PLoS ONE: Single-Cell Analysis afslører Tidlig manifestation af Kræft Fænotype i præmaligne Esophageal celler

Abstrakt

Cellular heterogenitet spiller en central rolle i en række funktionelle processer in vivo, herunder carcinogenese. Men stadig vores viden om celle-til-celle diversitet og hvordan forskelle i de enkelte celler åbenbart i ændringer på populationsniveau meget hovedsageligt begrænset på grund af manglen på passende værktøjer gør det muligt studier på single-celle niveau. Vi præsenterer en undersøgelse af ændringer i cellulær heterogenitet i forbindelse med præ-malign progression som reaktion på hypoxisk stress. Ved hjælp præmaligne progression af Barretts øsofagus (BE) som en sygdom modelsystem vi studerede molekylære mekanismer bag den progression fra metaplastisk til dysplastiske (præ-kræft) fase. Vi brugte nyudviklede metoder gør det muligt målinger af celle-til-celle forskelle i kopi antal mitokondrie-DNA, ekspressionsniveauer af et sæt af mitokondrie og nukleare gener involveret i hypoxi respons veje, og mitochondriemembranpotential. I modsætning til bulk-celle studier tidligere rapporteret, vores undersøgelse viser betydelige forskelle mellem metaplastisk og dysplastiske BE celler i både gennemsnitlige værdier og encellede parameter fordelinger af mtDNA kopiere numre, mitokondrie funktion, og mRNA ekspressionsniveauer undersøgte gener. Baseret på encellede dataanalyse, foreslår vi, at mitokondrier kan være en af ​​de vigtigste faktorer i præ-malign progression i BE

Henvisning:. Wang J, Shi X, Johnson RH, Kelbauskas L, Zhang W, Meldrum DR (2013) Single-Cell Analysis afslører Tidlig manifestation af Kræft Fænotype i præmaligne Esophageal Cells. PLoS ONE 8 (10): e75365. doi: 10,1371 /journal.pone.0075365

Redaktør: Nagendra Yadava, UMASS-Amherst /Tufts University School of Medicine, USA

Modtaget: Juni 4, 2013; Accepteret: August 12, 2013; Udgivet: 8 oktober 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding kom fra National Institutes of Health (NIH), National human Genome Research Institute (NHGRI), center of Excellence i genomisk Sciences (CEGS) og Individuel Life Sciences center Grant No. 5 P50 HG002360 (PI DRM) http: //www.genome .gov /. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

esophageal adenocarcinom (EAC) er en yderst letal cancer type og menes at udvikle sig fra esophageal epitelceller gennem en række komplekse, trinvis transformationer på biomolekylær plan [1] – [6]. Når transformerede, ØK celler producerer signifikant højere niveauer af antioxidant molekyler gør dem resistente over for forhøjede niveauer af reaktive oxygenarter (ROS) [2]. Selv om de seneste undersøgelser har vist, at transformationen sekvens indebærer udvikling af hyperplasi og metaplasi forårsaget af kronisk betændelse i skæl-esophageal epitel, efterfulgt af multifokal dysplasi, carcinom

in situ

og endelig invasiv ØK [1], [7], [8], den detaljerede molekylære mekanisme bag denne transformation mangler at blive afklaret

Hypoxi spiller en central rolle i kræft [9] -. [16]. Som i næsten alle faste tumorer, er iltforsyning til cancerceller stærkt kompromitteret på grund af den ukontrollerede cellevækst og utilstrækkelig udvikling af mikrovaskulaturen. Mitochondrion, kraftcenter af cellen og den største kilde til adenosintriphosphat (ATP) i normale celler, er det sted, hvor oxidative phosphorylering (OXPHOS) finder sted. Mitokondrier har også vist sig at spille en vigtig rolle i programmeret celledød, eller apoptose, og deres dysfunktion er forbundet med en række sygdomme. For eksempel har variationer i mitokondrie-DNA (mtDNA) kopital blevet forbundet ikke blot med forskellige cellulære fysiologiske betingelser, men også med forskellige ændringer i interne og eksterne mikromiljøer [17], [18]. Det er blevet påvist, at mitokondrier kan generere øgede niveauer af ROS under hypoxi [19], som førte til postulat, at mitokondrier, det primære mål for oxidativ skade, kan fungere som en endogen ilt sensor.

