PLoS ONE: Sammenslutningen af ​​DSC3 mRNA nedregulering i prostatakræft med Arrangøren Hypermethylering and Poor Prognosis

Abstrakt

Baggrund

Desmocollin 3 (DSC3), et medlem af cadherin gen superfamilien, er forbundet med patogenesen af ​​visse kræftformer, men dens rolle i prostatakræft (PCA) er stadig stort set ukendt.

Metoder

DSC3 genekspression niveau i tilgængelige PCa microarray datasæt blev undersøgt ved hjælp af den Oncomine database. DSC3 transkript ekspression i prostata-cellelinien panel og en uafhængig væv kohorte (n = 52) blev estimeret ved kvantitativ PCR (Q-PCR). Epigenetisk status DSC3 gen promoter i PCa blev undersøgt ved at uploade tre datasæt (Encode Infinium 450K array-data og to methylering sekventering) i UCSC genom browser. Mens pyrosekventering analyse målt promotor DNA methylering, blev Q-PCR estimater opnået for DSC3 udskrift re-udtryk efter 5-Aza-deoxycytidin (5-Aza) behandling. Kliniske relevans af DSC3 ekspression blev undersøgt ved Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Endelig blev funktionelle undersøgelser overvågning celleproliferation, migration og invasion udført i prostatacellelinjer efter siRNA-medieret DSC3 knockdown eller efter 5-aza induceret re-ekspression. EMT markører vimentin og E-cadherin-ekspression blev målt ved hjælp af Western Blot.

Resultater

Microarray data afslørede et signifikant fald i DSC3 transkript ekspression i PCa, sammenlignet med benigne prøver. Q-PCR-analyse af en uafhængig kohorte afslørede DSC3 transkript nedregulering, både i PCA-cellelinjer og tumorvæv, men ikke i deres godartet modstykke. Undersøgelse af tilgængelige NGS og Infinium data identificeret en rolle for epigenetisk regulering DSC3 mRNA reduktion i PSA. Pyrosequencing bekræftede den øgede DSC3 promotor methylering i cancer-cellelinjer og restaurering af udskrift udtryk på 5-Aza behandling yderligere bekræftet dette epigenetisk inaktivering mekanisme. Vigtigere Kaplan-Meier analyse af et resultat kohorte viste en sammenhæng mellem tab af DSC3 udtryk og signifikant øget risiko for biokemisk recidiv. Funktionelle studier indikerer en rolle for epitelial-mesenkymale overgang i DSC3 reguleret cellemigration /invasion.

Konklusion

Samlet set vores data tyder på, at DNA-methylering bidrager til nedregulering af DSC3 i prostatakræft og tab af DSC3 forudsiger dårlig klinisk resultat

Henvisning:. Pan J, Chen Y, Mo C, Wang D, Chen J, Mao X, et al. (2014) sammenslutning af DSC3 mRNA nedregulering i prostatakræft med Arrangøren Hypermethylering og dårlig prognose. PLoS ONE 9 (3): e92815. doi: 10,1371 /journal.pone.0092815

Redaktør: Robert Dante, Institut national de la santé et de la recherche médicale, Frankrig

Modtaget: November 13, 2013; Accepteret: 26 februar 2014; Udgivet: Marts 24, 2014

Copyright: © 2014 Pan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra China National Natural Science Foundation (81272809); Videnskab og Teknologi Planlægning Projekt Guangdong (2011B050400021) og Guangdong Key Laboratory of Urology, The First Affiliated Hospital i Guangzhou Medical University (2010A060801016). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prostatakræft er den anden mest almindelige kræftform blandt mænd over hele verden, og mere end 900.000 mænd er diagnosticeret med prostatakræft hvert år [1]. Selvom PSA anvendes klinisk som screeningtest med en følsomhed på 80%, er dets anvendelighed begrænset på grund af dets lave specificitet (20%), hvilket kan føre til unødvendige biopsier og overbehandling [2]. Trods det store indsats i søgningen efter biomarkører, stadig prostatacancer kliniske behandling en udfordring på grund af suboptimal ydeevne af eksisterende diagnostiske og prognostiske værktøjer [3].

