling fra Amgen Inc. (Der er ingen tal for dette tilskud). En række af vores Amgen kolleger var også samarbejdspartnere på dette projekt. Disse samarbejdspartnere deltog i analysen af ​​microarray data og ved fremstillingen af ​​RNA’et anvendt i microarray eksperimenter. Den specifikke rolle hver forfatter er detaljeret i det relevante afsnit helliget roller forfatterne.

Introduktion

Det er sandsynligt, at den afvigende proliferation af prostata stamceller (PSC) og /eller deres stamceller bidrager til prostata patologi. Vi bestemt de genekspression underskrifter føtal og voksen PSC (FPSC og APSC) for at få indsigt i de signalveje, der kendetegner disse to normal stamcelle (SC) populationer og sammenlignet disse profiler med de prostata tumorceller. Afgrænse disse regulerende veje kan give indsigt i de mekanismer, der konverterer hvilende voksen prostata celler i en prolifererende rum, der giver anledning til benign prostatahyperplasi og carcinom således tillader målretningen af ​​specifikke veje til at behandle disse sygdomme.

Vi har vist at epitelceller med SC funktioner er koncentreret i den proximale duktal region, der støder op til urinrøret [1] – [3]. Disse funktioner omfatter ubevægelighed, høj proliferativ potentiale og evne enkeltceller at give anledning til duktale strukturer, der indeholder både basal og luminale celler [2] – [4]. Vi har tidligere isoleret, baseret på ekspressionen af ​​Sca-1 [2], to populationer af celler, der er i stand til at regenerere prostatavæv i en

in vivo

prostata rekonstituering assay. Den første population, stamceller, har betydeligt vækstpotentiale, ikke kræver androgen for overlevelse, udtrykker høje niveauer af Sca-1 og bor i det proximale område af kanaler. Næsten alle Sca-1

Hi-celler også udtrykker α6 integrin, et antigen udtrykt på primitive prostata celler [2] – [4]. Den anden befolkning, transit-forstærke celler, har mere begrænset vækstpotentiale, udtrykker lavere niveauer af Sca-1, kræver androgen for overlevelse og findes i alle duktale regioner [2], [3]. En tredje population, føtale prostata stamceller, eksisterer i det urogenitale sinus hvorfra prostata udvikler [5]. Det indre lag af epitelceller i murine urogenital sinus begynder invaderer det ydre lag af mesenkym til dannelse af kanaler i prostatakirtlen efter E16. Forud for denne begivenhed, kan det urogenitale sinus epitel (UGE), der indeholder primitive føtale prostata celler isoleres let fra det urogenitale sinus.

For at identificere molekyler og veje, der er aktive i primitive prostata befolkninger vi bestemt den transkriptionelle profiler af fire populationer af celler: (i) UGE, beriget med FPSC, (ii) Sca-1

Hej, celler, der udtrykker høje niveauer af Sca-1, beriget i APSC [2], [6], (iii ) Sca-1

Lo, celler, der udtrykker medium til lave niveauer af Sca-1 og er beriget med transit-forstærke celler [2], og (iv) Sca-1

Neg, celler uden Sca-1 ekspression, der repræsenterer den mest modne befolkning og har næsten ingen regenerative potentiale [2]. For at få indsigt i de lovgivningsmæssige lag af transkriptionelle netværk er aktive i primitive prostata celler, vi udførte en beregningsmæssige skærm af cis-regulerende promoter motiver [7] for at afsløre dem, der er væsentligt beriget blandt de PSC gener. Vi identificerede også funktionelle gen kategorier, der er beriget i de primitive celler.

De føtale og voksne SC befolkninger udtrykte adskillige kendte SC-relaterede gener. Vores analyse viste betydelig berigelse af flere transskription faktor (TF) -bindingssite motiver i initiativtagerne til udtrykte gener. Dataene viser, at FPSC og APSC har unikke og fælles transkriptionelle programmer og identificere en række af de vigtigste funktioner, der kan opretholdes og selv-fornyelse af udifferentierede tilstand. En række af de stamcelle-relaterede gener vi identificerer kan også deltage i udviklingen af ​​prostatatumorer, hvilket indikerer, at disse molekyler kan afgrænse en undergruppe af tumorer med en mere primitiv og muligvis en mere aggressiv fænotype.