En af de vigtigste faktorer, der bestemmer lægemiddelrespons og aggressivitet af tumorer er den store intratumoral heterogenitet. Nylige undersøgelser har vist, at selv celler i en klonal population eller tilsyneladende homogen væv udviser betydelig variation af forskellige egenskaber spænder fra genekspressionsniveauer til fænotypiske egenskaber [20] – [22]. Det er nu bredt accepteret, at mitokondrie heterogenitet, herunder variationer i mtDNA kopi nummer, DNA mutation /udtømning, udtryk og regulering af gener kodet af mtDNA, og aktivitetsniveauer, er en vigtig bidragyder til mitokondrie kompleksitet og bidrager til den samlede celle-celle heterogenitet [23] – [25]

De fleste nuværende bioanalytiske metoder indsamle data ved hjælp af tusinder til millioner af celler, ifølge sagens natur giver resultater i gennemsnit over en stor celle population.. Sådanne løs vægt-celle tilgange kan potentielt gå glip af vigtige og værdifulde oplysninger, når der beskæftiger sig med meget heterogene systemer [26] såsom kræft [27]. Derfor er udviklingen og anvendelsen af ​​teknikker der kan udføre analyser på enkelt-celle niveau er kritiske, ikke kun for en bedre forståelse af centrale cellulære processer, men også for nye, mere effektive strategier til sygdomsforebyggelse, styring og behandling [28 ] -. [31]

I denne undersøgelse anvender vi to immortaliseret human Barretts esophageal epiteliale cellelinjer CP-A og CP-C, der oprindeligt var afledt af patienter med Barretts øsofagus (BE) uden dysplasi og med dysplasi, henholdsvis [32]. Selvom begge er ikke-maligne epitelceller, blev det konstateret, at CP-C-celler var mere resistente over for oxidativt stress fremkaldt af galdesyre (chenodeoxycholinsyre (CDCA)) end CP-A, hvilket antyder, at i det mindste med hensyn til syre reaktion, CP- C-celler opfører sig mere som esophageal cancercellelinjer sammenlignet med CP-A-celler [2]. I denne undersøgelse, vi sigter mod at belyse potentielle mekanismer, der fører til malign transformation i BE ved at kvantificere forskelle i den måde celler reagerer på oxidativ stress forårsaget af hypoxi. Vi har anvendt en qPCR-baseret teknik udviklet i vores laboratorium for at bestemme mtDNA kopital og ekspressionsniveauerne af mitokondrie og nukleare gener i individuelle celler. Ved hjælp encellede analyse udmærker forskelle i mtDNA kopiantal mitochondriemembranpotential, og hypoxi respons genekspressionsniveauer mellem CP-A og CP-C-celler, som ikke kan forudsiges ved bulk celleanalyse. Anvendelsen af ​​disse nye metoder, sammen med single-celle O

2 forbrug målinger [33] – [35], tillod karakterisering af subtile hypoxi respons forskelle mellem CP-A og CP-C celler. En bedre forståelse af det molekylære grundlag for ØK initiering og udvikling vil fremme bestræbelserne på at definere potentielle terapeutiske mål.

Materialer og metoder

Cell Kultur og Hypoxi Behandling

Barretts spiserøret epiteliale cellelinjer CP-A og CP-C blev opnået fra ATCC og dyrket i Gibco® keratinocyt serumfrit medium (SFM) cellevækstmedium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med hEGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) ved 5,0 ug /l, BPE (bovint hypofyseekstrakt) ved 50 mg /l og penicillin /streptomycin-opløsning (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 100/100 ug /ml i en cellekultur inkubator ved 37 ° C i befugtet luft med 5 % CO

