PLoS ONE: EGFR-målrettet TRAIL og en Smac Mimetic synergi at overvinde Apoptose Modstand i KRAS Mutant Kolorektal Cancer Cells

Abstrakt

TRAIL er en død receptor ligand, der inducerer celledød fortrinsvis i tumorceller. Rekombinant opløseligt TRAIL imidlertid udfører dårligt som et anti-cancer terapeutisk fordi oligomerisation er nødvendig for potente biologiske aktivitet. Vi har tidligere genererede et diabody format tumor-målrettede TRAIL betegnet Db

αEGFR-scTRAIL, der omfatter enkeltstrengede TRAIL molekyler (scTRAIL) og de variable domæner af et humaniseret variant af EGFR blokerende antistof Cetuximab. Her definerer vi bioaktivitet Db

αEGFR-scTRAIL både med hensyn til EGFR hæmning og TRAIL receptor aktivering i 3D kulturer af Caco-2 kolorektal cancer celler, som udtrykker vildtype K-Ras. Sammenlignet med konventionelle 2D kulturer, Caco-2 celler vises kraftigt forøget følsomhed over for Db

αEGFR-scTRAIL i disse 3D kulturer. Vi viser, at antistoffet delen af ​​Db

αEGFR-scTRAIL ikke kun effektivt konkurrerede med ligand-induceret EGFR-funktion, men også bestemt det apoptotiske respons ved specifikt at dirigere Db

αEGFR-scTRAIL til EGFR-positive celler. For at løse hvordan aberrerende aktiveret K-Ras, som fører til Cetuximab modstand, påvirker Db

αEGFR-scTRAIL følsomhed, vi frembragte stabile Caco-2tet celler inducerbart udtrykker oncogen K-Ras

G12V. I nærvær af doxycyklin, udviste disse celler forøget resistens over for Db

αEGFR-scTRAIL, der er forbundet med den forhøjede ekspression af de anti-apoptotiske proteiner cIAP2, Bd-XL og Flip

S. Co-behandling af celler med Smac mimetiske SM83 genoprettede Db

αEGFR-scTRAIL-induceret apoptotisk respons. Vigtigere er det, denne synergi mellem Db

αEGFR-scTRAIL og SM83 også oversat til 3D kulturer af onkogen K-Ras udtrykker HCT-116 og LoVo kolorektal kræftceller. Vores resultater understøtter således den opfattelse, at Db

αEGFR-scTRAIL terapi i kombination med apoptose-sensibiliserende midler kan lovende til behandling af EGFR-positive kolorektal kræft, uafhængigt af deres

KRAS

status.

Henvisning: Möller Y, Siegemund M, Beyes S, Herr R, Lecis D, Delia D, et al. (2014) EGFR-målrettet TRAIL og en Smac Mimetic synergi at overvinde Apoptose Modstand i

KRAS

Mutant Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 9 (9): e107165. doi: 10,1371 /journal.pone.0107165

Redaktør: John Souglakos, University Hospital of Heraklion og Laboratoriet for Tumor Cell Biology, School of Medicine, University of Crete, Grækenland

Modtaget: Juni 2, 2014; Accepteret: 4. august, 2014 Udgivet: 8 September, 2014

Copyright: © 2014 Möller et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev finansieret af Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; https://www.bmbf.de/) e:. Bio tilskud “PREDICT ’til MAO, RK og KP. RH og tuberkulose er understøttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; https://www.dfg.de/) via Collaborative Research Centre 850 og Excellence Initiativ fra BMBF via EXC 294 BIOSs. TB og MAO understøttes af Heisenberg program DFG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. DL og DD er opfindere på patentet WO /2013 /124.701 (PCT /IB2012 /000.297: “homo- og heterodimere SMAC mimetiske forbindelser som apoptose induktorer«). KP og RK og MS er opfindere på patentet CA2831820 A1 (PCT /EP2012 /001.426: “rekombinant TNF ligand familiemedlem polypeptider med antistofbindingsdomæne og anvendelser deraf«). KP er konsulent og har modtaget kommercielle forskningsmidler fra SMV. RK er en konsulent og har modtaget kommercielle forskningsmidler fra BioNTech. Forfatterne bekræfte, at dette ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest udbredte kræftformer i hele verden og især i patienter med fremskredne CRC overlevelsesrater er lave [1]. Foruden kemoterapi, har målrettede behandlinger indtastet klinikken. I øjeblikket er EGFR (epidermal vækstfaktor receptor) blokerende antistoffer Cetuximabs og Panitumumab er godkendt til behandling af metastaserende CRC i kombination med kemoterapi eller som vedligeholdelsesbehandling i kemo-refraktære tumorer [2], [3].