Materialer og Metoder

Cell forberedelse, antistoffer og FACS-analyse

Etik erklæring.

Alle dyr pleje og procedurer blev udført i overensstemmelse med New York University institutionelle gennemgang board krav.

proximale område af prostata kanaler (dvs. den del af kanalerne nærmeste urinrøret) af 6 uger gamle C57BL /6-mus blev spaltet, og celler blev undersøgt for antigenekspression (tabel S1) [1], [2]. SCA-1-mærkede celler blev sorteret ved FACS under anvendelse af en DakoCyomation MoFlo sorteringsanlæg i 3 populationer ifølge gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) på Sca-1-ekspression [2]. Celler (10.000-50.000) med den højeste MFI (25% Sca-1

Hej), medium /lav MFI (40%; Sca-1

Lo), og dem der mangler Sca-1-ekspression (25%; Sca-1

Neg) blev opsamlet i TRIzol (Invitrogen). UGE blev isoleret fra den urogenitale sinus af 16 dage gamle C57BL /6 murine embryoer [8] og tilsat til TRIzol. Ekspressionsniveauerne af ALDH blev bestemt ved FACS-analyse efter farvning med Aldefluor reagenskittet (StemCell Technologies).

Real-Time PCR

Et ug totalt RNA blev revers-transkriberet ved 52 ° C i 1 time under anvendelse af Thermoscript RT-PCR-system (Invitrogen). 20 ng resulterende cDNA blev anvendt i en Q-PCR-reaktion ved anvendelse af en iCycler (Biorad) og præ-konstruerede TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems). Cyklus tærskelværdier fra tre separate RNA-prøver blev midlet; mængder mål blev interpoleret fra standard kurver og normaliseret til hypoxanthin ninphosphoribosyltransferase.

RNA isolering og microarray hybridisering

Vi har etableret transkriptionelle profiler til UGE, Sca-1

Hej, Sca- 1

Lo, og for den Sca-1

Neg differentierede celler. Tre gentagelser af UGE (FPSC) og Sca-1

Hi (APSC) prøver og fire gentagelser af Sca-1

Lo og Sca-1

Neg prøver blev analyseret. RNA blev isoleret ved standardprocedurer og dets kvalitet blev vurderet ved anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Prøver med et RNA Integritet nummer (RIN) 7,0 blev anset for egnede mærkning og 20 ng blev mærket ved hjælp af GeneChip to-cycle target mærkning kit (Affymetrix). Ti mikrogram mærket og fragmenteret cRNA blev derefter hybridiseret til musegenomet MOE430 2.0 array (Affymetrix), der forespørger ~45,000 transkripter. Rå udtryk data (CEL filer) blev dannet ved anvendelse GCOS 1,4 (Affymetrix). De data, der behandles i denne publikation er deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE15580 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE15580) .

Analyse af genekspression data

ved hjælp ArrayAssist (Stratagene), blev rå Affymetrix CEL-filer behandles ved at anvende MAS5 algoritmen, at tildele afsløring opkald (Present /Marginal /Fraværende) for hver probe sæt, der efterfølgende blev anvendt i nedstrøms data filtrering. For at generere normaliserede ekspressionsniveauerne, vi brugte PLIER (sonde logaritmisk intensitet fejl) algoritme, en modelbaseret, multi array signal estimator, der producerer mere præcise probe-sæt signalværdier [9]. Kombinationen af ​​disse ovennævnte målinger blev anvendt til data filtrering for at opnå 33.967 “

gyldige gener

“, der repræsenterer udskrifter (gen prober) med signaler 20 og detekteret som stede i mindst én prøve. At opnå en delmængde af variable gener, beregnede vi variationskoefficienten (CV) for hver transkript og genererede et sæt af 5095 “

aktive gener Salg” indeholdende transkripterne med den højeste (15% af totalen) CV scorer. At fokusere på de gener, der er blevet ændret på en statistisk signifikant måde blev prøverne grupperet efter celletype (UGE, Sca-1