2. Før eksperimenter blev celler dyrket i en 75 cm

2 kolben til ca. 80% konfluens. Celler i G1-fasen sorteret med FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA) blev anvendt i qPCR forsøg i denne undersøgelse. For hypoxia, blev CP-A og CP-C-celler ved 80% konfluens inkuberet i keratinocyt SFM medium indeholdende 2% (v /v) Oxyrase (Oxyrase, Inc., Mansfield, OH) ved 37 ° C i 30 minutter, hvilket er det optimale Oxyrase behandlingstid som bestemt tidligere [31]. Cellerne blev efterfølgende trypsinbehandlet i 0,05% (vol /vol) trypsin-opløsning indeholdende 2% (v /v) Oxyrase ved 37 ° C i 9 min. Den trypsinisering blev blokeret ved tilsætning af Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Invitrogen) supplmented med 5% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen) indeholdende 2% (v /v) Oxyrase.

encellede Harvesting

Single-celle høst (aspiration og dispensering) blev udført ved hjælp af en mikromanipulator udviklet af vores gruppe [36], [37] (Metoder S1).

Primer design og udvælgelse af Gene Target

Fragmenter inden den hypervariable region i (HVI) i mtDNA blev valgt til kopiantal analyse [38], [39]. Total DNA isoleret fra bulk prøver (1 × 10

4 celler) blev anvendt som skabelon for mtDNA kopiantallet måling, og kvantificeret ved anvendelse af et Real-Time qPCR System (StepOne, Applied Biosystems, Foster City, CA) under anvendelse af optimerede primere ( fremgangsmåder S1). For RT-qPCR ekspressionsniveauet analyse, fire mitokondrier kodede gener (16s rRNA,

coxi

,

COXIII, CYTBI

og fire nukleare gener (28s rRNA, VEGF, MT3, og PTGES) (primere sekvenser som [31]) blev valgt (Metoder S1).

Single-celle mtDNA Copy Number Bestemmelse

Efter høsten rør hver indeholder én celle suspenderet i seks uL DNaST lysis buffer [26] blev straks frosset på tøris og derefter opbevaret ved -80 ° C indtil qPCR analyse. Hver qPCR blev kørt i et samlet volumen på 10 pi, der indeholdt 2 pi af lysatet fra DNaST opløsning som en skabelon. for at bestemme mtDNA kopiantallet, de qPCR produkter af bulk-prøver blev renset, kvantificeres og serielt fortyndet (kopi antal 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 75, 50 , 25, 10, 5, 1, 0) for en serie af qPCR reaktioner. resultaterne blev anvendt til at plotte en standardkurve for hvert gen. The Ct værdien af ​​hver enkelt celle blev derefter overført til absolut mtDNA kopital under anvendelse standardkurverne opnået. Salg

mitochondriemembran potentiel

mitokondrie membranpotentiale (MMP) blev kvantificeret med konfokal mikroskopi-analyse under anvendelse af potentiometriske farvestof JC-1 (100 ng /ml) som fluorophor og offentliggjort farvningsprotokoller [40 ], [41] (Metoder S1).

Single-celle Gene Expression Analysis

Single-celle RT-qPCR blev udført som beskrevet tidligere [31], [42].

Dataanalyse

statistiske analyser, herunder betydning tests blev udført ved hjælp af OriginPro softwarepakke (v. 8, OriginLab, Northampton, MA). Statistisk signifikans niveauer blev beregnet ved anvendelse af to-sidede ikke-parametrisk Mann-Whitney-Wilcoxon test.

Resultater

qPCR-baserede metode for mtDNA Copy Number Adetermination i enkelte celler

Adskillige mitokondrie DNA-regioner, såsom HVI, er blevet anvendt som mål for PCR-baseret mtDNA kopital analyse i bulkprøver før [43]. Et primerpar med den laveste Ct-værdi, tydeligt negativ kontrol, skarpe og tydelige toppe af amplifikationsproduktet i smeltekurveme, og den korrekte amplifikationsprodukt som bekræftet ved sekventering blev valgt for hver region for yderligere encellede analyse (fig. S1 ,

HV1

). Seriefortyndinger af PCR-amplificeret mtDNA fragment indeholdende HVI region blev anvendt til at fremstille qPCR standardkurver for mtDNA kopiantal. Med de valgte primerpar blev HVI region påvist at have den bedste ydelse med

R

2 = 0,9925, for DNA-kopi nummer fra 10

2 til 10

6 ( fig. S2).