Undersøgelser, som identificerer og karakteriserer kræft specifikke afvigende molekylære begivenheder afslører også kandidater med potentiel biomarkør nytte [4]. Differential DNA methylering er almindelig i prostatakræft, der resulterer i hypermethylering ved promotor af tumorsuppressorgener, hypometylering på initiativtagerne til onkogener, og global hypometylering fører til genomisk ustabilitet på senere stadier af prostatakræft [5], [6]. Nogle af de almindeligt rapporterede hypermethyleret gener i prostatakræft omfatte GSTP1, RASSF1A, og APC, som har hjulpet i prostatakræft diagnose og prognose [7]. Prostatacancer er en heterogen sygdom, antallet af hypermethyleret gener stiger som prostatacancer skrider [8], [9]. Vigtigere molekylære begivenheder i PCa, såsom genfusioner er for nylig blevet vist at bibringe differentielle DNA methyleringsmønstre [5], [9]. Dette indebærer, at PCa sygdom heterogenitet kan afspejles bedre ved differential epigenetiske signaturer. Således karakterisering af differentielt methylerede regioner (DMRs) har en høj sandsynlighed for at give potentielle biomarkører med klinisk brug for prostatakræft.

Medlemmer af desmosomer cadherin familien, herunder desmocollins og desmogleins, findes primært i epitelceller hvor de udgør de adhæsive proteiner af desmosom celle-celle-junction og er nødvendige for celleadhæsion og desmosom formation [10], [11]. Nedsat desmosomer protein funktion er forbundet med flere sygdomme [12]. En af de interessante funktioner er deres evne til at inhibere cellemotilitet, et fænomen af ​​betydning i cancer [10]. Desmocollin 3 (DSC3), et medlem af cadherin superfamilien, bidrager til desmosom medieret celle-celleadhæsion [11]. Nylige undersøgelser har observeret tab af DSC3 i flere kræfttyper, såsom lymfeknudemetastaser oral pladecellecarcinom, brystcancer og colorektal cancer, hvor nedsatte niveauer associeret med cancer progression var reguleret af epigenetisk modifikation [13], [14], [15]. Men lidt om udtrykket og reguleringsmekanismer af DSC3 i prostatakræft.

I denne undersøgelse analyserede vi udtrykket og methylering mønstre af DSC3 i prostatakræft, og endnu vigtigere udforskede den funktionelle rolle DSC3 og dets potentielle kliniske forudsigelse værdi.

Materialer og metoder

cellelinjer og Vævsprøver

Alle prostata cellelinjer skabt på grundlag American Type Culture Collection og prostata primære celler Prec købt fra Lonza blev dyrket ved 37 ° C i en 5% CO2 cellekultur inkubator. Prostatakræft-cellelinier blev opretholdt i DMEM (Invitrogen) (DU145) og RPMI (LNCaP, 22RV1) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Den normale prostata-cellelinien RWPE blev opretholdt i KSF media (Invitrogen) plus 10 ng /ml EGF (Sigma) og ekstrakt fra bovin hypofyse (BPE) og de primære prostataceller Prec blev dyrket i PrEGM medier (Lonza). Prostata vævsprøver, herunder benign prostata (n = 18), prostatakræft (n = 34) blev opnået fra First Affiliated Sygehus af Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Kina). Vævsprøverne blev flash-frosset i flydende nitrogen ved udleveringen og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter for at tillade brugen af ​​prøver og kliniske data for efterforskning. Denne undersøgelse, der involverer mennesker blev godkendt af den etiske Råd af Sun Yat-Sen University.

