PLoS ONE: Effektiv Genotypebestemmelse af KRAS Mutant Ikke-småcellet lungekræft Ved hjælp af en Multiplexed Droplet Digital PCR Approach

Abstrakt

Droplet digital PCR (ddPCR) kan anvendes til at detektere lavfrekvente mutationer i onkogen-drevet lunge kræft. Rækken af ​​

KRAS

punktmutationer observeret i NSCLC nødvendiggør en multiplex tilgang til effektiv mutation detektion i cirkulerende DNA. Her rapporterer vi design og optimering af tre diskriminerende ddPCR multiplex analyser undersøger ni forskellige

KRAS

mutationer ved hjælp PrimePCR ™ ddPCR ™ Mutation Analyser og Bio-Rad mX100 system. Tilsammen disse mutationer udgør 95% af de nukleotidændringer findes i

KRAS

i human cancer. Multiplex reaktioner blev optimeret på genomisk DNA ekstraheret fra

KRAS

mutant cellelinjer og testet på DNA ekstraheret fra faste tumorvæv fra en kohorte af patienter med lungecancer uden forudgående kendskab til det specifikke

KRAS

genotype. De multiplex ddPCR analyser havde en detektionsgrænse på bedre end en mutant

KRAS

molekyle i 2000 vildtype

KRAS

molekyler, der sammenlignes positivt med en detektionsgrænse på 1 i 50 for næste generation sequencing og 1 i 10 for Sanger sekventering. Multiplex ddPCR assays således give en meget effektiv metode til at identificere

KRAS

mutationer i lungeadenokarcinom

Henvisning:. Pender A, Garcia-Murillas I, Rana S, Cutts RJ, Kelly G, Fenwick K et al. (2015) Effektiv Genotypning af

KRAS

Mutant Ikke-småcellet lungekræft Ved hjælp af en Multiplexed Droplet Digital PCR Approach. PLoS ONE 10 (9): e0139074. doi: 10,1371 /journal.pone.0139074

Redaktør: Giuseppe Viglietto, UNIVERSITY Magna Graecia, ITALIEN

Modtaget: 12. februar 2015; Accepteret: 9. september 2015; Udgivet: 28 September, 2015

Copyright: © 2015 Pender et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. forfatterne takker støtte dette arbejde af National Health service (England), gennem finansiering til det nationale institut for Health Research Biomedical Research Centre på The Royal Marsden Hospital. De har også takker støtte fra Institut for Cancer Research og Cancer Research UK, Stratificeret Medicine programmet. Denne forskning blev også støttet delvist af Revere Charitable Trust, en ubegrænset pædagogisk bevilling fra Pierre-Fabre Ltd., Det Europæiske Forskningsråd Advanced Grant RASTARGET og Wellcome Trust Senior Investigator Award, 103.799 /Z /14 /Z. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Finansieringen fra Pierre-Fabre Ltd. repræsenterer ikke en konkurrerende interesse for enhver af forfatterne, og ingen anden relevant erklæring vedrørende beskæftigelse, rådgivning, patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter er påkrævet. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1], og over 20 000 tilfælde af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) blev diagnosticeret i Storbritannien i 2012 [2]. De hyppigst muterede onkogener i lunge adenocarcinom er

RAS

familie GTPaser og

EGFR Hotel (25% og 15% [3]). Kendskab til den molekylære profil af avancerede lungeadenocarcinom er kritisk for terapeutisk beslutningstagning [4], navnlig hvad angår brug af EGFR og ALK tyrosinkinaseinhibitorer [5,6]. Tilstedeværelsen af ​​en

KRAS

mutation kan også være af terapeutisk relevans, hvis MEK-inhibitor og taxan kombinationer viser sig effektiv hos denne patient kohorte [7]. Opnå tilstrækkelige tumorvæv for afgørende genotypebestemmelse i lungekræft kan være problematisk, men [8]. Droplet digital PCR (ddPCR) er en følsom metode til kvantitativ mutationsdetektion [9,10], der har potentiale til præcist genotype patient-afledt materiale fra en lille mængde udgangsmateriale.