RT-qPCR for Gene Expression Analysis i enkelte celler

vi har for nylig rapporteret om en ny teknik gør det muligt for isolation, rensning, og reverse transkription af totalt RNA fra en enkelt pattedyrcelle efterfulgt af RT-qPCR analyse af ekspressionsniveauerne af nukleare kodede gener [31]. Efter samme procedure, vi bestemt i de enkelte celler ekspressionsniveauerne af flere udvalgte gener involveret i hypoxi reaktion, herunder mitokondrier kodet

coxi

,

COXIII

, og

CYTBI

[43] – [45], og den

VEGF

,

MT3

,

ANGPTL4

PTGES

gener kodet af den nukleare DNA, med 16S rRNA og 28S rRNA blev brugt som interne kontroller [31], [38], [46] -. [48]

Single-celle mtDNA Copy Number Analyse i CP-A og CP-C cell Lines

Tidligere undersøgelser baseret på bulk-celle-analyse viste, at den gennemsnitlige mitokondriemasse ikke signifikant forskellig mellem CP-A og CP-C-celler [2]. I denne undersøgelse vores indledende hovedparten-celle Analyseresultaterne viste også en lidt højere, men statistisk ikke-signifikante gennemsnitlige mtDNA kopiantal i CP-C-celler (~1,530 per celle) i sammenligning med CP-A (~1,392 per celle) (fig. S3). Den encellede analyse baseret på 99 enkeltceller fra hver cellelinie afslørede statistisk signifikante forskelle (p 0,002) i mtDNA kopital mellem CP-A og CP-C-celler (. Figur 1A, B). 92 ud af 99 (92%) CP-A celler viste mtDNA kopiere numre på mellem 106-1,900 per celle med kun 8 (8%) celler, der indeholder mere end 2.000 eksemplarer pr celle, mens i 92 ud af 99 CP-C celler mtDNA kopiantal varierede mellem 171-2,952 per celle, med 8 celler med mere end 3.000 kopier per celle (fig. 1A). I gennemsnit CP-C-celler havde omkring 43% mere mtDNA end CP-A-celler (1363 (CP-C) vs. 951 (CP-A). Fig 1B, tabel 1). Beskrivende parametre af mtDNA population histogrammer, herunder skævhed (foranstaltning symmetriplan), kurtosis (mål for peakedness) og Fano faktor (mål for spredning) blev beregnet. Både skævhed og kurtosis-værdier var statistisk signifikant lavere i CP-C celler i forhold til CP-A celler, mens Fanø faktor ikke var signifikant forskellige (tabel 1).

A) Enkelt celle mtDNA kopi nummer distributioner i metaplastisk (CP-A) og dysplastiske (CP-C) celler, B) box diagrammer af de to fordelinger er vist i panelet A. Efter værdier er afbildet: åben plads – middelværdi; solid line – median; øvre og nedre kasse linjer – 75

th og 25

th percentiler, henholdsvis; øvre og nedre knurhår – 95

th og 5

th percentiler, henholdsvis; x – Minimum og maximum værdierne af fordelingen. Den p-værdi på 0,002 blev beregnet under anvendelse af to-halede ikke-parametriske Mann-Whitney statistisk signifikans test (n = 99); mtDNA kopiere numre ligger mellem 150-1,900 C-D) JC-1 fluorescens mikrografier af hypoxisk CP-A (C) og hypoxisk CP-C (D) celler; encellede fordelinger af den relative mitochondriemembranpotential i CP-A (E) og CP-C (F) celler. blev analyseret JC-1 signaler fra omkring 100 celler pr cellelinje og tilstand; G) statistisk repræsentation af MMP distribution i begge celletyper /forhold.

Differential Svar på Hypoxi mellem CP-A og CP-C Celler på Single-celle niveau

mitokondrie membranpotentiale varierer betydeligt mellem CP-A og CP-C-celler.

mitokondrie membranpotentiale (MMP) dannet af den mitokondriske elektrontransportkæde afspejler den funktionelle status mitokondrier. Det har været forbundet med fysiologiske respons og produktionen af ​​ROS [49]. JC-1 er blevet meget udbredt i apoptose undersøgelser for at overvåge mitokondriel sundhed og dysfunktion i forbindelse med cancer og neurodegenerative sygdomme [40], [41].