RNA ekstraktion og kvantitativ RT-PCR

Total RNA isoleret ved hjælp TRlzol (Invitrogen) blev anvendt i cDNA syntese (Superscript III, Invitrogen) i nærværelse af vilkårlige primere (Invitrogen). Kvantitativ realtids-PCR (Q-PCR) blev udført under anvendelse Power SYBR Green MasterMix (Applied Biosystems) på et Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System. Alle oligonukleotidprimere blev opnået fra Invitrogen og er anført i tabel S1. GAPDH forstærkning blev anvendt som intern kontrol. MRNA-ekspression niveauet blev bestemt som beskrevet tidligere, ved hjælp af 2

-ΔΔCT metode [16].

KODE datasæt og Methylplex NGS sekventering data Analyse

Infinium 450K Bead Array og til nedsat repræsentation Bisulfite Sekventering DNA methylering data fra KODE konsortium rådighed som bruger spor i UCSC genom browser blev anvendt i denne undersøgelse [17]. De Methylplex NGS sekventering data brugerdefinerede spor af benign cellelinje Prec og PCa LNCaP, prostata normal, godartet tilstødende, lokaliseret PCa, og metastatisk PCA væv fra en nyligt offentliggjort undersøgelse af Kim et al. (Genome Res 2011) blev også uploadet som spor i UCSC genom browser og visualiseres [9]. Denne dybe sekventering data fra en tidligere offentliggjort datasæt aflejres i NCBI GEO under accessionsnummer: GSE27619.The DSC3 genomiske region “Chr18: 28,570,052-28,622,781” (Hg19) (herunder både promotoren og kodende område) blev undersøgt for differentiel DNA-methylering .

genomisk DNA isolation, Bisulfite konvertering og Pyrosequencing

Den genomiske DNA ekstraheret med QIAamp DNA Mini kit (Qiagen) var hydrogensulfit omregnet ved hjælp af EZ DNA methylering guld kit (Zymo forskning) og bruges som skabelon for PCR-reaktioner. DSC3 methylering blev estimeret ved anvendelse af PyroMark DSC3 methylering assay (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev bisulfit omdannede DNA, DSC3 primere, og Hotstart Master Mix (Qiagen) anvendt i en PCR-reaktion til amplifikation DSC3 genomiske regioner interesse fra prøven. Amplifikationen blev opnået fra 45 cykler af 30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 50 ° C, og 40 sekunder ved 72 ° C, efter en indledende aktivering enzym i 15 minutter ved 95 ° C, og endelig forlængelse på 7 minutter ved 72 ° C. PCR-produkterne blev indfanget på streptavidin Sepharose-perler (GE Healthcare), denatureret at producere enkeltstrenge, vasket og anneales til sekvenseringsprimer, og sekvensen blev bestemt under anvendelse af PyroMark Q24 systemet (Qiagen). Middelværdien methylering af tre individuelle positioner anses i denne test. Primersekvenser er vist i tabel S1. Methylering niveauer individuelt for hver CpG websted og dets beregnede gennemsnitlige værdier er vist i tabel S2.

5-Aza-deoxycytidin behandling

LNCaP celler podet i 6-brønds plader blev behandlet den følgende dag med angivne koncentrationer af 5-Aza-deoxycytidin (Sigma) eller en tilsvarende mængde af køretøj (DMSO) i fem på hinanden følgende dage. Vækstmediet indeholdende enten 5-aza-deoxycytidin eller vehikel blev erstattet hver 24. time. Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden blev totalt RNA isoleret for at evaluere angivne transkript ekspression af Real Time RT-PCR.

Protein fra cellelysater blev isoleret Western blot-analyse

, og Proteinkoncentrationer blev bestemt ved BCA kit. 20 ug protein blev separeret ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membran (GE Healthcare). Membranen blev inkuberet i en halv time i blokeringspuffer indeholdende 5% mælk efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C med de primære antistoffer, der omfatter E-cadherin antistof (1:1000,3195S, Cell Signaling); Vimentin antistof (1:1000,5741S, Cell Signaling) eller GAPDH-antistof (1:2000,5174, Cell Signaling). Efter adskillige vaske med Tris-pufret saltopløsning indeholdende Tween-20 (TBS-T) blev blottet inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof. Signalerne blev visualiseret ved forøget kemiluminescens-systemet i henhold til producentens protokol (GE Healthcare).