Påvisning af

KRAS Salg hotspot mutationer ved ddPCR har været begrænset af de mange forskellige potentielle alleler indenfor tilstødende loci, selv om nogle

KRAS

mutationer forekommer mere almindeligt i kræft end andre (tabel 1 og 2). De fire mest almindelige mutationer udgør 80% af alle KRAS nukleotidændringer fundet i humane kræftformer (85% af alle ændringer i NSCLC), mens de ni mest almindelige mutationer udgør 95% af alle ændringer og 97,5% af ændringer i NSCLC. Fluorofor-mærkede digital PCR-prober supplerer en bestemt mutant DNA-sekvens og så kun registrere en specifik

KRAS

mutation. Under anvendelse af disse assays i duplex med en probe til påvisning af mutant allel og en probe til påvisning af vildtype allelen tillader mutant beregning allel fraktion for en given mutation, men denne fremgangsmåde kræver potentielt flere assays og anvendelse af mere materiale, før korrekte identifikation af genotypen. Udvikling af et multipleks assay kombinerer flere forskellige mutante prober i den samme reaktion er derfor et attraktivt alternativ. Multiplex

KRAS

digitale PCR assays er blevet beskrevet ved hjælp af Raindrop ™ Digital PCR-system (Raindance Technologies, Billerica, Massachusetts, USA) i fremskreden kolorektal cancer [11], men endnu ikke med Bio-Rad mX100 systemet, en overkommelig digitalt PCR-system med kommercielt tilgængelige prober til flere

KRAS

mutationer, heller ikke har en multiplex værktøj blevet brugt i lungekræft.

Vi satte os for at designe multiplex digital PCR-analyser, der præcist ville identificere ni forskellige

KRAS

mutationer og at demonstrere anvendelsen af ​​disse analyser til patient-afledt materiale ved hjælp af Bio-Rad mX100 systemet.

materialer og Metoder

digital PCR probeassays

Hver digital PCR-probe er et oligonukleotid specifikt til regionen af ​​interesse med en 5 ‘fluorophor og en 3’ quencher. Fluoroforen er enten HEX for sonder specifikke for vildtype-sekvenser eller FAM for mutante prober.

KRAS

c.35G T (G12V;. Kat nr dHsaCP2500592), c.35G A (G12D;. Kat nr dHsaCP2500596), c.35G C (G12A;. Kat nr dHsaCP2500586), c .34G A (G12S;. kat nr dHsaCP2500588), c.34G C (G12R;. kat nr dHsaCP2500590), c.34G T (G12C, dHsaCP2500584), c.37G T (G13C;. kat nr dHsaCP2500595 ), c.38G A (G13D;. kat nr dHsaCP2500598), c.183A C (Q61H;. kat nr dHsaCP2000133), WT for c.35G T (WT for G12V;. kat nr dHsaCP2500593), WT for c.35G A (WT for G12D;. kat nr dHsaCP2000002), WT for c.35G C (WT for G12A,. kat nr dHsaCP2000004), WT for c.34G A (WT for G12S;. kat nr dHsaCP2000012 ), WT for c.34G C (WT for G12R;. kat nr dHsaCP2000010), WT for c.34G T (WT for G12C,. kat nr dHsaCP2000008), WT for c.37G T (WT for G13C; kat nr dHsaCP2500595), WT for c.38G . A (WT for G13D;. kat nr dHsaCP2000014) og WT for c.183A C (WT for Q61H;. kat nr dHsaCP2000132) 20x PrimePCR ™ ddPCR ™ Mutation Analyser (indeholdende begge primere og ddPCR sonder) blev indkøbt fra Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Californien, USA) og anvendt i denne undersøgelse.

Assay optimering og DNA kvantificering

Digital PCR assays blev optimeret under anvendelse af cellelinje genomisk DNA (gDNA) eller syntetiske oligonucleotider som passende. Cellelinier anvendt til denne undersøgelse blev autentificeret ved hjælp STR profilering af cellen Services facilitet på Cancer Research UK London Research Institute og Institut for Cancer Research. Disse omfattede NCI-H727 (

KRAS

G12V, lunge), NCI-H358 (

KRAS

G12C, lunge), A549 (

KRAS

G12S, lunge), SK- LU-1 (

KRAS

G12D, lunge), A427 (

KRAS

G12D, lunge), HCT-116 (

KRAS

G13D, kolon) og NCI-H1975 (

KRAS

WT, lunge). Alle cellelinier blev leveret direkte af Cancer Research UK Cell Services med undtagelse af HCT-116 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA; kat ingen ATCC