fluorescensimagografi anvendelse JC-1-farvning afslørede slående forskelle mellem CP -A og CP-C-celler (100 celler af hver type) under både kontrol- og hypoxiske betingelser (fig. 1C, D). Under normoxiske vækstbetingelser (21% O

2), viste CP-A-celler relativt lave rød (590 nm) til grøn (529 nm) fluorescensintensitet forholdet med et gennemsnit på 2, mens CP-C-celler udviste en gennemsnitlige forhold på 3,8 (fig. 1E-G). Efter eksponering for hypoxi i 30 min (se fremgangsmåder), viste celler af begge typer reduceret rød /grøn-forhold fluorescens intensitet, i gennemsnit på 0,6 og 1,5 for CP-A og CP-C-celler, (fig. 1G). Den beskrivende statistik data er sammenfattet i tabel 2.

mitokondrie heterogenitet i og mellem forskellige celletyper blev rapporteret tidligere, afslører store variationer i MMP blandt celler af samme type inden for en enkelt dyrkningsskål [23] . I vores undersøgelse, analyse af de encellede MMP data viste statistisk signifikant højere kurtosis værdier i normoxiske CP-C celler i forhold til normoxiske CP-A celler, mens skævheden var sammenlignelige. Under hypoxiske betingelser observerede vi en modsat tendens, med CP-A-celler, der viser markant højere værdier af kurtosis end CP-C celler, mens skævhed værdier ikke var signifikant forskellige. Disse data indikerer forskellige reaktioner på hypoksi mellem de to cellelinier og indebærer, at de to typer celler reagerer på hypoxi forskelligt, ikke blot med hensyn til den gennemsnitlige MMP, men også med hensyn til dets fordeling mellem individuelle celler. MMP fordeling kurtosis-værdier tyder højere MMP heterogenitet mitokondrier i dysplastiske (CP-C) end metaplastisk (CP-A) BE celler.

Analyse af mitokondrie genekspression i enkelte celler.

Tre mitokondrier kodede gener,

coxi

,

COXIII

og

CYTBI

, blev udvalgt til udtryk analyse på grund af deres store betydning i mitokondrie-funktion og involvering i hypoxi respons [44], [45]. Først, vi sammenlignet de relative ekspressionsniveauer af disse gener mellem normoxiske og hypoxiske betingelser i løs celleprøver ved hjælp mitokondriske 16S rRNA som en intern reference. Alle tre mitokondrie-gener viste en meget lignende hypoxi reaktionsmønster: en stigning på 1,5-2,6 gange med høj variabilitet blev observeret i både CP-A og CP-C-celler (Fig S4A, B.)

For gen. ekspressionsanalyse ved encellede plan, i alt 24 celler af hver celletype og tilstand (normoxi og hypoxi) blev isoleret. Resultaterne viste en høj grad af celle-til-celle variation i ekspressionsniveauerne af alle fire mitokondrielle gener i celler af begge typer (fig. 2-4). For eksempel, Ct-værdier af 16s rRNA i CP-A celler varierede fra 20 til 26 (nå 30 i ét tilfælde), og området i CP-C celler var mellem 20 og 25. Ct-værdier for

coxi

,

COXIII

og

CYTBI

i begge cellelinier var mellem 20 og 35 med gennemsnitlige Ct-værdier på 22.4~27.9, 26.8~28.2 og 28.3~30.2 henholdsvis (fig. 2, 3 ). En betydelig reduktion i Ct-værdi af 16S rRNA-genet (

s Restaurant 0,05, n = 24) hos hypoxiske CP-A enkelte celler, mens kun lille, men statistisk signifikant ændring blev detekteret i hypoxisk CP- C-celler (

s

0,05, n = 24) (. Fig 3,

16s rRNA

). Ligeledes et signifikant fald i Ct værdi for

coxi

(

s Restaurant 0,001, n = 24) blev observeret hos CP-A, men ikke i CP-C-celler under hypoxiske betingelser som sammenlignet med normoxi (fig. 2, 3,

coxi

). Da lavere Ct-værdier betyde højere mRNA kopiere numre, 16s rRNA og

coxi

mRNA-niveauer i CP-A-celler var signifikant opreguleret af hypoxi, hvilket indikerer, at begge gener i CP-A celler reagerer på hypoxi. Det er interessant, når den gennemsnitlige Ct

coxi

værdier blev normaliseret mod ekspressionsniveauet af 16s rRNA Ct

16S

, en standard skridt for beregning af de relative mRNA-niveauer i bulk celleprøver, reduktion af

coxi

Ct-værdier som respons på hypoxi var ikke signifikant, hvilket er i overensstemmelse med bulk-niveau genanalyse resultaterne af denne undersøgelse (fig. S4). I modsætning hertil blev en signifikant Ct værdistigning påvist i