RNA-interferens

Celler blev udpladet i 6-brønds plader ved en ønsket numre og transficeret med DSC3 siRNA (Dharmacon ) eller ikke-målretning siRNA to gange. Transfektioner blev udført med OptiMEM (Invitrogen) og oligofectamine (Invitrogen) i overensstemmelse med standardprotokoller. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne trypsineret og udpladet i tre eksemplarer ved 8.000 celler pr brønd i 24-brønds plader. Knockdown effektivitet blev bestemt ved Q-PCR.

celleproliferation /migrering /Invasion Assay

Cell proliferationsassay blev udført under anvendelse af WST-1 Kit ifølge producentens anvisninger (Clontech Laboratories). For Migration /Invasion blev celler transficeret eller behandles. Efter 24 timer blev celler podet på 8 um skær (BD Falcon) overtrukket med Matrigel (for invasion assays) eller ubestrøget (for motilitet assays) i en 24-brønds dyrkningsplader. Kalvefosterserum blev tilsat til det nederste kammer som kemo tiltrækningsstof. Efter 72 timer blev ikke-invaderende celler forsigtigt fjernet ved vatpind. Invasive celler på den nedre side af kammeret blev farvet med krystalviolet og lufttørredes. Relativ invasion blev kvantificeret ved opløsning af krystalviolet farvestof og måling af absorbans ved 560 nm.

Oncomine Expression og Outcome Analyse

DSC3 udtryk fra uafhængige offentliggjorte microarray studier blev udvundet Oncomine database. De datasæt kan også fås fra NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) under accessionsnumre, GSE35988 (Grasso et al,.); PMID: 19737960; (Arredouani et al,.) GSE3325 (Varambally et al,.); GSE3933 (Lapointe et al,.); og GSE21032 (Taylor et al.,). For Kaplan-Meier-analyse af Taylor et al., (Cancer Cell 2010) datasæt [18], blev biokemisk tilbagefald defineret som en 0,2 ng /ml øges i PSA eller fornyet sygdom efter prostatektomi, såsom udvikling af metastatisk cancer, hvis biokemisk recidiv oplysninger ikke var tilgængelig. DSC3 udtryk værdier blev kategoriseret i lave og høje grupper efter medianen cutoff.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism software program. For kvantitative data blev grupper rapporteret som middelværdi ± SEM og sammenlignet ved anvendelse af uparret t-test eller envejs ANOVA-test. For Kaplan-Meier overlevelsesanalyse blev log-rank test anvendes. Statistisk signifikans blev etableret i P. 0,05

Resultater

DSC3 udtryk undertrykkes i prostatakræft

At udforske udtryk for DSC3 udskrift i prostatakræft og godartede væv, vi anvendes den Oncomine værktøj til at analysere adskillige offentliggjorte microarray genekspressionsstudier. Vores analyse afslørede en stærk reduktion i DSC3 mRNA-ekspression i prostatakræft væv sammenlignet med benigne prøver. Figur 1A viser niveauerne af DSC3 udskrifter på tværs af fire uafhængige offentliggjorte microarray undersøgelser [19], [20], [21], [22]. Til eksperimentelt bekræfte denne observation, vi testede et panel af prostata cellelinjer, herunder LNCaP, DU145, 22RV1, godartede celler nemlig RWPE og Prec ved Q-PCR. I et mønster i overensstemmelse med microarray data viste de benigne celler højere transkripter ekspression sammenlignet med cancercellelinier (figur 1b). Tilsvarende ekspressionsmønster blev observeret for GSTP1, en velkendt methyleret gen i prostatacancer, som vi anvendt som en positiv kontrol (fig 1C).