EGFR, også kendt som ErbB1 eller HER1, er forbundet med patogenesen af ​​forskellige humane epiteliale cancere. Denne receptortyrosinkinase omfatter et ekstracellulært ligandbindende domæne, en enkelt membranspændende region og en cytoplasmisk tyrosinkinasedomæne [4], [5]. Ved binding af ligander, såsom EGF og TGF-α, receptoren homo- og heterodimeriserer fortrinsvis med familiemedlemmet ErbB2 /HER2 fører til receptoraktivering og transphosphorylering af specifikke tyrosiner i de cytoplasmatiske haler. Disse phosphotyrosines giver docking sites for intracellulære signalmolekyler, der udløser aktivering af MAPK og PI3K veje, der medierer biologiske reaktioner såsom spredning, migration og overlevelse [5], [6]. Cetuximab konkurrerer med EGFR ligander for receptorbinding og derved undertrykke receptor-phosphorylering og aktivering af nedstrøms signalering [1].

De forskellige genetiske ændringer fundet i CRC begrænse effektiviteten af ​​anti-EGFR terapier. Næsten 40% af alle CRC sager havnen aktiverende mutationer i

KRAS

gen. Receptortyrosinkinase-signalering konvergerer på niveauet for den lille GTPase Ras, en master regulator af både, MAPK og PI3K pathways. De hyppigste mutationer forekommer ved kodon 12 eller 13, hvilket fører til konstitutiv Ras-aktivering og dermed nedsat eller ingen respons på Cetuximab behandling [7], [8].

TRAIL (tumornekrosefaktor-relateret apoptosis- inducerende ligand) er en død ligand, der inducerer apoptose fortrinsvis i tumorceller via dødsreceptorer TRAILR1 og TRAILR2, også kendt som DR4 og DR5 henholdsvis [9]. Binding af TRAIL udløser receptor oligomerisation, efterfulgt af ansættelse af adapter proteiner og dannelsen af ​​død-fremkaldende signalering kompleks. Dette i sidste ende fører til aktivering af initiator caspaser og konsekutiv aktivering af effektorceller caspaser, hvilket resulterer i apoptotisk celledød [10]. Kliniske forsøg med rekombinant TRAIL bekræftede lav toksicitet over for normalt væv, men terapeutiske virkninger var utilstrækkelige [11], [12]. For at overvinde disse begrænsninger protein engineering metoder har til formål at forbedre bioaktivitet samtidig opretholde tumor selektivitet. Korrekt trimerisering og zink koordinering af rekombinant TRAIL synes at være afgørende for biologisk aktivitet [13]. Følgelig udformningen af ​​en enkelt polypeptidkæde, der omfatter de ekstracellulære domæner af tre TRAIL monomerer (scTRAIL) forbedret bioaktiviteten af ​​det rekombinante molekyle [14]. Sådanne molekyler kan yderligere fusioneres til antistoffer rettet mod tumor-markører. Vi har tidligere vist, at fusionen af ​​scTRAIL til et enkeltkædet antistoffragment (scFv) funktionelt efterlignes naturlige membranbundne TRAIL og var mere effektivt end scTRAIL alene [14]. Indførelsen af ​​et diabody konfiguration baseret på de humaniserede variable regioner i Cetuximab (DB

αEGFR-scTRAIL) resulterede i en endnu højere bioaktivitet af rekombinant TRAIL både in vitro og in vivo, som det ses af den stærke reduktion af tumorstørrelse og langvarig overlevelsen af ​​nøgne mus der bærer Colo205 xenografter [15].

Bortset fra dens tumortargeting effekt, EGFR-rettet antistof-delen indeholdt i Db

αEGFR-scTRAIL molekyle kan aktivt forstyrre EGFR-funktion samtidig stimulerer apoptose. For at dissekere bidrag EGFR blokade til bioaktivitet af Db

αEGFR-scTRAIL vi brugte EGFR-positive Caco-2 CRC cellelinie, som huser mutationer i APC, p53, og Smad4 men er vildtype for MAPK og PI3K pathways [16]. At efterligne in vivo-situationen nærmere, blev Caco-2-celler dyrkes i 3D kollagen /Matrigel kulturer, hvor de danner fuldstændigt differentierede polariserede cyster [17]. Vækst tilstande vides at påvirke balancen mellem overlevelse og apoptose signaler, hvilket understreger behovet for at studere narkotikabehandling og resistensmekanismer ikke kun i traditionelle 2D kulturer [18]. Faktisk viser vores resultater, at dyrkningen af ​​Caco-2-celler i en 3D-matrix gør celler TRAIL-følsomme. Vi demonstrerer endvidere, at EGFR-signalering bidrager til Caco-2-celleproliferation og kan blokeres af farmakologisk EGFR inhibition. Betydningen af ​​EGFR-antistof-del for en effektiv målretning af Db

