PLoS ONE: Blærekræft Biomarkør Discovery Brug Global metabolomiske profilering Urine

Abstrakt

Blærekræft (BCA) er en fælles malignitet i hele verden og har en høj sandsynlighed for tilbagefald efter indledende diagnostik og behandling. Som et resultat, tilbagevendende overvågning, primært involverer gentagne cystoscopies, er en kritisk komponent af post diagnose patientbehandling. Da cystoskopi er invasiv, dyrt og en mulig afskrækkende på patientens overholdelse af regelmæssig opfølgning screening, at nye ikke-invasive teknologier hjælpe med påvisning af recidiverende og /eller primær blærekræft er stærkt behov for. I denne undersøgelse blev massespektrometri baseret metabolomics anvendes til at identificere biokemiske signaturer i human urin, der adskiller blærekræft fra kontroller uden cancer. Over 1000 forskellige forbindelser blev målt herunder 587 navngivne forbindelser med kendte kemiske identitet. Indledende biomarkør identifikation blev udført ved hjælp af en 332 emne prøve sæt retrospektive urinprøver (kohorte 1), som omfattede 66 BCA positive prøver. Et sæt af 25 kandidat biomarkører blev udvalgt på baggrund af statistisk signifikans, fold forskel og metabolisk vej dækning. De 25 kandidat biomarkører blev testet mod et uafhængigt urinprøve sæt (kohorte 2) brug af vilkårlig skov analyse, med palmitoyl sphingomyelin, laktat, adenosin og succinat giver den stærkeste forudsigelseskraft til differentiering kohorte 2 kræft fra ikke-cancer uriner. Kohorte 2 metabolit profilering afslørede yderligere metabolitter, herunder arachidonat, der var højere i kohorte 2 kræft vs kontrol ikke-kræft, men lå under kvantificeringsfremgangsmåder grænser i kohorten en profilering. Metabolitter i forbindelse med lipidmetabolisme kan være særligt interessante biomarkører. Resultaterne tyder på, at urin metabolitter kan give en tiltrængt non-invasiv supplement diagnostik til cystoskopi til påvisning af blærecancer og tilbagevendende sygdomsbehandling

Henvisning:. Wittmann BM, Stirdivant SM, Mitchell MW, Wulff JE, McDunn JE , Li Z, et al. (2014) Blærekræft Biomarkør Discovery Brug Global metabolomiske Profilering af urin. PLoS ONE 9 (12): e115870. doi: 10,1371 /journal.pone.0115870

Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: 23. maj 2014; Accepteret: November 27, 2014; Udgivet: 26 December, 2014

Copyright: © 2014 Wittmann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Finansiering af prøvetagning og anmærkning blev støttet af tilskud NIH 1R01-CA151489-01 (Bogdan Czerniak PI), og NIH /NCRR 5 UL1 RR24982 -02 (YL co-investigator). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Metabolon erhvervet prøver på gebyr pr stikprøvebasis

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: BMW, SMS, MWM, JEM, ZL, BPN, MVM og RLW er ansat i Metabolon Inc .; YL samarbejder om undersøgelser med Abbott, Cepheid og Pacific Edge, men ikke som konsulent eller højttaler. Disse konkurrerende interesser ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle tidsskrift politikker vedrørende datadeling og materialer.