CYTBI Hotel (

s

= 0,03, n = 24) CP-C celler, men ikke i CP-A-celler (

s

= 0,43, n = 24) (fig. 2, 3,

CYTB1

), der foreslog en nedregulering af hypoxi af denne mitokondrier kodet gen i CP-C celler. Det er interessant at bemærke, at ekspressionsniveauerne af 16S rRNA i normoxiske CP-C-celler er højere end i normoxiske CP-A-celler (C

t (CPC) = 22,73 mod C

t (CPA) = 23,66 , p 0,006) og nærmer sig niveauet i hypoxiske CP-A-celler (C

t (CPA) = 22,09). vores undersøgelse har imidlertid også vist, at den gennemsnitlige mtDNA kopiantal per celle er højere i CP-C-celler (fig. 1B, tabel 1). Derfor, for at foretage en direkte sammenligning mellem de to cellelinier mulige, beregnede vi de relative forskelle i genekspression niveauer og normaliseres dem mod de gennemsnitlige mtDNA kopiere numre efter følgende ligning: hvor mtDNA er den gennemsnitlige mitokondrie-DNA kopital pr celle. Ved at beregne r

norm vi kan bestemme de relative forskelle i genekspression niveauer mellem de to celletyper pr mtDNA molekyle. Denne parameter kan også tolkes som et mål for “mtDNA aktivitet”, fordi den repræsenterer forholdet mellem de relative genekspressionsniveauer og mtdna kopi nummer. Ved hjælp dette udtryk finder vi, at 16S rRNA under normoxiske betingelser udtrykkes 33% højere pr mtDNA molekyle i CP-C celler end i CP-A-celler. Et lignende resultat gælder for

coxi Hotel (28% højere i CP-C end CP-A) og

COXIII Hotel (32%), mens

CYTBI

udstillinger 2.45- fold lavere udtryk pr mtDNA molekyle i CP-C sammenlignet med CP-A-celler. Endvidere observerer vi markante forskelle i genekspression distributions- parametre-skævhed og kurtosis-mellem hypoksi responser i CP-A og CP-C-celler (fig. 4). Selv om ingen klar tendens i fordelingen skævhed eller kurtosis er indlysende som respons på hypoxi i CP-A-celler (fig. 4A, C, E, G), CP-C-celler udviser en klar og statistisk signifikant stigning i både skævhed og kurtosis af fordelinger af

coxi

,

COXIII

og

CYTBI

genekspression (fig. 4F, H). På den anden side, med undtagelse af

PTGES

, de undersøgte nukleare gener viste ikke signifikante forskelle i de parametre, fordeling i CP-C-celler (fig. 4B, D). Det er vigtigt at bemærke, at de gennemsnitlige værdier af

coxi

og

COXIII

ekspressionsniveauer i normoksiske og hypoxisk CP-C-celler var ikke signifikant forskellige på bulk-niveau (fig. S4). Dette fund viser igen anvendeligheden af ​​single-celle analyser at få adgang til information tilgængelig ellers.

histogrammer af gen-ekspression niveauer i kontrol (

tomme barer

) og hypoxi-behandlet (30 minutter ,

massive søjler

) CP-A og CP-C celler. Distributionsselskaberne histogrammer blev genereret ved hjælp af den samme bin størrelse.

Box plots af encellede gen-ekspression niveauer og

s

-værdier forbundet med forskellene mellem normoxisk og hypoxiske forhold i de to cellelinier. De box diagram viser følgende statistiske værdier: Åbent firkantede – gennemsnitlige, fast line – median, øvre og nedre kasse linjer – den 75. og 25. percentil henholdsvis øvre og nedre whiskers – den 95. og 5. percentiler henholdsvis x – maksimal og minimal værdier.