αEGFR-scTRAIL understreges af det faktum, at lave EGFR niveauer karakterisere cellesubpopulation der overlever Db

αEGFR-scTRAIL behandling. Selv ufølsom over for EGFR blokade per se, er EGFR-positive Ras mutant CRC-celler målrettet og sensibiliseret til Db

αEGFR-scTRAIL-induceret apoptose ved samtidig behandling med Smac mimetiske SM83. Den potente cytotoksisk aktivitet af Db

αEGFR-scTRAIL afsløret i denne undersøgelse derfor giver støtte til den videre udvikling som en anti-cancer terapeutisk til behandling af CRC.

Materialer og metoder

antistoffer og reagenser

anvendte antistoffer var monoklonalt kanin-anti-pEGFR (Y1068) (1:1000), monoklonalt kanin-anti-caspase-3 (1:1000), polyklonale kanin-anti-TRAILR2 (1:500), polyklonale kanin anti-pERK (T202 /Y204) (1:1000), monoklonalt kanin-anti-Pakt (T308) (1:1000), polyklonale kanin-anti-cIAP1 (1:1000), monoklonalt kanin-anti-cIAP2 (1:1000 ), monoklonalt muse-anti-ERK (1:1000), monoklonalt muse-anti-AKT (pan) (1:1000), monoklonalt muse-anti-E cadherin (1:250), monoklonalt muse-anti-Smac (1:1000), polyklonalt kanin-anti-Bcl-2 (1:1000), monoklonalt kanin-anti-Bd-xL (1:400) og monoklonalt kanin-anti-survivin (1:1000) (alle fra Cell Signaling, Danvers, MA, USA), monoklonalt muse-anti-XIAP (1:400), monoklonalt muse-anti-Ras (1:200) (BD, CA, SanJose, USA), monoklonalt muse-anti-flips /L (1:400) og polyklonalt kanin-anti-TRAILR1 (1 :1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), monoklonalt muse-anti-EGFR (1:500) (Thermo Scientific, Fremont, MA, USA), monoklonalt muse-anti-a-tubulin (1:5000) (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA), og monoklonale muse-anti-GFP (1:1000) (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). HRP-mærket sekundært anti-muse og anti-kanin IgG-antistoffer (1:10000) var fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Alexa Fluor 488- og 546-mærket sekundært anti-muse og anti-kanin IgG-antistoffer (1:500) og Alexa Fluor 633-mærket phalloidin (1:100) var fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). DAPI var fra Sigma-Aldrich, Z-VAD-FMK var fra Bachem AG (Bubendorf, Schweiz), og Cetuximab fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Db

αEGFR-scTRAIL blev produceret i HEK293-celler og oprenset fra cellekultursupernatanter [15]. Syntesen og oprensningen af ​​SM83 er tidligere beskrevet [19], [20].

Cellekultur

Caco-2, HCT-116, og LoVo cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen ), og Caco-2tet celler i DMEM (Invitrogen) suppleret med 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland). Cellelinier blev inkuberet i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C. For vækstfaktor-afhængige assays celler blev dyrket i medium indeholdende 2% FCS plus 10 ng /ml EGF (Sigma-Aldrich) og TGF-α (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA). For vækst i 3D blev celler podet på en seng af vækstfaktor reduceres matrigel (BD) og PureCol-S collagen (Advanced Biomatrix, San Diego, CA, USA) (01:01) og overlagt med vækstmedium indeholdende 2% matrigel. Lumen ekspansion blev induceret ved tilsætning af 100 ng /ml choleratoxin. (CTX, Sigma Aldrich) på dag 3 efter podning

Generation of Caco-2tet Ras

G12V celler

ptet /

KRAS

G12V-IRES-GFP-BSR ekspressionsvektor, som tillader doxycyclin-inducerbar ekspression af K-Ras

G12V, blev genereret ved isolering af K-Ras

G12V åbne læse ramme fra pBABE-K-Ras

G12V (Addgene) af

BamH

jeg fordøjelse, efterfulgt af indsættelse i

Bgl

II-lineariseret pMIG vektor [21]. Den fremkomne K-Ras

G12V-IRES-GFP-kassette blev amplificeret ved PCR under anvendelse af oligonukleotider indeholdende flankerende