Introduktion

I USA, blærekræft er 4

th mest almindelige kræftform hos mænd og 11

th mest almindelige kræftform hos kvinder [1]. I USA for 2012, blev det anslået, at 73.000 nye tilfælde ville blive diagnosticeret og 15.000 mennesker ville dø fra [1] sygdom. Patienter med blærekræft oftest til stede med hæmaturi [2]. Diagnose af blærekræft, i disse patienter med hæmaturi, involverer primært cystoskopi sammen med billeddannelse, cytologi og biopsi [3]. Cystoskopi og cytologi er de aktuelle standarder for første diagnose og tilbagefald, men der findes begrænsninger. Cystoskopi kan undlade at visualisere visse områder inde i blæren og kan også ikke opdager alle cancere, især nogle tilfælde af carcinoma in situ [4]. Cytologi har høj specificitet og selektivitet for høj kvalitet tumorer men formår ikke at levere stærke prædiktiv værdi for lav kvalitet tumorer [5]. Behandlingsmuligheder er baseret på mellemstationer, og om der er muskelvæv invasion. Et flertal af blære kræft (75%) er urothelial carcinomer klassificeret som ikke-muskel invasive blære kræft (NMIBC). I NMIBC, ca. 70% af patienterne til stede med stadie PTA, 20% med PT1 og 10% med carcinoma in situ (CIS) [6]. Den gentagelse sats for NMIBC efter tumor resektion er høj, med skøn spænder fra 35 til 80% [6], [7]. På grund af risiko for tumor recidiv eller progression, etablerede retningslinjer anbefaler, at NMIBC patienterne overvåges efter første diagnose og behandling [8], [9]. En regelmæssig tidsplan for cystoskopi anbefales til overvågning ved en frekvens på hver 3-6 måned i 3 år og årligt er der efter [10], [11]. Som et resultat heraf kan blærecancer ses som en kronisk sygdom med livslang opfølgning påkrævet. Langsigtet overvågning stole på cystoskopi, ud over at være invasive, har potentiale for bivirkninger og kan involvere betydelige langsigtede udgifter lange [12], [13]. Desuden kan patienten aversion mod cystoskopi resultere i reduceret patient compliance med regelmæssige overvågnings- anbefalinger [14]. Der er et stærkt klinisk behov for en ikke-invasiv, billigt alternativ til cystoskopi, som vil hjælpe med til detektion af primære cancere, overvåge tilbagefald og hjælpe stratificere patienter som til risiko for tilbagefald og progression. Nylige fremskridt i metabolomics har åbnet op for muligheden for at bruge urin metabolitter som biomarkører for kræft [15] – [18]. En række undersøgelser har sammenlignet metabolit forskelle i blæretumorer forhold til godartet væv og har identificeret kandidat kræft biomarkører [19] – [23]. En undersøgelse undersøgte også forskelle i urin metabolitter mellem patienter med blærekræft i forhold til kræft gratis kontrol [19]. Tidligere undersøgelser blev ofte begrænset i antallet af fundne navngivne metabolitter og en mere omfattende metabolit profilering kan give ny kandidat biomarkører og prædiktive algoritmer. Vi rapporterer her den metabolomiske profilering af urin fra to grupper af patienter blærecancer og deres respektive non-cancer kontroller. Dataene tyder flere kandidat blærekræft biomarkører, som kan tilbyde prognostisk værdi i at identificere kræft positive urinprøver.

Materialer og metoder

Patient Selection

Retrospective (kohorte 1) og fremtidige ( kohorte 2) urinprøve sæt blev opnået fra en IRB-godkendt urin repository (IRB # CR00008160 /STU032011-187) ved University of Texas Southwestern Medical center (UTSW). Alle forsøgspersoner blev givet samtykke med skriftlige samtykke. Kohorte 1 blære kræft positive urinprøver var fra fag præsenterer sig med enten primær eller tilbagevendende kræft. Bortfalder urinprøver blev opnået før cystoskopi for motiver fra kohorte 1 blære kræft positiver, sammen med kræft historie og hæmaturi kontrol. Cystoscopies blev gennemført som en del af løbende overvågning eller til detektering kræft og resultater blev anvendt til at diagnosticere aktuel kræft status, enten til stede eller fraværende. Kohorte 2 urinprøver blev opnået fra individer der præsenterer med hæmaturi eller fra personer med en historie af sygdom gennemgår overvågning. Blærekræft positive urinprøver i kohorte 2 blev opnået fra individer der præsenterer med enten primær eller recidiverende sygdom. Metadata om alder, køn, race, og kræft scene og kvalitet var til rådighed for begge kohorter.