®CCL-247

TM.). Celle gDNA blev ekstraheret under anvendelse af DNeasy ™ blod og væv Kit (Qiagen, Venlo, Limburg, Holland) ifølge producentens instruktioner. Alle DNA anvendt i efterfølgende digitale PCR-reaktioner, undtagen syntetiske oligonukleotider, blev kvantificeret på en mX100 ddPCR-system under anvendelse af human RNase P TaqMan® Copy Number referencenummer Assay (Life Technologies Corporation, Carlsbad, Californien, USA). 1 pi eluat blev sat til en digital PCR reaktion indeholdende 10 pi ddPCR Supermix for sonder (Bio-Rad) og 1 pi TaqMan Copy Number referencenummer Assay, menneske, RNase P (Life Technologies) på et samlet volumen på 20 pi. Reaktionen blev delt i ~ 14.000 dråber per prøve i en QX-100 droplet generator ifølge producentens anvisninger. Emulgerede PCR-reaktioner blev kørt på en plade (Eppendorf, Stevenage, UK) på en G-Storm GS4 termiske cykler 96 (G-Storm, Somerton, Somerset, UK) inkubering af pladerne ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cyklusser på 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 60 sek, efterfulgt af 10 minutters inkubering ved 98 ° C. Temperaturen rampe trin var 2,5 ° C /sekund for alle trin. Plader blev aflæst på en Bio-Rad QX-100 droplet reader under anvendelse QuantaSoft v1.4.0.99 software (Bio-Rad). Mindst en negativ kontrolbrønde uden DNA blev inkluderet i hver kørsel. Mængden af ​​amplificerbart RNase P DNA blev kvantificeret fra fusionen tilvejebragt af softwaren. Efter kvantificering, blev cellelinje-DNA fordøjet ved anvendelse Hind 3-HF ™ restriktionsenzym (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA) ved 37 ° C i 1 time.

Droplet digital PCR for KRAS mutationsdetektion

PCR reaktionsblandinger blev fremstillet i et samlet volumen på 20 pi indeholdende: 10 pi 2x Supermix for Prober uden dUTP (Bio-Rad), relevante primer probeassays DNA (variabelt volumen) og nuklease-frit vand (Life Technologies Corporation, Carlsbad, Californien, USA). Multiple brønde blev anvendt, hvis det kræves for at analysere den nødvendige DNA-eluatet. Mindst 500 pg ækvivalent DNA eluatet blev analyseret i hver multiplex assay for hver patient. 20 pi af PCR-reaktionsblandingen blev overført til en prøvebrønd i en engangs dråbe generator kassette (Bio-Rad). 70 pi dråbe generation olie (Bio-Rad) blev derefter fyldt i oliebrønden for hver kanal og kassetten fyldt i en mX100 Droplet Generator (Bio-Rad). Dråberne blev derefter overført til en 96-brønds PCR-plade. Emulgerede PCR-reaktioner blev kørt på en G-Storm GS4 thermal cycler inkubering af pladerne ved 95 ° C i 10 min efterfulgt af 40 cyklusser af 94 ° C i 30 sek og 54 ° C i 60 sek, efterfulgt af 10 minutters inkubation ved 98 ° C. Temperaturen rampe trin var 2,5 ° C /sekund for alle trin. Pladerne blev læst på en Bio-Rad QX-100 dråbe læser ved hjælp QuantaSoft v1.4.0.99 software fra Bio-Rad. Mindst én negativ kontrol godt med intet DNA blev inkluderet i hver kørsel. Hver brønd blev derefter læst ved hjælp af mX100 Droplet Reader (Bio-Rad) og dråber analyseret for emission i HEX eller FAM bølgelængder. To-dimensionelle amplitude plots viser målte HEX og FAM amplitude for hver dråbe viser fire vigtigste dråber befolkninger; dråber, der ikke indeholder amplificeret DNA, dråber med kun mutant DNA og høj FAM amplitude, dråber med kun vildtype-DNA og høj HEX amplitude og dråber med både vildtype og mutant amplificeret DNA og høj FAM og HEX amplitude. Hvis flere kopier af vild-type og mutante DNA er indeholdt i den samme dråbe, dråber med højere FAM og HEX amplitude vil blive læst. Disse dråber er blevet udelukket fra nogen analyser i hele denne undersøgelse.

Digital PCR-analyse

For at vurdere mutant allel fraktionen, koncentrationen af ​​mutant-DNA (kopier af mutant DNA pr dråbe) blev estimeret ud fra Poisson-fordelingen. Antal mutant kopier pr dråbe MMU = -ln (1- (NMU /n)), hvor NMU = antal dråber positive for mutant FAM sonde og n = det samlede antal dråber. Koncentrationen af ​​DNA i reaktionen blev estimeret som følger: MDNAconc = -ln (1- (nDNAcon /n)), hvor nDNAconc = antal dråber positive for mutant FAM-proben og /eller vildtype HEX sonde og n = det samlede antal dråber. Mutantallelen fraktion = MMU /MDNAconc. Den målte mutant allel frekvens beskriver den mutante allel fraktionen udtrykt som en procentdel.