Ikke

jeg sites, som blev anvendt til subkloning i pSC-A-amp /kan (Stratagene, La Jolla , CA, USA). Efterfølgende K-Ras

G12V-IRES-GFP-kassette blev klonet via

Ikke

jeg fordøjelse i ptet-BSR vektor [22], hvilket giver ptet /K-Ras

G12V-IRES- GFP-BSR. For at opnå doxycyclin-inducerbar ekspression af onkogen K-Ras, Caco-2tet celler, stabilt udtrykker doxycyclin-inducerbare systemkomponenter rtTA og RTT’er [21], blev transficeret med

Ahd

I-lineariseret ptet /K- Ras

G12V-IRES-GFP-BSR vektor ved elektroporering. Efter selektion med blasticidine S (5 ug /ml) og puromycin (5 ug /ml), blev resistente celle pools screenet for effektiv induktion af K-Ras

G12V ekspression. Transgen ekspression blev induceret ved tilsætning af 2 ug /ml doxycyclin (Merck).

FACS-analyse

Analyse af transgen ekspression af Caco-2tet celler blev udført efter 72 dox behandling. Celler blev vasket, resuspenderet i PBS indeholdende 2% FCS og 0,01% natriumazid, og analyseret ved anvendelse af et EPICS FC500 (Beckman Coulter, Krefeld, Tyskland). Post-datafangst analyse blev udført ved hjælp af FlowJo software (Tree stjerne, Ashland, OR, USA).

Western blotting

Celler blev lyseret i RIPA buffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Triton-X 100, 0,5 natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM natriumorthovanadat, 10 mM natriumfluorid og 20 mM p-glycerophosphatopløsninger plus Complete proteaseinhibitorer (Roche)). Til 3D lysater blev celler dyrket på ren matrigel uden collagen. Sfæroider blev isoleret efter 4 dage under anvendelse af Cell Recovery Solution (BD) og lyseret i RIPA-buffer. Lysater blev klaret ved centrifugering blev lige store mængder protein separeret ved SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris gel; Invitrogen) og overført til nitrocellulosemembran (iBlot Gel Transfer Stacks; Invitrogen). Membraner blev blokeret med 0,5% blokerende reagens (Roche) i PBS indeholdende 0,1% Tween-20 og inkuberet med primære antistoffer, efterfulgt af HRP-konjugerede sekundære antistoffer. Visualisering blev udført med ECL detektionssystem (Pierce, Rockford, IL, USA).

MTT, cytotoksicitet, og caspase 3/7 aktivitetsassays

For 2D kulturer, 2,5 × 10

3 celler /brønd i 100 pi medium blev udpladet i ikke-overtrukne plader med 96 brønde. Til 3D kulturer, 5 × 10

3 celler /brønd blev podet i Matrigel /collagen-coatede 96-brønds plader i 100 pi medium indeholdende 2% matrigel. Levedygtighed blev bestemt ved tilsætning af 10 pi 3- (4,5-dimethylthiazol-2yl-) 2,5-diphenyl tetrazolium (MTT, Roth, Karlsruhe, Tyskland) opløsning (5 mg /ml) efterfulgt af inkubering i 3 timer. Celler blev lyseret ved tilsætning af 100 pi 50% dimethylformamid indeholdende 10% SDS og absorbansen blev målt ved 570 nm ved multimode reader Infinite 200 PRO (Tecan, Männedorf, Schweiz). Cytotoksicitet blev målt ved anvendelse af CytoTox-Glo cytotoksicitetsanalyse fra Promega (Madison, WI, USA). Aktiviteten af ​​dead-celle-protease i kulturen blev bestemt ved tilsætning af 50 pi luminogent substrat. Efter 15 minutters inkubation ved stuetemperatur blev luminescensen målt under anvendelse af multimode-læser Infinite 200 PRO (Tecan), efterfulgt af cellelysis og måling af total luminescens til normalisering.

Caspase 3/7 aktivitet blev bestemt under anvendelse af Caspase- Glo3 /7 Assay fra Promega (Madison, WI, USA) ved tilsætning af 70 pi luminogent substrat indeholdende DEVD-sekvensen. Efter 30 minutters inkubation ved stuetemperatur blev luminescensen målt under anvendelse af multimode-læser Infinite 200 PRO (Tecan).