Hej, Sca-1

Lo, Sca-1

Neg), intensiteter af

aktiv gen

afskrifter var log2-transformeret og underkastes yderligere statistiske analyser brug af to forskellige prøver: (a) en-vejs ANOVA ved hjælp af en Benjamini-Hochberg korrektion (

s

0,05) og (b) betydning analyse af microarrays (SAM) metode med en falsk opdagelse sats på 5%. Dette gav en liste med 3137 “

væsentlige gener

“, der repræsenterer udskrifter som matcher kriterierne for begge disse statistiske tests. Et princip komponenter analyse (PCA) (gennemsnitlig centreret) beregnet af ArrayAssist, viste en passende reproducerbarhed og adskillelse inden for de forskellige typer af celler (Figur S1). For at definere de særlige karakteristika UGE, Sca-1

Hi og Sca-1

Lo befolkninger, vi sammenlignede genekspression intensitet læser (grupperede prøver) af hver af disse populationer med at af de mest differentierede voksne celler (Sca-1

Neg) ved hjælp af en uparret t-test (Benjamini-Hochberg korrigeret

s

0,05). Tre gen delmængder (UGE, Sca-1

Hi og Sca-1

Lo), der indeholder udskrifter, hvis ekspression forøget ( 1,75 gange) i forhold til deres udtryk i Sca-1

Neg celler blev genereret .

Analyse af funktionelle kategorier

Vi udnyttede funktionelle anmærkninger af murine gener, som det murine Genome Informatics, som bruger standard ordforråd indført ved Gene Ontology (GO) konsortiet. Beriget funktionelle kategorier (

s

≤0.01, efter korrektion for multiple test) blev identificeret i hver af de tre klynger (

UGE-kun

,

UGE + Sca-1

Hi

,

Sca-1

Hi-only

) using EXPANDER, hvor hypergeometric calculation anvendes til bestemmelse over-represented GO functional categories i en target set relative til en baggrundssættet (hele samling af formodede murine gener) [7]. For at undgå afvigelser, blev generne repræsenteret ved flere probesæt tælles kun én gang.

Computational analyse af promotor-cis-regulerende elementer

For promotor analyse anvendte vi EXPANDER [7] for at opdage cis-regulerende promotor elementer, der styrer de observerede transkriptionelle ændringer i genekspression klynger. Givet mål og baggrund sæt initiativtagere, EXPANDER udfører statistiske test til at identificere TF’er hvis binding-site signaturer er markant overrepræsenteret i målet i forhold til baggrunden (TF berigelse er angivet med

s

-værdi) [7 ]. Begge strenge af hver promotor blev scannet for formodede bindingssteder (der spænder over transskriptionsstartstedet fra 1000 bp opstrøms til 200 bp nedstrøms). De berigelser identificeret i denne undersøgelse var robuste, da de forblev stabile over et stort udvalg af tærskelværdier.

Sammenligning af data til kendte SC-profiler

Entrez Gene ID’er og UniGene entydige identifikatorer blev brugt at matche gener repræsenteret i forskellige microarray platforme. Vi scorede antallet af gener, der var almindeligt opreguleret i genekspressionsprofilerne og i mindst én anden SC profil.

Resultater og Diskussion

Profilering af genekspression i tre prostata stængel /stamceller beriget populationer

RNA blev isoleret fra de fire cellepopulationer beskrevet ovenfor (UGE, Sca-1

Hej, Sca-1

Lo og Sca-1

Neg), forberedt for hybridisering til mikroarrays og analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder. Tre gen delmængder (UGE, Sca-1

Hej, Sca-1

Lo) blev genereret bestående af udskrifter, hvis udtryk blev statistisk forhøjet i hver af de befolkningsgrupper i forhold til deres udtryk i den mest differentierede Sca-1

Neg cellepopulation (figur 1, tabel S2). FPSC delmængde har det højeste antal af markant ændrede udskrifter (1286 gen prober), som kan forventes, når man sammenligner en føtal SC med en differentieret voksen celle population. Den APSC delmængde (Sca-1

Hi) har 641 og transit-forstærke delmængde (Sca-1

Lo, mere differentieret end APSC delmængde) har kun 144 udskrifter, der er differentielt udtrykte. Vi derefter afgøres, om vi kunne skelne almindelige ekspressionsmønstre blandt disse tre progenitordelmængder og mønstre, der var unikke for hver delmængde. Skæringspunktet af de up-regulerede udskrifter inden for de tre delmængder resulterede i dannelsen af ​​fire klynger (