(A) Boxplots repræsentation af DSC3 mRNA-ekspression i fire uafhængige prostatacancer microarray datasæt, B = Benign, T = Tumor. Første forfatter og statistisk signifikans er angivet. (B) Q-PCR-analyse af DSC3 og (C) GSTP1-ekspression i et panel af prostata-cellelinjer; Prec-prostata normale epitelceller, RWPE-godartet prostata-cellelinje, LNCaP, DU145, 22RV1 er metastatisk prostatacancer cellelinjer.

DSC3 nedregulering i PCa medieres af promotor methylering

en detaljeret undersøgelse af DSC3 genomisk organisation, der anvender UCSC genom browser afslørede tilstedeværelsen af ​​en CpG ø i DSC3 gen regulatorisk region “Chr18: 28,570,052-28,622,781” (Hg19) omgiver transkriptionsstartsitet. Analyse af DNA-methylering i denne region i INDKODNING Methyl 450K Bead Arrays og til nedsat Repræsentation bisulfit sekventering (RRBS) datasæt [17] viste, at DSC3 genpromotor er hypermethyleret i LNCaP sammenlignet med godartet cellelinie Prec (figur 2A). Endvidere analyse af en uafhængig prostatacancer DNA methylering datasæt [9] genereret af Methylplex Next Generation Sequencing (M-NGS) afslørede også DSC3 promotor-methylering i LNCaP og ikke i Prec. Desuden viste disse data også øget methylering i lokaliserede og metastatisk prostatacancer prøver og ikke i godartede eller normale prostata prøver (figur 2B). Både cellelinie data fra KODE [17] og cellelinje /væv datasæt fra M-NGS undersøgelse af Kim et al. [9], afslørede DNA-methylering var i en stærkt overlappende region i DSC3 promotoren. Den basepar løsningen af ​​disse datasæt, tilladt os at nøjagtigt hjem i den kromosomale region mål for DNA-methylering. Under anvendelse af ovennævnte oplysninger vi næste eksperimentelt undersøgt kromosomale område i DSC3 promotoren for methylering forandring ved pyrosekventering analyse i et panel af prostatacellelinjer. Støtte tendensen observeret med de offentligt tilgængelige data, pyrosekventering analyse afslørede hyppig hypermethylering af DSC3 promotoren i cancercellelinier (3/3) sammenlignet med benigne cellelinier (0/2) (10% methylering som en afskæring) (figur 3B). For at teste, om DSC3 er epigenetisk tavs ved methylering i prostatacancer, behandlede vi LNCaP-celler med en DNA-methyleringsinhibitor, 5-aza-deoxycytidin (5-Aza). Transcript ekspression analyser af Q-PCR af både DSC3 og GSTP1, sidstnævnte anvendt som en positiv kontrol viste induktion af begge disse mRNA’er upon 5-Aza lægemiddelbehandling, og pyrosekventering viste, at en reduktion i DNA-methylering af DSC3 promotorregionen på 5- aza behandling (figur 3C KODE Infinium 450K, orange = methyleret (score ≥600), lys blå = umethyleret (0 score ≤200). LNCaP (1): LNCaP-celler behandlet med androgen; LNCaP (2): LNCaP data fra Duke University; LNCaP (3): LNCaP data fra University of Washington. (B) repræsentation MethylPlex NGS sekventering data (Prec, LNCaP, prostata normal, godartet tilstødende, lokaliseret PCA og metastatisk PCA væv) til DSC3. Denatureret regioner observeret i de tilsvarende prøve grupperne er afbildet som toppe og tal i y-aksen angiver tophøjderne

(A) Sekvens af DSC3 promoteren (Chr18: 28.622.751-28.622.860). Og region analyseret af pyrosekventering er givet i blå (Chr18: 28.622.791-28.622.820) og CG-positioner overvåges inden er angivet med rødt. CGI, CpG island. (B) Bar plot viser gennemsnittet af den procentvise methylering i de tre CG-positioner i prostata cellelinjer. Blue-procent unmethylation; Orange-procent methylering; Bi-sulfit omdannes universelt methyleret gDNA og føtalt DNA blev anvendt som positive og negative kontroller. (C) DSC3 ekspression som vurderet ved Q-PCR i LNCaP-celler behandlet med 5-aza-deoxycytidin (5-Aza) blev GSTP1 indbefattet som en positiv kontrol. (D) Bar plot viser gennemsnittet af procent methylering i de tre CG-positioner i LNCaP behandlet med 5-Aza.