metabolomiske Profilering

massespektrometret platforme, prøve udvinding og forarbejdning, instrumentets indstillinger og betingelser, og data håndtering er tidligere blevet beskrevet detaljeret [24]. Kort beskrevet kan hovedkomponenterne i processen sammenfattes som følger. Osmolalitet på hver urinprøven bestemmes inden forarbejdning. En cocktail af genvindingsstandarder blev sat til urinprøverne og 100 ul aliquoter blev ekstraheret i 500 ul methanol. Den resulterende ekstrakt blev delt i tre fraktioner for målrettede metabolisk profilering og randomiseret til analyse. Hver prøve blev tørret under vakuum for at fjerne organisk opløsningsmiddel. Prøver blev karakteriseret ved anvendelse af tre uafhængige platforme: ultra-performance væskekromatografi /tandem massespektrometri (UHPLC-MS /MS) i den negative ion-mode, UHPLC-MS /MS i positiv ion-mode og gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS ) efter sialylering. Reproducerbarheden af ​​udvinding protokollen blev vurderet ved inddrivelse af miljøfremmede stoffer spiket i hver urinprøve inden ekstraktionen. Kohorte 1 uriner blev analyseret ved anvendelse af en platform bestående af en Waters ACQUITY UHPLC (Waters Corporation, Milford, MA, USA) og en Thermo-Finnigan LTQ massespektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. USA), mens kohorte 2 var analyseres med en platform bestående af en Waters ACQUITY UHPLC og en ThermoFisher Scientific Orbitrap Elite høj opløsning /nøjagtig-mass massespektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. USA). Forbindelserne blev identificeret ved sammenligning med bibliotekets registreringer oprensede standarder eller tilbagevendende ukendte enheder. Identifikation af kendte kemiske enheder var baseret på sammenligning med metabolomiske bibliotek registreringer oprensede normer baseret på kromatografiske egenskaber og massespektre. Mens dette skrives, var mere end 4000 kommercielt tilgængelige oprensede standard forbindelser er erhvervet og registreret i LIMS til distribution til både LC og GC-platforme til bestemmelse af deres analytiske egenskaber. Yderligere enheder (unavngivne forbindelser) blev identificeret i kraft af deres tilbagevendende karakter (både kromatografiske og masse spektral). Disse forbindelser har potentialet til at blive identificeret ved fremtidig erhvervelse af en matchende renset standard eller ved klassisk strukturanalyse.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført i F-version 2.14.2 [25] . Wilcoxon test blev anvendt til at bestemme den statistiske signifikans af metabolit gennemsnitlige forskelle mellem sammenligningsgrupperne. For alle analyser blev manglende værdier (hvis nogen) tilskrives med den observerede minimum for den pågældende forbindelse (imputerede værdier blev tilsat efter blok-normalisering). De statistiske analyser blev udført på naturlige log-transformerede data for at reducere effekten af ​​eventuelle outliers i dataene. Desuden blev data normaliseret prøve osmolaliteten til at kompensere for forskelle i urin koncentration. Tilfældig skov er en overvåget klassifikation teknik baseret på et ensemble af beslutningstræer [26], og blev udført i R-version 2.14.2. Hierarkisk klyngedannelse for blærekræft og kontrol urin overflod profiler blev udført i ArrayStudio version 5.0 ved hjælp af komplet kobling og Pearsons korrelation som ligheden metriske (OmicSoft, Raleigh, NC). Beregninger af AUC og ROC kurver blev udført ved hjælp af PROC pakke i R [27]. Den multi-biokemiske algoritme, der anvendes til at generere AUC og ROC kurver, blev trænet og testet fra data, der blev genskalerede så medianerne for både kohorte-1 og kohorte-2 negativer var lig med 1. rescaling tillader algoritme test på en skala passende for de monterede koefficienter afledt træningssættet.