Tunel-farvning

DNA strengbrud blev analyseret med in situ-påvisning celledød kit (TMR ) fra Roche. Celler blev fikseret med 4% PFA i 1 time ved stuetemperatur og permeabiliseret med 0,1% Triton-X 100 i 0,1% natriumcitrat i 2 minutter ved stuetemperatur. Mærkning blev udført ifølge producentens protokol i 1 time ved 37 ° C. Kerner blev modfarvet med DAPI. Objektglas blev monteret i Fluoromount G (Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA) og analyseret på en konfokal laser scanning mikroskop (LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Billeder blev behandlet med ZEN software (Zeiss). Tunel-positive celler blev talt under anvendelse ImageJ (W. Rasband, National Institute of Health, USA; Version 1.48).

immunfluorescensmikroskopi

Celler dyrkes i 3D på matrigel /collagen coatede 8-godt glas kammerobjektglas (BD) blev fikseret med 4% PFA i 15 minutter, permeabiliseret med PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 i 10 minutter og blokeret med 5% gedeserum (Invitrogen) i PBS indeholdende 0,1% Tween-20. Celler blev derefter inkuberet med primære antistoffer i blokerende buffer (2 timer ved stuetemperatur), vasket med PBS indeholdende 0,1% Tween-20 og inkuberet med sekundært antistof i blokerende buffer (2 timer ved stuetemperatur). F-actin og kerner blev modfarvet med Alexa Fluor 633-mærket phalloidin og DAPI. Slides blev monteret i Fluoromount G og analyseret på en konfokal laser scanning mikroskop (LSM 700, Zeiss, Oberkochen, Tyskland) ved hjælp af 488, 561 og 633 nm excitation med olie objektive linser Plan-Apochromat 63x /1,40 DIC M27. Billeder blev behandlet med ZEN software (Zeiss).

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middelværdi (± S.E.M.), og ‘n’ refererer til antallet af uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev vurderet ved t-test, og envejs ANOVA efterfulgt af Tukey post-test (GraphPad Prism-version 4.03; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). p-værdier under 0,05 blev anset for signifikant (* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001; ns, p 0,05).

Resultater

I 3D-matrigel kulturer, Caco-2-celler differentierer til polariserede cyster består af et enkelt cellelag, der omgiver et centralt lumen [17], [21], hvilket afspejler organotypiske tilrettelæggelse af tyktarmen. Fordi disse celler er EGFR-positive og hurtig vildtype-Ras, de repræsenterer en ideel modelsystem til undersøgelse den kombinerede effekt af EGFR hæmning og en apoptose-inducerende middel, såsom TRAIL. At først teste effektiviteten af ​​Db

αEGFR-scTRAIL, Caco-2 celler blev dyrket i tre dage i 3D i medium indeholdende 10% FCS før tilsætning af Db

αEGFR-scTRAIL efterfulgt af MTT-målinger tre dage senere. I disse kulturer, relativt lave doser af Db

αEGFR-scTRAIL forårsagede en signifikant reduktion af cellelevedygtighed, som blev forbundet med forstyrrelser af cyster og dannelsen af ​​apoptotiske legemer (fig. 1a, b), scTRAIL alene eller i kombination med cetuximab undladt at fremkalde en cytotoksisk reaktion i Caco-2 3D kulturer (fig. S1), støtte vores tidligere data, som diabody-medierede dimer struktur Db

αEGFR-scTRAIL giver overlegen bioaktivitet i scTRAIL [15]. Interessant i konventionelle 2D cellekulturer på plast, Caco-2 celler var meget modstandsdygtige over for Db

αEGFR-scTRAIL behandling (fig. 1a, b), i overensstemmelse med en tidligere rapport ved hjælp af rekombinant human TRAIL [23]. Forbehandling af Caco-2 3D kulturer med Z-VAD, en pan-caspaseinhibitor, reducerede signifikant den cytotoksiske virkning af Db

αEGFR-scTRAIL (fig. 1c), og induktionen af ​​apoptose ved Db

αEGFR- scTRAIL blev bekræftet ved analyse af DNA fragmentering ved Tunel-farvning (fig. 1d, e). Derudover sammenlignet med 2D kulturer, den dosisafhængige aktivering af caspaser 3/7 som reaktion på Db

αEGFR-scTRAIL blev øget betydeligt i 3D-kulturer (fig. 1f). Denne forskel i følsomhed over for Db