UGE-kun

,

UGE + Sca-1

Hej

,

Sca- 1

Hi-kun

,

Sca-1

Hi

+

Sca-1

Lo

) af indbyrdes eller udelukkende udtrykte gener (figur 1; Table S3). Det mest karakteristiske genekspression mønster blev afledt af UGE cellepopulationen, manifesteret ved 1050 udskrifter, der udelukkende blev overudtrykt i

UGE kun

klynge (FPSC klynge). Et andet karakteristisk mønster var tydelig i Sca-1

Hej delmængde, repræsenteret ved den eksklusive opregulering af 296 udskrifter i

Sca-1

Hi-kun

klynge (APSC klynge). Interessant, inden for klyngen, der overlapper mellem fosterets og de voksne delmængder,

UGE + Sca-1

Hej

klynge, fandt vi et stort antal af udskrifter (209), der var almindeligt opreguleret, mens mindre kompatibilitetsmæssige (112 udskrifter) blev observeret i klyngen, der overlapper (

Sca-1

Hi

+

Sca-1

Lo

klynge) mellem APSC delmængde (Sca- 1

Hi) og TA delmængde (Sca-1

Lo) (figur 1, tabel S2). Meget få udskrifter (5), blev markant overudtrykt i mere differentieret befolkning (

Sca-1

Lo-kun

klynge). Disse resultater skildrer fremtrædende fase-specifikke gentranskripter udtryk under modning af prostata celler, der starter fra den mest primitive føtal befolkning (UGE), og forløber gennem APSC befolkning (Sca-1

Hej), og dens afkom, transit -amplifying celler (Sca-1

Lo), og kulminerede med den mest differentierede delmængde (Sca-1

Neg).

En Venn diagram beskriver antallet af udskrifter (gen sonder) af overudtrykt gener deles og tydelig blandt UGE, Sca-1

Hi og Sca-1

Lo delmængder. Antallet af udskrifter inden for hver delmængde er givet i parentes uden for Venn diagram. Antallet af udskrifter inden for hver klynge er givet i kursiv inde i skiver af Venn diagram. Antal kommenterede gener er anført i hver af de fire klynger er angivet i den indsatte tabel. Den tilsvarende dendogram af hver klynge er præsenteret.

A. Ekspression af SC markører i prostata stængel /progenitor klynger

Vores profilering analyse viser, at alle tre stamceller /progenitor beriget delmængder indeholder et betydeligt antal kendte markører af murine PSC, nemlig

Trp63

,

CD200

,

Ctnnb1

,

Smo

,

Krt5

,

Krt14

,

Itga6

/

CD49f

,

CD44

,

Kit

,

Bcl2

, og

CD34

[10] (figur 2A, B, tabel S4). En sammenligning af 11 kendte PSC markører, der var opreguleret i vores delmængder med et panel af 15 almindelige murine husholdning gener, hvis udtryk blev ikke ændret, bekræfter, at vores profiler afspejler en bestemt transkriptionel underskrift primitiv FPSC og APSC (figur 2A; Table S4). Derudover udskrifter til en ephrin receptor,

Ephb3

og to ephrin ligander,

Efna5

Efnb2

, der fungerer som koordinatorer af migration og proliferation i tarm SC niche [11] er opreguleret i både FPSC og APSC populationer (figur 2B). FACS-analyse af Sca-1

Hi og Sca-1

Lo celler valideret forøget ekspression af flere stamceller antigener forudsagt af microarray (figur 3A), herunder stamceller markører a6 og p4 -integrins [12], keratin 5, Bcl-2, β-catenin [10], Sox2 [13] og CD34 [14] (figur 3B). Dette indikerer, at ændringer i mRNA niveauer af mange sc-markører afspejles af ændringer i deres proteinniveauer.