Resultater

emne befolkninger

Urin stofskifteprofil blev udført på to underlagt kohorter. Kohorte 1 blev anvendt som en sonderende /biomarkør identifikation indstillet til at identificere biokemikalier, hvis niveauer var forskellige i de urinen af ​​blærekræft urinen i forhold til niveauet i kontrol uriner. Kohorte 2 blev anvendt som en anden opdagelse sæt og teste den prædiktive værdi af kandidat biomarkører valgt fra kohorten 1 datasættet, men da kohorte 2 prøver blev analyseret på en mere følsom massespektrum platform, metabolitter, som kun blev målt i kohorten 2 prøverne var også af interesse. Kohorte 1 var en retrospektiv urinprøve sæt indsamlet ved University of Texas Southwestern, mens kohorte 2 prøver blev indsamlet prospektivt ved samme institution. Et resumé af patientens demografi for de to kohorter er vist i tabel 1. Kohorte 1 omfattede 66 urinprøver fra individer diagnosticeret med BCA og 266 ikke-BCA kontroller. Urinen i kohorte 1 blev indsamlet fra individer med enten primær eller recidiverende sygdom. Nogle forskelle i de samlede køn og race kompositioner var til stede i kohorte 1. Ikke-BCA kontroller i kohorte 1 kan opdeles i tre populationer: 1) fag præsenterer sig med hæmaturi; 2) personer med en historie af BCA, men ingen af ​​de nuværende sygdom og 3) normale forsøgspersoner uden historie BCA. Kohorte 2 bestod af 29 urinprøver fra individer diagnosticeret med BCA og 79 ikke-BCA kontroller. Som i kohorte 1, var der nogle forskelle i køn og race balance mellem BCA og ikke-BCA kontroller. Kohorte 2 uriner blev opnået fra individer med enten primær eller tilbagevendende sygdom i et forhold identisk med den for kohorte 1 (59% tilbagevendende: 41% primært). Også at bemærke var en kohorte forskel i procent af høj kvalitet vs. lav kvalitet BCA tumorer, med kohorte 1, som har en langt højere procentdel af høj kvalitet BCA (79%) end gruppe 2 (59%).

metabolomiske profilering og analyse

Urinprøver blev udvundet og metabolisk profilering blev udført ved hjælp af positive (+) og negative (-) LC-MS /MS og også GC-MS, for at opnå bred dækning af de biokemikalier nuværende. MS toppe blev identificeret under anvendelse Metabolon proprietære peak integration /identifikation software, ved at sammenligne MS peak data til den for et bibliotek af oprensede standarder eller tilbagevendende ukendte enheder. Efter imputering af minimum observerede værdier, log transformation og normalisering procedurer, blev statistisk analyse udført for at identificere statistisk signifikante forskelle i metabolit niveauer mellem sammenligningsgrupperne. Profilering af kohorte 1 målte 499 navngivet og 624 unavngivne biokemikalier, mens profilering af kohorte 2 målt 587 navngivet og 541 unavngivne biokemikalier. Lister over alle navngivne metabolitter målt i de to kohorter er vist i S1 S2 tabeller. Det øgede antal navngivne forbindelser målt i kohorte 2, i forhold til kohorte 1 til dels afspejler en større følsomhed af nøjagtig masse MS instrument, der anvendes til kohorte 2 og en udvidelse af den biokemiske bibliotek i tidsperioden mellem profilering kohorter 1 og 2 . En Wilcoxon to prøve test blev anvendt til at identificere statistisk signifikante forskelle i metabolit niveauer i kohorte 1 BCA urinen i forhold til at kontrollere urinen. Statistisk analyse blev udført sammenligne BCA urinprøver til alle kontrolgrupper kombineret; eller sammenligne BCA til hvert kontrolpunkt undergrupper. Antallet af statistisk signifikante forskelle i nævnte forbindelse niveauer varierede fra 178 til 233 på tværs af de forskellige sammenligninger (tabel 2). Samlet set har antallet af statistisk signifikante biokemikalier ikke variere meget, når man sammenligner BCA positive prøver til de forskellige kontrolgrupper. Analyse af kohorte 2 BCA uriner vs. kontrol, ved hjælp af en Wilcoxon test, identificeret 75 navngivne biokemikalier som viser statistisk signifikante forskelle med 70 biokemikalier forhøjede og 5 biokemikalier lavere i BCA urinen i forhold til at kontrollere urinen (tabel 2). Det mindre antal statistisk signifikante forskelle i kohorte 2 i forhold til kohorte 1 kan afspejle, i en del, de lavere prøvenumre i kohorte 2. Den højere procentdel af højere stadie tumorer i kohorte 1 i forhold til kohorte 2 kan også have påvirket antallet af statistisk signifikante forskelle observeret.