DSC3 nedreguleres i PCa og forudser dårlig klinisk resultat

for at undersøge ekspressionen af ​​DSC3 i prostatakræft væv, udførte vi Q-PCR på et panel af prostatavæv herunder godartet prostata (n = 18), prostatacancer (n = 34). DSC3 ekspression blev bemærkelsesværdigt reduceret i prostatacancer (2,4 ± 1,2) sammenlignet med benigne væv (21,8 ± 16,3) (Figur 4a B). Ca. 25-40% af patienterne behandlet med radikal prostatektomi for klinisk lokaliseret prostatacancer vil opleve recidiv, oprindeligt angivet af en stigning i serumkoncentrationen af ​​PSA (biokemisk recidiv) [23]. Således har vi siden forsøgt at afgøre, om DSC3 inaktivering status var forbundet med biokemisk tilbagefald efter kirurgisk resektion. Mod dette undersøgte vi Taylor et al. (Cancer Cell 2010) genekspression datasæt [18], der er kendetegnet tumorer fra 140 patienter, der har recidiv oplysninger (med 36 gentagelser). Prøverne blev adskilt i høje og lave DSC3 grupper baseret på DSC3 median udtryk værdi. Kaplan-Meier analyse viste, at lav DSC3 gruppe patienter havde en signifikant højere risiko for recidiv end gruppen patienter høje DSC3 (Hazard ratio: 2,352, 95% CI: 1,198-4,446, log rank P = 0,0125) (figur 4C). Dette antyder, at DSC3 udskrift tab i prostatakræft kan forudsige dårlig klinisk resultat. Tilsammen antyder disse data DSC3 kan et medlem af cadherin superfamilien være at spille en vigtig rolle i prostatakræft progression fører til dårlig klinisk resultat.

(A) Q-PCR for DSC3 transkript i en kohorte af godartet prostata ( n = 18) og prostatacancer (n = 34) væv. (B) En sammenfatning histogram af udtrykket værdier DSC3 i prostata godartede og tumorprøver. (C) Kaplan-Meier analyse viste, at lav DSC3 gruppe patienter havde en signifikant øget risiko for tilbagefald end gruppens patienter høje DSC3 (P = 0,0125).

Effekter af DSC3 på migration /invasion potentiale af prostata celler Salg

DSC3 er en af ​​de adhæsive proteiner af desmosom celle-celle-junction og er nødvendig for celleadhæsion. For at undersøge den rolle, DSC3 i prostata, vi transficeret godartede RWPE celler med enten kontrol eller DSC3 siRNA og udførte spredning, migration og invasion assays. Forbigående knockdown af DSC3 i RWPE resulteret i øget celle migration og invasion (figur 5C), mens ingen signifikant effekt blev observeret på celleproliferation (figur 5B). For at forstå den mekanisme af DSC3 reguleret migration og invasion, testede vi udtryk for epitelial-mesenkymale overgang (EMT) markør E-cadherin og vimentin i RWPE behandlet med enten kontrol eller DSC3 siRNA. Interessant knockdown DSC3 i RWPE forøget vimentin ekspression mens inhibering E-cadherin ekspression (figur 5D). Dette antydede, at DSC3 kunne regulere prostata cellelinje migration /invasion potentiale ved at inducere EMT. For at bestemme virkningen af ​​DSC3 re-ekspression på funktionen af ​​prostataceller, migrations- og invasive potentiale af kontrol og 5-Aza behandlede DU145-celler blev vurderet. Induktion af DSC3 udtryk på 5-Aza behandling af DU145 celler resulterede i en betydelig reduktion af migrationen /invasion potentialet i disse celler. Yderligere behandling af disse celler med DSC3 siRNA, delvist restaureret migration /invasion potentiale (figur 5F). Disse resultater render overbevisende dokumentation for, at den formindskede kræft cellemigration /invasion efter behandling med 5-aza skyldes hovedsagelig induktionen af ​​DSC3 ekspression.