A. Udtryk profiler af molekyler, der er beskrevet som udtrykt i primitive prostata populationer, som blev opreguleret mindst 2 gange (øverste felt) i UGE, Sca-1

Hi og Sca-1

Lo celler præsenteres. Hver kolonne repræsenterer en individuel prøve, og hver række repræsenterer et specifikt gen. Rød (høj), grøn (lav) relativ udtryk; sort indikerer lige udtryk i forhold til Sca-1

Neg celler. Den nederste panel præsenterer en kassette af 15 almindelige murine husholdning gener, der manifesterer stabil ekspression på tværs af alle prøver. Log-forholdet (LR) værdier er vist i tabel S3. B. Expression profiler af kendte SC markører (

Egon

og

FatiGO

undersøgelse), som blev opreguleret med mindst 2 gange i prostata stængel /progenitor beriget prøver. Fem ekspressionsmønstre kan skelnes. LR-værdier er vist i tabel S5.

A. Transkriptionsniveauet fra SC markører i primitive og progenitor prostataceller. Microarray data for SC markører fra disse primitive cellepopulationer udtrykkes som LR-værdier [middelværdi ± SD] i forhold til modne Sca-1

Neg prøver. B. Antigen udtryk for SC markører på Sca-1

Hi og Sca-1

Lo celler. FACS-analyse af Sca-1

Hi og Sca-1

Lo celler bestemt udtryk for SC markører (betegnet i A) på disse populationer. Berigning værdier [middel ± SD] er udtrykt som fold ændring i antigenekspression i forhold til antigenet ekspression af det modne Sca-1

Neg cellepopulation.

For at bestemme om yderligere SC gener blev udtrykt i prostata stængel /progenitordelmængder, vi brugte to tilgange. Først vi udnyttet to bioinformatiske værktøjer (

Egon

og

FatiGO

[15]) til at identificere gener kommenteret som stamcelle-gener baseret på tidligere publikationer. Denne undersøgelse viser, at alle vores stamceller /progenitor-relaterede delmængder (UGE, Sca-1

Hej, Sca-1

Lo) udtrykker en række stamcelle markører (i alt 67 gener) (figur 2B; Tabel S5 ). Vores anden tilgang til bestemmelse af primitive karakter af profilerne involverede en systematisk sammenligning af vores profil med fem andre genekspressionsprofiler fra embryonale (ESC), hæmatopoietiske (HSC), neuronal (NSC) [16], [17], hud [18 ] og lever [19] stamceller. Vi fandt, at et betydeligt antal mRNA’er udtrykt i prostata spindel /progenitor klynger blev også opreguleret i mindst én af de fem offentliggjorte SC profiler (fra 40% af

UGE-only Salg mRNA’er til 20% af

Sca-1

Hi + Sca-1

Lo

mRNA) (figur 2B, tabel 1, S6). Til trods begrænsningerne ved sammenligning af data opnået under anvendelse af forskellige eksperimentelle betingelser og mindre omfattende mikroarrays end der anvendes i vores undersøgelse, vi har registreret en høj grad af overlapning mellem gener overudtrykt i prostata stamceller /progenitor profiler og dem, der er overudtrykt i andre SC profiler. Dette indebærer, at prostata stamceller /stamceller deler mange træk med SC isoleret fra andre kilder. Men prostata stængel /progenitorceller udtrykker også gener ikke er identificeret i nogen af ​​disse fem SC populationer indikerer, at nogle af disse gener kan være unikke for prostata eller kan deles med andre ubeskrevne SC profiler. Især de to tilgange, der anvendes til estimering af SC-markør berigelse viser, at mens der er betydelig overrepræsentation af SC-relaterede gener hos voksne Sca-1

Hi celler, er der en endnu højere repræsentation af SC-markører i UGE celler. Interessant, en sammenligning med to ‘stemness signatur studier [16], [17] viser, at PSC profil har større overlap med ESC eller NSC profiler, end med HSC. For eksempel, sammenligning med data fra Ramalho-Santos et al [17] viser, at 14,4% og 16,1% af de PSC-berigede mRNA overlapper ESC og NSC-beriget mRNA, hvorimod færre mRNA (6,8%) overlapper HSC-berigede transkripter (tabel 1). Adskillige nylige undersøgelser har vist, at genekspressionsprofiler af ESC og NSC’er overlapper hinanden i højere grad end med HSC [17], [20]. Følgelig vores resultater antyder, at prostata progenitor-afstamning kan ligne neuronale eller embryonale stamceller i højere grad end for hæmatopoietiske stamceller.