Identifikation af kandidat biomarkører

En strategi blev ansat til at bruge kohorte 1 til at identificere kandidat biomarkører og at rangere de mest interessante kohorte 1 biomarkører for BCA forudsigelighed ved hjælp af kohorten 2 prøver indstillet. En arbejdsgang diagram over den anvendte strategi for biomarkør test og bekræftelse vises i fig. 1. Hierarkisk klyngedannelse blev udført på kohorten en datasættet ved hjælp af alle prøver (332) og alle navngivne biokemikalier, eksklusive eksogene stoffer (i alt = 442). Resultaterne af den hierarkiske klyngedannelse er vist i fig. 2, med en vis grad af BCA prøve klyngedannelse observeret. De klyngedannelse resultater tyder på, at metabolit forskelle mellem kræft og ingen cancer findes grupper, og at disse forskelle har en kapacitet til at differentiere urinprøverne

Forkortelser:. HX, BCA negativ, men med historie BCA; Hema, BCA negative præsentere med hæmaturi.

Emne BCA diagnose (post urinopsamling) er angivet i den nederste bar. Clustering blev udført ved hjælp af komplet kobling og Pearsons korrelation som ligheden metriske.

Udvælgelse af biomarkør kandidater fra kohorte 1 datasættet

En Wilcoxon test blev anvendt til kohorte en profilering af data at sammenligne urinprøver fra personer med aktuelle BCA til urinen fra tre adskilte kontrolgrupper: 1) fag præsenterer med hæmaturi; 2) personer med en historie af BCA, men ingen aktuelle sygdom eller 3) normale forsøgspersoner med ingen historie BCA. Desuden blev en Wilcoxon-testen anvendt sammenligne BCA urinprøver til en kontrolgruppe bestående af alle ikke-BCA uriner tilsammen. En Heatmap og statistik for alle målte metabolitter for de 4 forskellige sammenligninger er indeholdt i S1 tabel. Kombineret, blev 290 statistisk signifikante forskelle i navngivne metabolitter er identificeret mellem tre separate BCA /komparator analyser, med 135 metabolitter viser statistisk signifikante forskelle på tværs af alle tre BCA til negativ kontrol sammenligninger (hæmaturi, historie, normal; S1 Table). For at reducere det samlede antal metabolit forskelle ned til en mere håndterbar sæt “bedste biomarkør kandidater” blev flere filtreringskriterier anvendt. Filtre inkluderet: 1) metabolitter med BCA til kontrolniveauer, der var statistisk signifikant i mindst 3 af 4 BCA med kontrolgruppen sammenligninger; 2) metabolit forskelle viser den laveste p-værdi (alle p ≤ 0,05); 3) største fold forskelle mellem BCA og kontrol; 4) målt i 50% af urinprøver; 5) kræft fænotype forening; 6) dækning af flere metaboliske veje; 7) navngivne kun forbindelser; 8) udelukkelse af exogene forbindelser (fx xenobiotika lægemidler). Anvendelse af disse udvælgelseskriterier vi udpeget et panel af 25 kandidat biomarkører for yderligere analyse. Sættet af 25 kandidat biomarkører vises i Heatmap i fig. 3, sammen med den statistiske resultater i hver af 3 mulige BCA at kontrollere gruppesammenligninger. Også vist i fig. 3 er et blærecancer delmængde analyse sammenligner kun ikke-muskel invasive blære kræft til historien kontrolgruppen. Ved sammenligning alle BCA prøver til hver af kontrolgrupperne, alle biokemikalier med undtagelse af den forgrenede aminosyrer (BCAA) leucin, isoleucin og valin vises p ≤ 0,05 statistisk signifikans i alle 3 kontrolgruppemetoder sammenligninger. 3-hydroxybutyrat og gluconat var den mest forhøjede i BCA urinen, mens anserine og 3-hydroxyphenylacetat og pyridoxate blev mest reduceret i BCA vs. kontrol uriner. Størstedelen af ​​biomarkør kandidater som opnået statistisk signifikans, når alle BCA prøver blev sammenlignet med den historie kontroller vises også statistisk signifikante forskelle, når kun NMBIC prøver blev sammenlignet med historie kontroller. Differentiering af NMBIC kræftformer er vigtigt, fordi de vil være mere fremherskende i patienter under aktiv overvågning. De 25 kandidat biomarkører valgt fra kohorten 1-data blev anvendt i en hierarkisk klyngedannelse analyse af kohorte 1 prøver. Gruppering af BCA og kontrolprøver blev observeret, hvilket indikerer, at differentierede niveauer af de 25 biokemikalier tilbyde en vis grad af urinprøve lagdeling baseret på diagnose (fig. 4).