Sammenligning af fordelingen skævhed (A, B, E, F) og kurtosis (C, D, G, H) værdier af de encellede gentranskription niveau distributioner mellem normoxisk og hypoxiske betingelser . En klar tendens til øget både skævhed og kurtosis af mitokondrier kodede genekspression fordelinger kan ses i CP-C-celler som respons på hypoxi, men er fraværende i CP-A-celler. Blandt de undersøgte nukleare gener kun PTGES genet viste væsentlige ændringer i skævhed og kurtosis parametre i CP-C celler.

Differential udtryk for nuklear hypoxi respons gener.

Vi har vist, at genekspressionsniveauer bestemt fra encellede analyse var ikke altid i overensstemmelse med dem, der opnås gennem hovedparten-celle analyse. blev observeret differentiel ekspression af to kernegener som respons på hypoxi mellem bulk-CP-A og CP-C prøver. I modsætning til CP-A celler, hvor

MT3

blev opreguleret -7 gange og

VEGF

viste ingen ændring, CP-C celler udviste en -5 gange stigning i

VEGF

udtryk mens

MT3

viste ingen signifikant ændring (fig. S4A, B). På det encellede niveau bemærkede vi, at selv

28s

rRNA, som er almindeligt anvendt som intern reference i bulk celle studier viste signifikant opregulering i CP-A (

s

0,05, n = 36), men ikke i CP-C (

s

= 0,05, n = 36) celler under hypoxi (fig. 5,

28S

). På grund af de varierende niveauer af ekspression af

28s

rRNA blev rå Ct-værdier for hypoxi respons gener i stedet for traditionel delta Ct (normaliseret mod en husholdning gen), der anvendes til yderligere analyse.

histogrammer af genekspression niveauer i kontrol (

tomme barer

) og hypoxi-behandlede (30 minutter,

massive søjler

) celler. Distributionsselskaberne histogrammer blev genereret ved hjælp af den samme bin størrelse.

Selvom

28s

rRNA udtryk blev påvist i alle enkelte celler i undersøgelsen, udskrifter fra de tre andre nukleare kodede gener ikke var altid detekteret i CP-A-celler fra både kontrol- og hypoxiske grupper, mest sandsynligt på grund af deres lave overflod. For eksempel, ud af 36 enkelte celler,

MT3

udskrifter blev påvist i 33 kontrol og 34 hypoxiske enkelte celler,

PTGES

i 29 og 36, og

VEGF

i 16 og 24. i CP-C enkelte celler, dog med undtagelse af

VEGF Hotel (33 ud af 36), blev påvist udskrifter fra alle gener i alle 36 enkeltceller. Baseret på rå Ct-værdier, to hypoxi respons gener

MT3

(

s

0,001, n = 33, 35 i kontrol og hypoxiske grupper, henholdsvis) og

PTGES

(

s

10

-4, n = 27, 36) havde signifikant forøgede ekspressionsniveauer i CP-A-celler (figur 5, 6.). Interessant nok i hypoxisk CP-C celler kun

PTGES

viste en signifikant opregulering (

s

0,001, n = 36, 36), mens de to andre,

VEGF

og

MT3

, ikke (fig. 5, 6). Differential

VEGF

genekspression under hypoxi blev ikke observeret i enten CP-A eller CP-C ved encellede niveauer. I modsætning til de undersøgte mitokondrielle gener, vi ikke observere så mange statistisk signifikante forskelle i skævhed og kurtosis parametre for de enkelt celle genekspression distributioner (fig. 4A-D) mellem normoxiske og hypoxiske celler af begge typer. Fordelingen af ​​

PTGES

gen udstillet statistisk signifikante stigninger i både skævhed og kurtosis værdier i hypoxisk vs. normoksiske CP-C celler. De fordelingsformer af de tre andre geners ekspressionsniveauer udviste ikke statistisk signifikante ændringer som respons på hypoxi. I CP-A celler viste kun