Tilstedeværelsen af ​​et betydeligt antal SC-gener i vores APSC og FPSC foreslår, at disse populationer har karakter af udifferentierede stamceller. Vi næste bestemmes de molekylære profiler af de isolerede PSC befolkninger at dechifrere potentielle signalveje, som udtrykkes af disse celler.

B. Identificering af overrepræsenterede funktionelle kategorier og TF-bindende promoter motiver inden for klynger af gener, der er overudtrykt i de stamceller /stamceller

For at identificere de væsentligste biologiske processer og transkriptionelle netværk inden for de tre SC-holdige klynger (

UGE-kun

,

UGE + Sca-1

Hej

,

Sca-1

Hi-kun

, figur 1) vi anvendt EXPANDER pakke til funktionel og promotor analyse. En række funktionelle kategorier og TF-bindende promoter motiver er væsentligt beriget med disse klynger (tabel 2, S7).

a) Self-fornyelse signatur i FPSC

UGE kun

klynge er stærkt beriget i celleproliferation gener, som man ville forvente for en større føtal befolkning (tabel 3, S7,8). Opregulering af

Mki67 Hotel (12 gange) udelukkende i UGE delmængde attesterer, at disse celler er prolifererende. Spredning og cellecyklus-relaterede veje er forhøjet i selv-fornyelse af normale SC [21]. PTEN sletning, hvilket forstørrer puljen af ​​selvfornyende NSC [21], afslører en SC-selvfornyelse signatur (231 gener) for disse celler. Især ca. 64% af disse gener er også opreguleret i

UGE kun

klynge, hvilket indikerer en betydelig lighed i genekspression mellem disse to selvfornyende populationer (tabel S9). Komponenter, samt målgener, af Wnt /β-catenin vej, der fremmer selv-fornyelse i mange typer af SC [22] er stærkt repræsenteret i FPSC og APSC (tabel 3, S10). Den afvigende aktivering af denne vej i prostata tumorer [23] og dets berigelse i PSC er i overensstemmelse med forestillingen om, at prostatakræft kan opstå i den primitive rum. qPCR-analyse valideret genekspressionsprofilerne, hvilket indikerer, at ekspressionen af ​​

Wnt4

er forhøjet i FPSC (5 gange) og APSC (8 gange) i forhold til modne celler (Sca-1

Neg). Desuden

Wnt6

er forhøjet i FPSC (22 gange), og Fzd6 er forhøjet i FPSC (5 gange) og APSC (3 gange) i forhold til modne celler (Tabel S11). Komponenter af den soniske pindsvin (Shh) vej, som også er involveret i selv-fornyelse af primitive celler [24] og undertrykkelse af differentiering, er åbenbar i FPSC og APSC (tabel 3, S12). Den overflod af Shh-regulatorer og target gener, der opreguleret i FPSC og APSC indikerer, at autokrine pindsvin signalering kan spille en vigtig rolle i prostata progenitor /stamceller biologi. qPCR-analyse validerer genekspression data indikerer, at

Shh

og

GLI3

udtryk øges i føtal (35 gange og 4 gange henholdsvis) og voksne (6 gange og 3 gange henholdsvis) SC forhold til modne celler (tabel S11). Hedgehog signalering er vigtig for normal prostata vækst og stigninger i prostata tumorigenese i samråd med en stigning i stamceller markører [25], hvilket indebærer igen, at primitive celler kan ekspanderes under tumorigenese.

TF-bindingssted analyse af initiativtagerne til gener, der var opreguleret i FPSC (

UGE-kun

klynge) identificerer to transkriptionelle regulatorer af cellecyklus, nemlig E2F og Nfy (tabel 2, S13), i overensstemmelse med over- repræsentation af selvfornyelse gener (tabel 3, S7) [20]. Vigtigere er stigninger i niveauerne af mRNA’er der koder fire medlemmer af E2F-familien observeret sammen med talrige gener, der er specifikke mål for E2f3 (tabel 3). Analyse af qPCR bekræfter, at

E2f3 Hotel (3 gange) og dennes repræsentant målgen,

Cdc2a Hotel (12 gange), er opreguleret i UGE celler sammenlignet med modne celler (tabel S11). Interessant er E2f3 udtryk forbundet med selv-fornyelse af murine trofoblast SC [26], udvidelse af SC i Columella og lateral root hætter af Arabidopsis [27], og en dårlig prognose i prostatakræft [28]. Bindingen-motiv signatur for Nfy er også godt repræsenteret i initiativtagerne til FPSC gener og er i overensstemmelse med den øgede transskription af Nfya og Nfyb underenheder og konstateringen af, at Nfya er en potent inducer af HSC selvfornyelse [29].