Red fylde celler indikerer metabolitter med højere gennemsnitlige niveauer i BCA urinen end i ikke-BCA kontrol ved ap≤0.05 betydning. Grønne celler indikerer lavere niveauer i BCA i forhold til at styre urinen på en p ≤ 0,05 betydning. Statistiske q-værdier og profilering resultater for alle andre navngivne forbindelser målt i kohorte 1 prøver præsenteres kro S1 tabel.

Emne BCA diagnose (post urinopsamling) er angivet i den nederste bar. Clustering blev udført ved hjælp af komplet kobling og Pearsons korrelation som ligheden metriske.

Kohorte 1 kandidat biomarkører, der bedst adskiller kohorte 2 prøver

Et tilfældigt skov analyse blev udført ved hjælp af 25-kohorten 1 biomarkør kandidater til at stratificere kohorten 2 prøvesæt i deres rette kræft og ikke-kræft grupper. Tilfældig skov er et ensemble metode baseret på træerne klassificering og ud-af-posen fejl giver et skøn over, hvor godt vi kan forvente at forudsige en fremtidig prøve. Den tilfældige skov analyse giver en “betydning” rang bestilling af biokemikalier. Den relative betydning af hver af de 25 metabolitter er vist i fig. 5, med palmitoyl sphingomyelin viser den største diskriminerende effekt (højere gennemsnitlige fald nøjagtighedsværdi). De øverste 6 diskriminerende metabolitter i tilfældig skov analyse udgjorde 3 metabolitter, som var højere i BCA urinprøver og 3, der var lavere i BCA prøver. En sammenligning af de relative niveauer for disse 6 metabolitter i alle kræft urinen versus alle ikke-cancer kontrol i de to kohorter vises i fig. 6. Forskellene i relative niveauer for hver af de 6 metabolitter var statistisk signifikant (p ≤ 0,05) i begge kohorter, med undtagelse af succinat som opnåede en p-værdi på 0,053 i kohorten 2 sammenligning. Desuden blev NMIBC delmængde af BCA prøver sammenlignet med alle kontrolprøver og 4 af de 6 metabolitter fortsat opnå statistisk signifikans på et p ≤ 0,05 niveau, med phosphocholin og succinat er undtagelsen (fig. 6). Phosphocholin og succinat var statistisk signifikant på et p≤0.1 niveau.

Metabolitter er rangordnet efter deres gennemsnitlige mindske nøjagtighed score. En højere gennemsnitlig reduktion nøjagtighed værdi angiver en større forudsigelsesværdi. De 6 indrammede datapunkter repræsenterer mest effektive metabolitter sammenfattet i fig. 6.

Sammenligninger er for alle BCA positive urinprøver versus kombinere BCA negative kontroller. Mørke røde og mørkegrønne celler repræsenterer fold forskelle med en p ≤ 0,05. Lys grøn celle med blå tekst repræsenterer p≤0.1. BLQ: under grænsen for kvantificering; NA:. Ikke relevant

Ekstra biomarkør kandidater observeret i kohorte 2 urinprøver

Metabolisk profilering af kohorte 2 urinprøver blev udført ved hjælp af en mere følsom accurate- masse MS-platform, som kan måle urin metabolitter til stede ved lavere koncentrationer. En Heatmap indeholder alle navngivne metabolitter målt i kohorte 2 prøver aflægges i S2 tabel. Arachidonat, spermidin, spermin og cytosin, blev ikke målt i kohorte 1 urinen, men blev forhøjet i kohorte 2 BCA urinen ved p ≤ 0,05 (fig. 6). Arachidonat blev også forhøjet i NMIBC tumor urinen til en statistisk signifikant niveau, når de NMIBC prøverne var adskilt og analyseret adskilt fra MIBC tumor urinen (fig. 6). Spermin, spermidin og cytosin blev forhøjet i NMIBC urinprøver så godt, men ikke på statistisk signifikante niveauer. Disse fire metabolitter kan også betragtes som kandidat biomarkører, men bekræftelse ville kræve en uafhængig kohorte, der også var blevet profileret på nøjagtig-mass instrument.