αEGFR-scTRAIL i 3D versus 2D kulturer kunne ikke tilskrives ændringer i EGFR eller TRAILR1 /2-ekspression (fig. 1 g, h). Desværre, fordi de lokkefugle receptorerne DcR1, DcR2 kunne ikke påvises ved immunoblotting med antistofferne rådighed, kunne udtryk ændringer i disse receptorer ikke udelukkes. Analyse af de vigtigste signalveje afsløret, at 3D-kulturer blev aktiviteten af ​​PI3K pathway undertrykt sammenlignet med celler dyrket i 2D som målt ved phospho-Akt niveauer hvorimod ERK /MAPK-vejen blev opreguleret som set af øget ERK1 /2 phosphorylering ( fig. 1 g, h). Men hæmning af PI3K af LY294002 i 2D kulturer ikke var tilstrækkelig til at bevidstgøre celler til Db

αEGFR-scTRAIL (data ikke vist), hvilket indikerer en mere kompleks situation i 3D kulturer. Tilsammen understreger disse resultater virkningen af ​​dyrkningsbetingelser på den cellulære reaktion mod apoptose-inducerende midler. Salg

Celler blev dyrket i 3D eller 2D i medium indeholdende 10% FCS. (A) Tre dage efter podning, blev kulturer behandlet med Db

αEGFR-scTRAIL. Levedygtighed blev målt 72 timer senere ved MTT-assay og normaliseret til den ubehandlede kontrol (n = 3). (B) fasekontrast billeder af 3D og 2D kulturer er beskrevet i (a) behandlet med de angivne koncentrationer af Db

αEGFR-scTRAIL i 72 timer (skala bar: 50 pm). (C) Tre dage efter podning blev 3D kulturer forbehandlet med 20 pM Z-VAD som indikeret før tilsætning af 1 nM Db

αEGFR-scTRAIL. Levedygtighed blev målt 72 timer senere ved MTT-assay og normaliseret til den ubehandlede kontrol (UT) (n = 3). (D) 24 timer efter behandling blev cellerne fikseret og farvet for DNA-strengbrud. Tunel-positive celler blev talt (n = 2). (E) Repræsentative billeder af Tunel farvninger beskrevet i (d), Tunel-positive celler (rød), DAPI (cellekerner; blå). Vist er konfokale sektioner (skala bar: 100 um). (F) Tre dage efter podning blev kulturer behandlet med 0,1 nM eller 1 nM Db

αEGFR-scTRAIL i 24 timer. Caspase 3/7 aktivitet blev målt og normaliseret til den respektive ubehandlede kontrol (UT) (n = 3). (G) Fire dage efter podning blev lysater genereret og analyseret ved immunblotting. Vist er en repræsentant blot af tre uafhængige forsøg. Tubulin blev detekteret som en loading kontrol. Specifikke bånd er markeret med pilespidser. (H) Kvantificering af Western blots fra (g). Proteinniveauer blev normaliseret til den tilsvarende tubulin kontrol; niveauer i 2D kulturer blev sat som 1 (n = 3).

Derefter undersøgte vi, hvordan tilstedeværelsen af ​​EGFR-ligander påvirkede vækst og differentiering af Caco-2-celler i 3D kulturer. Celler blev podet i Matrigel kulturer indeholdende lav serum (2%) i nærvær af EGF eller TGF-α, der sikrer, at proliferation blev primært drevet via EGFR-signalering. MTT aktivitetsmålinger Efter seks dages dyrkning viste, at EGF og TGF-α forøgede proliferation af Caco-2-celler sammenlignet med kontrolceller dyrket i lavt serum (Fig. 2a). Mikroskopisk analyse afslørede, at i nærvær af EGF og TGF-a Caco-2 cyster var større og indeholdt flere celler (fig. 2b). Især har tilsætning af EGFR-ligander ikke interfererer med differentiering, som bedømt ved den typiske apikale fordeling af F-actin og dannelsen af ​​et cellefrit lumen (Fig. 2b). For at løse hvordan EGFR blokade påvirkede basale og EGFR-ligand-induceret proliferation af etablerede Caco-2 cyster, behandlede vi cellerne tre dage efter podning med Cetuximab (0,5 uM) og analyseret kulturerne tre dage senere. Sammenlignet med den kontrol, i disse kulturer MTT aktiviteten var signifikant reduceret med 35-50%, men cellerne var stadig levedygtige, viste ingen tegn på apoptose, og kun ubetydeligt øget cytotoksicitet (fig 2c-e,. S1d). Dette indikerer, at EGFR-aktivering bidrager til basal proliferation, men er ikke påkrævet for overlevelse. Cetuximab også potent inhiberede proliferation i nærvær af EGF og TGF-α som set ved reduktionen af ​​MTT-aktivitet og den reducerede størrelse af cysterne (fig. 2c, d). Sammen disse eksperimenter viser, at spredning af Caco-2 celler i 3D-kulturer kan drives af EGFR-signalering og er følsom over for farmakologisk EGFR hæmning, og kan således potentielt blive undertrykt af Db

αEGFR-scTRAIL.