(A) DSC3 knockdown af siRNA i godartet prostata-cellelinien RWPE som detekteret af Q-PCR. * angiver værdier, der er væsentligt anderledes end den ikke-Målgruppe (NT). siRNA # 2 og siRNA # 3 er to individuelle DSC3 siRNA. (B) Effekt af DSC3 knockdown på proliferation i RWPE celler ved WST-1. (C) Effekt af DSC3 knockdown om migration gennem Transwell og invasion gennem Matrigel i RWPE celler. Migrerede og invaderede celler blev farvet med krystalviolet, opløst og kvantificeres ved at måle absorbansen ved 560 nm. * Angiver værdier, der er væsentligt anderledes end den ikke-Målgruppe (NT). (D) E-cadherin og vimentin udtryk vurderet ved Western blot-analyse i RWPE celle behandlet med ikke-Target siRNA eller DSC3 siRNA. (E) Q-PCR for DSC3 anvendelse af total RNA ekstraheret fra PCa cellelinie DU145 behandlet med 5-aza eller DSC3 siRNA. (F) Den migration og invasion potentiale ubehandlede og 5-Aza behandlede DU145 blev vurderet af Transwell eller Matrigel assay. Migreret og invaderede celler blev farvet med krystalviolet, opløst og kvantificeres ved at måle absorbansen ved 560 nm.

Diskussion

Desmocollin 3 (DSC3) viste sig at være hyppigt nedreguleret i flere kræftformer såsom brystkræft, oral, colorectal og lungekræft, og inaktivering af DSC3 i disse kræftformer skyldes promotor hypermethylering [13], [14], [15], [24]. Men lidt er kendt om den rolle, DSC3 i prostatakræft. Mod dette vi først sammenlignet DSC3 udtryk i prostatakræft fra offentliggjorte microarray genekspressionsstudier vha Oncomine værktøj. Fire uafhængige PCA datasæt afslørede, at DSC3 blev signifikant reduceret i prostatakræft væv sammenlignet med godartede prøver. Vores analyse viste også konsekvent nedregulering af DSC3 mRNA i cancercellelinier. Dernæst vi undersøgt forskellige offentligt tilgængelige datasæt for status methylering af DSC3 gen promotor i prostatakræft. Flere linjer af beviser baseret på analyse ved hjælp af uafhængige platforme såsom Infinium methylering 450K Bead Arrays (Encode), Reduceret Repræsentation Bisulfite Sequencing (KODE), som karakteriseret LNCaP og Prec celler, sammen med MethylPlex NGS sekventering undersøgelse, karakteriseret LNCaP, Prec og prostatakræft kliniske prøver understøttet differentiel methylering af DSC3 genpromotor i prostatacancer. Vi viste også, at DSC3 gen epigenetisk er stumme i prostatacancer, som behandling af LNCaP-celler med de-methyleringsmiddel 5-Aza, induceret DSC3 transkript ekspression. Vores nuværende undersøgelse viser således, at DSC3 udtryk ofte går tabt i prostatakræft skyldes promotor hypermethylering ligner tidligere rapporter i andre solide tumorer [15], [24]. Vigtigere DSC3 udtryk i prostatakræft kliniske prøver var i stand til at forudsige dårlig klinisk resultat, når analyseret for biokemisk recidiv.