MT3

gen en markant forøget kurtosis som reaktion på hypoxi. Alle andre gener viste ikke signifikante ændringer i encellede udtryk distributions- parametre

kasse diagram viser følgende statistiske værdier:. Åbent firkantede – gennemsnitlige, fast line – median, øvre og nedre kasse linjer – den 75. og 25. fraktiler henholdsvis øvre og nedre knurhår – den 95. og 5. percentiler henholdsvis x -. maksimale og minimale værdier

diskussion

Fundet af markant forhøjede niveauer af mtDNA i CP C i forhold til CP-A-celler (fig. 1, tabel 1) er vigtigt, da det bærer potentiel funktionel relevans. Interessant, både øget og faldt mængder af mtDNA er blevet rapporteret i forskellige typer af humane faste tumorceller. For eksempel har reduceret mtDNA-niveauer blevet fundet i prostatacarcinomceller og forbundet med invasiv fænotype [50], blev en nedregulering af mitokondriel biogenese korreleret med invasiv brystcancer [51] og æggestokkræft progression [52]. Tværtimod har forhøjede mængder af mtDNA blevet rapporteret i prostata [53], pancreas [54], hoved- og halscancer, gliomer [55], og fundet at positivt korrelere med klinisk-patologisk stadium i colorectal cancer [56], Shapovalov et al . har vist øget mtDNA niveauer og nedsat respiration satser i aggressive osteosarcomceller sammenlignet med osteoblaster eller godartede osteosarcomceller [57]. Desuden har øget mtDNA niveauer været forbundet med risikoen for at udvikle brystkræft [58] mens stigninger i mtDNA kopiere numre er blevet rapporteret i progression fra normal til at pre-malign til malign progression i endometrium [59], carcinogenese af hoved og hals kræft [60] og i progressionen af ​​esophageal pladecellecarcinom [61]. Mens den funktionelle rolle af øgede mtDNA niveauer i præmaligne til malign progression er endnu ikke klarlagt, blev opregulering af den mitokondriske biogenese foreslået at tjene som en kompenserende mekanisme for hæmmet mitochondriel funktion på grund af mtDNA skader i præmaligne læsioner [60], [61]. Det er således muligt, at dysplastiske esophageal epitelceller opregulere mitokondrie biogenese at øge den samlede tilgængelighed af skabelon for transskription, hvilket igen bør øge netto mitokondrie mRNA og de tilsvarende protein niveauer at opretholde mitokondriefunktionen. Vi bemærker, at kun en enkelt celle niveau analyse afslørede, at mtDNA niveauer mellem CP-A og CP-C-celler er signifikant forskellige, mens hovedparten-niveau analyse viste ingen signifikant forskel (fig. S3). De observerede højere asymmetri og peakedness værdier af mtDNA indhold distribution i CP-A-celler er tegn på en højere grad af afvigelse fra normalfordeling CP-A i forhold til CP-C celler. Mens funktionel relevans af dette fund er endnu ikke klarlagt, resultatet i sig selv er interessant, da det indikerer befolkning niveau forskelle mellem de to faser i præ-malign BE. Det er muligt, på grund af selektivt pres tillagt ved galde og sure opstød i spiserøret, et eller flere subkloner i mere heterogen population af metaplastisk (CP-A) celler selekteres for hvilket resulterer i en mindre heterogen, tættere på normalfordeling profil af mtDNA-indhold i de mere avancerede, dysplastiske stadie (CP-C celler) af BE. Undersøgelser med fokus på heteroplasmy af mitokondrie-DNA på single-celle niveau vil skulle gennemføres for at give mere detaljeret indblik i dette fund. Ikke desto mindre er konstateringen af ​​forhøjede mtDNA niveauer i dysplastiske være celler indikerer, at præ-malign BE progression ligner andre typer af progression (ESCC og hoved- og halskræft), og at den kan anvendes som biomarkør til tidlig opdagelse af dysplasi i forskellige vævstyper.

mitokondriemembranen potentielle (MMP) målinger afslørede markant højere relative værdier i normoxisk CP-C (1,86 ± 0,41) sammenlignet med CP-A (0,80 ± 0,17) celler (fig. 1, tabel 2 ). Når normaliseret mod mtDNA kopiantallet, den gennemsnitlige relative MMP værdier er omkring 37% højere i CP-C end i CP-A-celler. Dette resultat viser, at de dysplastiske celler i gennemsnit pr mtDNA molekyle opretholde højere MMP værdier end de metaplastiske celler.