Caco -2 celler blev dyrket i 3D kulturer indeholdende 2% FCS i nærvær af vækstfaktorer (10 ng /ml) eller i 2% kun FCS (con). (A) Kulturer blev analyseret ved MTT-assay på dag 6 og normaliseret til kontrol (n = 5). (B) Tre dage efter podning 100 ng /ml CTX blev tilsat for at inducere lumen ekspansion. Sfæroider blev fikseret på dag 6 og farvet med phalloidin (F-actin) og DAPI (kerner). Vist er konfokale sektioner af et repræsentativt cyste (skala bar: 10 pm). (C) Tre dage efter podning blev 3D kulturer efterladt ubehandlet eller behandlet med 0,5 pM Cetuximab (CET) i 72 timer. Levedygtighed blev bestemt ved MTT-assay og normaliseret til den ubehandlede kontrol (UT). (N = 4) (d) Caco-2 3D kulturer blev efterladt ubehandlet eller behandlet med 0,5 pM Cetuximab i 72 timer og analyseret ved fasemikroskopi (skala bar: 50 pm). (E) Tre dage efter podning, 3D-kulturer forblev ubehandlede (UT) eller behandlet med 0,5 pM Cetuximab (CET) i 72 timer. Cytotoksicitet blev bestemt ved anvendelse af CytoTox-Glo cytotoksicitetsanalyse (n = 3).

EGFR aktivering ikke blot stimulerer celleproliferation, men kan også beskytte mod TRAIL-induceret apoptose [24]. Derfor vi næste udforsket effekten af ​​Db

αEGFR-scTRAIL i tilstedeværelse af EGFR-ligander. Immunoblotting af lysater af EGF- og TGF-α-stimulerede celler viste en lignende grad af undertrykkelse af ligand-induceret EGFR phosphorylering af enten Cetuximab eller Db

αEGFR-scTRAIL forbehandling (fig. 3a, b), der angiver den effektive konkurrence af diabody delen med EGFR-ligander. Dette kunne også bekræftes i 3D dyrkede Caco-2-celler stimuleret med EGF (fig. S2). Følgelig EGF og TGF-α havde nogen beskyttende virkning på levedygtigheden i 3D (fig. 3c) blev heller disse ligander i stand til at interferere med caspaseaktivering (fig. 3d), hvilket viser, at Db

αEGFR-scTRAIL aktivitet er ikke begrænset af tilstedeværelsen af ​​EGFR-ligander. For at forstå mere detaljeret resistensmekanismer mod Db

αEGFR-scTRAIL, vi re-isolerede cyster fra ubehandlet og Db

αEGFR-scTRAIL-behandlede 3D Matrigel kulturer efterfulgt af immunoblotting af cellelysater (Fig. 3f, g). Interessant, lysater afledt af overlevende cyster (fig. 3e, pile) afslørede, at disse Db

αEGFR-scTRAIL-ufølsomme celler indeholdt særligt lavt EGFR niveauer. Af note, TRAIL receptor-niveauer i disse celler var de samme som i ubehandlede celler, hvilket antyder, at fordelingen af ​​EGFR i cellepopulationen kraftigt påvirkninger Db

αEGFR-scTRAIL følsomhed (fig. 3f, g). Selv om den diabody delen ikke aktivt bidrager til apoptose og hovedsagelig har en vækstinhiberende funktion i Caco-2 3D kulturer, EGFR-rettet målretning er vigtigt at øge den lokale TRAIL koncentration og udløse en effektiv apoptotisk respons.