FFPE væv DNA adgang og udvinding

formalinfikseret paraffin indstøbt (FFPE) tumorprøver fra NSCLC patienter overskud til klinisk pleje var indsamlet med skriftlig patient samtykke på Det Kongelige Marsden NHS Foundation Trust. FFPE væv DNA blev ekstraheret (efter macrodissection om nødvendigt for at sikre 10% tumor indhold) under anvendelse af Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Det eluerede DNA blev opbevaret ved -20 ° C.

Etik erklæring

Alle patienter forudsat skriftligt samtykke til denne undersøgelse (etik godkendelse 13 /LO /1389, NRES Udvalg London-Central), der indarbejdet overskud somatisk DNA fra Cancer Research UK Stratificeret Medicine Programme (etik godkendelse 11 /EE /0202, NRES Udvalg East of England).

Sanger sekventering

region af interesse blev forstærket ved hjælp af 10 uM fremad (5′-TATTATAAGGCCTGCTGAAAATG-3 ‘) og reverse (5′-TTGGATCATATTCGTCCACAA-3’) primere, 10 pi Amplitaq Gold® PCR Master Mix (Life Technologies) og 3 ng template FFPE-afledt DNA eller 5 ng gDNA. PCR-betingelserne var i henhold til producentens anbefalinger. Renset PCR-produkt derefter undergik en yderligere PCR trin ved hjælp kæde-afslutning dideoxynucleotider (BigDye® 1.0, Life Technologies) og efterfølgende DNA-sekvens blev læst på en automatiseret sequencer.

Ion torrent proton sekventering

Sekventering biblioteker blev fremstillet med Ion AmpliSeq ™ Cancer Hotspot Panel v2 (Life Technologies) under anvendelse af Ion AmpliSeq Library Preparation protokol med 3-5ng af DNA ifølge producentens instruktioner. Efter stregkoder, blev biblioteker kvantificeret ved hjælp af qPCR og fortyndet til 100 pM. Biblioteker blev template med Ion OneTouch2 systemet (Life Technologies) og sekventeret på et PI chip bruger Ion PI OT2 200 Kit (Life Technologies), 520 strømme og en gennemsnitlig amplikon længde på 112 baser til en gennemsnitlig dybde på x2721307. Den sekventering resulterede i 45272-11767856 læser per prøve.

Ion torrent Variant opkalds v4.0-r73742 uden Hotspot regionen og konfiguration “kønsceller Low Stringens” blev brugt til at kalde varianter. Læs tæller for alle positioner blev beregnet ved hjælp af pileup (SAMtools v1.1 [12]) og disse data blev analyseret for mulige varianter ved hjælp af brugerdefinerede Perl og R scripts. Varianter på 3% rapporteret af både analysemetoder og ikke rapporteret i 1000 genomer Project database (www.1000genomes.org) blev identificeret som mulige somatiske mutationer. Dataene blev krydsrefereret mod Cosmic database V70 (cancer.sanger.ac.uk) at identificere mulige hotspot mutationer.

Statistisk analyse

Lineær regression blev udført ved hjælp af formlen r

2 = 1- (SS

reg /SS

tot) hvor SS

reg refererer til summen af ​​kvadraterne af afstande til best-fit lineær regressionslinje og SS

tot refererer til summen af kvadrater af lodrette afstande fra nulhypotesen (y = gennemsnit af alle y-værdier) ved hjælp af GraphPad Prism-version 6.0a (GraphPad Software, La Jolla, Californien, USA).

KRAS multiplex assay specificitet

92 brønde af

KRAS

vildtype gDNA blev analyseret med hver multiplex. Detektionsgrænsen blev fastsat til 0,05% for at afspejle vores målte resultater med spidse

KRAS

mutant gDNA arter (S8 Fig). Individuelle dråber blev grupperet efter deres HEX amplitude i to grupper ved hjælp af kMeans algoritmen. En tærskelværdi for mutanter blev estimeret baseret på 1,5 gange Medianen af ​​FAM værdierne af disse dråber, der hører til klyngen med højere HEX kategorier. Falske positive “mutant” dråber blev klassificeret som dråber, der var i den nederste HEX klynge, men hvis FAM værdi overstiger den tærskel for at afspejle de FAM og HEX amplituder målt for nogen af ​​de testede i denne multiplex assay KRAS muterede arter. Et falsk positivt resultat blev defineret som tre falske positive “mutant” dråber som pr Rare mutationspåvisning Retningslinjer Best Practices [13]. For at vurdere specificitet, vi beregnet binomialsandsynligheden opnå færre end tre “mutant” dråber pr 6000 vildtype dråber for hver multiplex assay.