En funktionel undersøgelse foretaget hidtil har identificeret DSC3 som en potentiel tumorsuppressorgen, stabil transfektion af en DSC3 ekspressionsvektor i lungekræft cellelinier viste, at ektopisk ekspression af DSC3 inhiberede celleproliferation, forankringsuafhængig vækst, migration, samt invasion [24]. Interessant vi observerede en stigning i celle migration og invasion af RWPE prostata celler, når vi slået ned DSC3 genet ved hjælp af to specifikke uafhængige siRNAs og ikke kontrol ikke-mål siRNA. Den siRNA medieret lyddæmpning af DSC3 viste ikke nogen effekt på celleproliferation. Desuden knockdown af DSC3 mens inducere vimentin proteinekspression, faldt niveauerne af E-Cadherin, sandsynligvis tyder en EMT lignende fænotype når DSC3 genet nedreguleres. Mens de regulatoriske mekanismer, der styrer DSC3 ekspression ikke er fuldt forstået, DSC3 er en TP53 respons-gen og tilsætning af vildtype TP53 viste sig at være tilstrækkelig til at inducere ekspression af DSC3 i brystcancer [15], [25]. Derfor tab af TP53 funktion gennem somatisk mutation, som ofte observeres i fremskreden prostatacancer, kan resultere i hypermethylering af sine målgener. En lignende relation blev observeret med ERG ekspression og methylering status for dens målgen nemlig TDRD1 i prostatacancer [26], [27]. Men flere undersøgelser der kræves for at udforske de mekanismer, der regulerer DSC3 i prostatakræft.

For at tydeliggøre udtryk for DSC3 i prostatakræft væv kohorte fra en kinesisk befolkning, vi udførte Q-PCR på prostata væv. DSC3 ekspression blev signifikant og stærkt reduceret i prostatakræft sammenlignet med benigne væv. I betragtning af dets inaktivering i PCA-cellelinjer og væv, ønsker vi at vurdere, om DSC3 udtryk er forbundet med dårlig klinisk resultat. I vores analyse observerede vi en korrelation mellem nedregulering af DSC3 og betydeligt højere risiko for biokemisk tilbagefald. Aberrant DNA methylering af genpromotorer er karakteristisk for cancerceller, og flere gener er epigenetisk ændres i en cancer-specifik måde [28]. I patienter med prostatacancer, er sammenhænge mellem specifikt gen promoter hypermethylering og Gleason score, patologisk stadium eller tumor tilbagefald velkendt [29]. GSTP1 genpromotor methylering er almindeligt præget af flere uafhængige grupper og findes at være have diagnostisk værdi som biomarkør i prostatacancer patient væv eller kropsvæske aided i ikke-invasiv detektion [30]. Hypermethylering af DSC3 blev tidligere rapporteret som en markør til at forudsige det kliniske resultat i tyk- og lungekræft [15], [24]. Således er der behov for flere undersøgelser på store prostatakræft væv kohorter samt kropsvæsker til yderligere at evaluere DSC3 som methylering biomarkør. Sådanne undersøgelser vil omfattende etablere sammenhængen mellem DSC3 promotor methylering og prostatakræft kliniske karakteristika.

Konklusion

Sammenfattende er DSC3 nedreguleret i prostatakræft ved DNA hypermethylering. Dette er den første undersøgelse, at rapportere en detaljeret analyse af DSC3 mRNA-ekspression og gen-promoter methylering i prostatakræft. Analyse af ekspressionen af ​​DSC3 kunne være nyttig til at forudsige kliniske resultater hos patienter med prostatacancer. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at udvide disse observationer og undersøge specifikt den diagnostiske /terapeutiske potentiale DSC3 i prostatakræft.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Oversigt over Sekvenser af primere

doi:. 10,1371 /journal.pone.0092815.s001

(XLSX)

tabel S2.

Oversigt over Pyrosekventering af tre CG-position i prostata cellelinjer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0092815.s002

(XLSX)

Tak

Vi ville gerne takke Dr. Saravana Mohan Dhanasekaran (University of Michigan) for at levere de MethylPlex NGS sekventering data vrikke filer og diskussion, Stephanie Huang for kritisk læsning, og KODE Project.