Multi-analyt algoritme ydelse med et sæt af 6 biomarkører

Som testeksempel af potentiel biomarkør ydeevne i en multi-analyt algoritme, palmitoyl sphingomyelin, lactat, gluconat, adenosin, 2-methylbutyrylglycine og guandinoacetate blev valgt til algoritme træning med kohorten-1 datasæt. Disse kandidat biomarkører blev valgt på baggrund af deres fold forskelle og p-værdier i både kohorte-1 og kohorte-2. Algoritmen stammer fra træning på kohorten-1 datasættet blev testet på kohorten-2 datasæt. AUC og ROC kurver for både uddannelse og test sæt analyse vises i fig. 7. Sammenlignelige AUC blev opnået for begge kohorter, med AUC = 0,81 for kohorte-1 og 0,78 for kohorte-2. Specificitet værdier fortsat høj, op til en følsomhed cutoff på omkring 0,5, i begge kohorter. Udførelsen observeret ved hjælp af denne algoritme ikke udlede fremtidige prædiktiv værdi, eftersom biomarkører anvendes i algoritmen blev præ-udvalgt på baggrund af deres tumor differentiering evne i begge kohorter. Dette eksempel illustrerer, at det er muligt at udlede en algoritme, som udskiller tumor fra kontrolprøver urinen i begge disse specifikke kohorter.

En algoritme, benytter det kandidat biomarkører palmitoyl sphingomyelin, lactat, gluconat, adenosin, 2-methylbutyrylglycine og guanidinoacetate blev trænet ved hjælp kohorten-1 datasæt og derefter testet på kohorten-2 datasæt. ROC kurver med AUC vises for uddannelse sæt (A.) og testen sæt (B.).

Diskussion

Blærekræft er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed med en høj gentagelse sats og behovet for hyppig opfølgning overvågning. I øjeblikket, overvågning for tilbagefald kræver cystoskopi på en semi-rutinemæssigt, typisk indtil en omfattende sygdomsfri periode er udløbet. En mere letkøbt, mindre invasiv diagnostisk metode ville være en fordel for patientbehandling og kan øge overholdelse opfølgende overvågning. Måling af urin metabolitter kan give en kammerat diagnostisk metode, der kunne lette overvågningen af ​​blærekræft tilbagefald og måske også bidrage til primær diagnose.

Nylige metabolomiske undersøgelser har vist værdifulde i at identificere kræft biomarkører og i at få indsigt i, hvilken rolle af metabolisk omprogrammering i initiering og progression af maligne sygdomme. Metabolisk omprogrammering i tumorceller er et almindeligt fænomen, og er nu anerkendt som en spirende kendetegnende for kræft [28]. Ændringer i metabolit niveauer som følge af tumor metaboliske omprogrammering kan tilbyde unikke muligheder for biomarkør opdagelse. For eksempel er 2-hydroxyglutarate forøget i gliomer, myelomatose og tyktarmskræft [29] og forhøjede sarcosin er forbundet med prostata og colorectal cancer [30], [31]. Metabolitter i forbindelse med tumorcelle metaboliske omprogrammering eller måske tumor-stromale interaktioner kan forventes at vise en ændring i niveauer ikke kun i tumorvæv selv, men også i matricer, såsom blod eller urin, som understøtter optagelse eller udskillelse af biokemikalier tilsluttet tumorvækst eller invasion. Flere undersøgelser har rapporteret om nytten af ​​metabolit biomarkører til at diagnosticere, stratificere og overvåge kræftpatienter [31] -. [34]