Yderligere promoter signaturer, der er beriget i

UGE-kun

klynge er dem Ap2 og embryonale TEA domæne-holdige faktor (ETF), også kendt som Tead2 (tabel 2, S13). I FPSC udtryk for

ETF-service /

Tead2

og dens coaktivator,

Yap1

blev øget med 4 og 2 gange hhv. Den forøgede ekspression af

Tead2

(4 gange) i FPSC forhold til modne celler blev verificeret ved qPCR (tabel S11). Tead2 inducerer gener, der fremmer selv-fornyelse af stamceller i det olfaktoriske epitel [30] og er afgørende i murine embryo udvikling [31]. AP2 transkripter er forhøjet 3 gange og en række af dets målgener øges (tabel 3). Ap2 fremmer proliferation i differentiering og er en markør for SC og pluripotens [32]. Således E2F, Nfy, Tead2 og Ap2 vil sandsynligvis blive involveret i selv-fornyelse og udvidelse af den primitive prostata befolkning.

b) TGF-ß signalering signatur i APSC

I modsætning til den overflod af spredning gener til stede i den ekspanderende UGE befolkning, i APSC (Sca-1

Hej delmængde) finder vi, at TGF-β target gener opreguleres indikerer, at TGF-β-signalering er en fremtrædende del af APSC. Vi har tidligere dokumenteret, at opretholdelsen af ​​vækstdvale af APSC er afhængig af TGF-β /Smad2 /3 signalvej [33]. Betydeligt, identificerer vores cis-element promoter analyse beriget binding-sites for Smad og Smad3 i

Sca-1

Hi-kun

klynge, mens lignende sites var fraværende fra

UGE-only

klynge (tabel 2), hvilket indikerer, at TGF-β /Smad signalering kan have en fremtrædende rolle i APSC.

udtrykket niveau af

Itgb6

, et integrin, der binder og aktiverer TGF β [34] opreguleres 3-fold i APSC (tabel 3). Desuden vil en stigning i ekspressionsniveauerne af

IGFBP3 Hotel (14 gange), der phosphorylerer Smad3 [35], der observeres udelukkende i Sca-1

Hej delmængde. Validering af qPCR (3-fold; Tabel S11) og FACS-analyse (3 gange, figur 3B) bekræfter, at TGF-β målgen clusterin (Clu) er opreguleret i APSC. Vores promoter analyse peger også overrepræsentation af SMAD3 motiv i initiativtagerne til gener fra UGE + Sca-1

Hi klynge (tabel 2), hvilket indikerer, at TGF-β også kan mægle signalering i FPSC. Som en anden metode til bestemmelse af mulige inddragelse af TGF-β-signalering i primitive prostata celler, vi sammenlignet generne fra de tre SC-beriget klynger (

UGE-kun

,

UGE + Sca-1

Hej

Sca-1

Hi-kun

) med TGF-β-drevet underskrift fra keratinocytter [36]. Disse sammenligninger viser, at ca. 14% af generne i hver af disse tre testede klynger kan være TGF-β mål (

UGE kun

112/823;

UGE + Sca-1

Hej

19/130

Sca-1

Hi-kun

23/172 gener) (tabel S14), støtte bidrag TGF-β-signalering i FPSC ud over sin fremtrædende rolle i APSC (tabel 3). I denne forbindelse er det vigtigt at bemærke, at

Smad2

Smad3

, de to vigtigste transkriptionelle mediatorer af TGF-β, er udelukkende opreguleret i UGE (tabel 3). Den fremtrædende repræsentation af Smad binding-site motiv i initiativtagerne til gener, der opreguleret i APSC (Sca-1

Hi-kun klynge) indikerer, at TGF-β signalvejen er yderst relevant for den transkriptionelle program af disse celler og støtter konstateringen af, at TGF-β fastholder ubevægelighed af APSC [33].