(a) Caco-2 celler dyrket i 2D blev efterladt ubehandlet eller behandlet med 4 nM Db

αEGFR-scTRAIL eller 4 nM Cetuximab i 15 minutter før stimulering med EGF eller TGF-α (10 ng /ml) i 10 min. Phosphorylerede og totale proteiner blev detekteret ved immunoblotting. Vist er en repræsentant blot af tre uafhængige forsøg. Tubulin blev detekteret som en loading kontrol. (B) Kvantificering af Western blots fra (a). Phospho-EGFR niveauer var normaliseret til de tilsvarende samlede protein niveauer; niveauer i den ubehandlede kontrol blev sat til 1 (n = 3). (C, d). Tre dage efter podning, Caco-2 3D kulturer dyrket i fravær eller nærvær af vækstfaktorer blev behandlet med 1 nM Db

αEGFR-scTRAIL. (C) Levedygtighed blev bestemt ved MTT-assay efter 72 timer og normaliseret til den respektive ubehandlede kontrol (UT). (N = 3) (d) Caspase 3/7 aktivitet blev målt efter 24 timer. Værdier blev normaliseret til den tilsvarende ubehandlede kontrol (n = 3). (E) Tre dage efter podning, Caco-2 3D kulturer var enten ubehandlede eller behandlet med 5 nM Db

αEGFR-scTRAIL i 72 timer. Overlevende cyster i fasekontrast billeder er angivet ved pile (skala bar: 50 pm). (F) Lysater afledt fra 3D kulturer vist i (e) blev analyseret ved immunblotting. Vist er en repræsentant blot af tre uafhængige forsøg. Tubulin blev detekteret som en loading kontrol. Specifikke bånd er markeret med pilespidser. (G) Kvantificering af Western blots fra (f). Proteinniveauer blev normaliseret til den tilsvarende tubulin kontrol; niveauer i de ubehandlede kulturer blev sat som en (n = 3).

Ca. 40% af alle CRC tumorer havnen en aktiv mutation i

KRAS

gen, hvilket fører til konstitutiv ERK /MAPK aktivering og tab af lydhørhed over for Cetuximab [7], mens TRAIL følsomheden kan øges [25]. For at undersøge indflydelsen af ​​onkogene Ras på Db

αEGFR-scTRAIL-induceret cytotoksicitet, genereret vi stabile Caco-2 celler inducerbart udtrykker K-Ras

G12V. I disse celler, doxycyclin inducerer bi-cistronisk ekspression af onkogenet og GFP, hvorimod vektor kontrolceller kun udtrykker GFP. Tre dage efter doxycyclin Desuden mere end 85% af Caco-2tet celler blev GFP positive ved FACS-analyse (fig. 4a). Immunoblotting af Caco-2tet K-Ras

G12V cellelysater bekræftede Ras overekspression sammen med, at GFP, samtidig med stærke ERK fosforylering, mens vektor kontrol celler kun udtrykkes GFP (fig. 4b). Når disse celler blev podet i 3D-kulturer i fravær af doxycyclin, både Caco-2tet vektor og K-Ras

G12V celler dannet veldifferentieret og polariserede sfæroider med basolaterale adherensovergange (E-cadherin farvning) og apikale F-actin akkumulering omkring en cellefri lumen. Tilsætning af doxycyclin havde ingen effekt på morfologi af kontrol celler, mens K-Ras

G12V udtrykkende celler dannede multi-luminale spheroids der manglede tydelig polarisering (fig. 4c). Disse differentiering defekter forårsaget af K-Ras

G12V er i overensstemmelse med en nylig rapport fra Magudia et al. (2012) [16].

(a) Caco-2tet vektor kontrol og K-Ras

G12V celler blev behandlet med 2 ug /ml doxycyclin i 72 timer (+ dox). Celler blev høstet og GFP-fluorescens blev analyseret ved flowcytometri. Ikke-inducerede celler blev anvendt som en kontrol (-dox). (B) Caco-2tet vektor kontrol og K-Ras

G12V celler blev dyrket i 2D og behandlet med doxycyclin i de angivne tidsrum inden lyse. GFP, Ras, pERK (T202 /Y204) og ERK-niveauer blev bestemt ved Western blotting. Tubulin blev detekteret som en loading kontrol. Alle viste paneler er fra samme blot. (C) Caco-2tet vektor kontrol og K-Ras

G12V celler blev podet i 3D kulturer i fravær eller nærvær af doxycyclin. Tre dage efter podning lumen ekspansion blev induceret ved tilsætning af 100 ng /ml CTX. Kulturer blev fikseret tre dage senere og farvet med E-cadherin-specifikt antistof (grøn), phalloidin (rød) og DAPI (cellekerner; blå). Vist er konfokale sektioner af repræsentative cyster (skala bar: 10 pm)

For at bestemme virkningerne af K-Ras

G12V udtryk på Db

αEGFR-scTRAIL induceret cytotoksicitet, 3D kulturer. blev behandlet med doxycyclin i tre dage. Sammenlignet med kontrolcellerne, levedygtighed målinger afslørede nedsat følsomhed af onkogene Ras udtrykkende celler til Db

αEGFR-scTRAIL (fig. 5a).