Den foreliggende undersøgelse profilerede 430 urinprøver fra to kohorter af fag, med kendt positiv eller negativ BCA diagnoser og som sådan, er den mest omfattende screening for blærekræft urin metabolit biomarkører til dato. Tidligere undersøgelser har målt et begrænset antal metabolitter i urinen (typisk mindre end 25). Den ikke-målrettede UPLC /massespektrometri baseret teknologi platform ansat i denne undersøgelse letter identifikation og relative kvantificering af 500 kemiske forbindelser, i urinprøver, i høj grad udvider antallet af potentielle biomarkør kandidater end dem, der tidligere er beskrevet. 25 metabolitter blev udvalgt fra kohorte 1 til evaluering i den uafhængige kohorte 2 datasæt. De 25 biokemikalier identificeret som kandidat biomarkører dækkede en bred vifte af metaboliske veje. Mens de 25 kandidat biomarkør sæt indeholdt både øget og nedsat metabolitter – valgt at bedste udforske multi-analyt forudsigende algoritmer – hypoteser for øget urin metabolitter i BCA lettere genereres end hypoteser for faldt metabolit niveauer. Øget metabolitter kunne stamme fra tumor metabolitter udskilles i urinen eller fra nedbrydning eller ændring af ikke-malignt væv forårsaget af invasion af tumor gennem epitel væg. Inflammatoriske reaktioner som følge af tilstedeværelsen af ​​tumor kan også resultere i forhøjede niveauer af metabolitter. Fald i metabolitter kan skyldes en lavere metabolitudskillelse af tumorceller i forhold til normale epitel eller af en optagelse af metabolitter fra urinen ind i tumoren eller tilstødende væv. Ændringer i systemisk metabolisme forårsaget af faktorer frigivet af blæretumorer eller ombygget tilstødende væv og efterfølgende urinudskillelse, kan også forårsage ændringer i urin metabolit niveauer, både stigninger og fald. 25 metabolitter blev valgt som biomarkør kandidater fra kohorten en datasættet baseret på flere kriterier. Den tilfældige skov analyse teste de 25 metabolitter mod kohorten 2 datasæt illustreret, at en delmængde af de 25 stod som bedre kunstnere. Palmitoyl sphingomyelin, lactat, adenosin og succinat havde den højeste prædiktive værdi, med andre metabolitter udviser en række reducerede værdier. En mulig forklaring på den svagere udvikling af mange af kohorte 1 kandidat biomarkører kan være, at kohorte 1 blærekræft positive urinprøver blev afledt af en højere procentdel af individer med høj fase /høj kvalitet tumorer end de der findes i patienter fra kohorten 2. Det er også muligt, at mange af de kohorte 1 kandidat biomarkører var falske positiver følge af unikke kendetegn ved den pågældende prøve befolkning

de 25 kohorte 1 kandidat biomarkører repræsenterer et bredt sæt af metaboliske veje -. delvis fordi sti forskellighed var et filter til valg af sæt af 25 fra 200 metabolitter med statistisk signifikante forskelle sammenligne kohorte 1 BCA positive urinprøver fra den kombinerede gruppe af alle negative kontroller. Flere veje repræsenteret ved kandidatlandenes metabolitter var af særlig interesse. En større metaboliske kendetegnende for kræft er den hyppigt observerede skift fra oxidativ fosforylering til en større afhængighed af glukosemetabolismen gennem glycolysen, selv under aerobe betingelser (Warburg stofskifte) [35]. Mens mange forskellige mekanismer antages at bidrage til denne kontakt i metabolisk aktivitet, indbefatter resultater øget optagelse og forbrug af glucose, øget lactat produktion og udskillelse, høj citrat produktion og øget pentosephosphatvejen (PPP) aktivitet. Opregulering disse pathways giver energi, fedtsyre, nukleotid biosyntese, og NADPH generation [36], [37]. Laktat niveauer blev øget markant i de urinprøver fra patienter blærekræft i kohorter 1 og 2 og kan være en indikation af øget glykolysen i BCA celler. Foruden lactat, blev β-hydroxypyruvate, som ikke tidligere er blevet forbundet med tumor metabolisme, signifikant forhøjede i urin af primær blære cancerpatienter. β-hydroxypyruvate kan tilsluttes glykolyse selvom dens dannelse via serin-pyruvat transaminase reaktion eller dets afledning fra glycolyse mellemprodukt 3-phosphoglyceratkinase [38].

Tre metabolitter forbundet med lipidmetabolisme, palmitoyl sphingomyelin, phosphocholin og arachidonat (kun kohorte 2) blev ændret betydeligt i urin af BCA fag. Dette var noget overraskende, eftersom;