Resultater

KRAS

mutation duplex ddPCR

Vi testede alle

KRAS

ddPCR analyser separat tværs en udglødning temperaturgradient at optimere termocykliseringsbetingelser. Hvert assay blev testet med den passende gDNA eller oligonukleotid alene og derefter i duplex med vildtype og

KRAS

mutante DNA og begge relevante FAM og HEX prober stede. Faldende annealingstemperatur øget FAM amplitude af den mutante probe til et plateau ved 54 ° C i

KRAS

G12V, D, A, S, R og C og G13C og 13D prober (Fig 1).

KRAS

Q61H sonde havde en yderligere minimal stigning i FAM amplitude ved 53,4 ° C i forhold til 54 ° C. Alle testede prober viste god adskillelse af de fire forskellige dråben grupper ved 54 ° C, hvilket giver en klar identifikation og kvantificering af forskellige DNA befolkninger.

dråbedistribution befolkninger observeret for hver testet med vildtype og relevant mutant cellelinje duplex assay gDNA eller oligonukleotid ved den optimale annealingstemperatur f.eks G12V panel øverst til venstre viser dråbe befolkninger set med WT for G12V assay, G12V assay, NCI-H727 gDNA og NCI-H1975 gDNA stede. HEX amplitude er op til 6000 på x-aksen og FAM amplitude op til 11000 på y-aksen af ​​hvert panel. Nøgle:. Black drops- tomme dråber, blå-mutant DNA FAM positive dråber, drivhuse vildtype DNA HEX positive dråber, brun-vildtype og mutant DNA dobbelt positive dråber

KRAS

multiplex ddPCR assay design

Vi har designet en digital PCR-baserede multiplex værktøj til at screene for de mest almindelige

KRAS

mutationer i lunge adenocarcinom; G12C, G12D og G12V (https://www.sanger.co.uk/cosmic). Vildtypeprobe assays for hver mutation blev testet i kombination med forskellige koncentrationer af mutante probeassays, der giver anledning til mutante droplet populationer af varierende FAM amplitude (fig 2). Den HEX amplitude alle vildtype probe assays viste sig at være meget ens, og så WT for G12C, WT for G12V og WT for G12D analyser blev udvalgt som henvisninger til alle efterfølgende

KRAS

G12 og G13 mutant analyser . De forskellige kombinationer af mutante assays består deres prøve, multiplex assay, der gav bedst adskillelse af dråben populationer anvendt 900 nm primere og 500nM G12C probe, 562,5 nM primere og 312,5 nM G12D probe og 225 nM primere og 125 nM G12V probe (fig 2 , øverste venstre panel).

KRAS

G12C mutant dråbe befolkninger er angivet med en rød stiplet firkant,

KRAS

G12D mutant befolkninger med en blå stiplet firkant og

KRAS

G12V mutant populationer af en gul stiplet firkant. Hver multiplex assay, der kombinerer alle relevante FAM og HEX-analyser,

KRAS

WT gDNA og G12V, D og C mutant gDNA, vises i det øverste panel. Den tilsvarende duplex assay for hver mutation under anvendelse af samme FAM og HEX assaykoncentration med

KRAS

WT DNA og den passende

KRAS

mutant DNA til stede, er vist i panelerne under hvert multiplex assay. Multiplex 1 (øverst til venstre panel) er en assay kombination af 900 nm primere og 500 nM G12C sonde, 562.5 nM primere og 312,5 nM G12D sonde og 225 nM primere og 125 nM G12V probe med 450 nm primere og 250 nM WT for G12C sonde. Multiplex 2 bruger den samme koncentration af G12V og WT for G12C assay som Multiplex 1, men også indeholder 450 nm primere og 250 nM G12C sonde og 675 nM primere og 375 nM G12D sonde. Multiplex 3 bruger den samme koncentration af

KRAS

mutant analyser som i Multiplex 2, men med den WT for G12V sonde assay til stede, anvendes i samme koncentration som WT for G12C assay i Multiplex 1. Multiplex 4 er en analyse kombinationen af ​​G12C analysen som i Multiplex 2 med 225 nM primere og 125 nM G12D sonde og 675 nM primere og 375 nM G12V sonde med WT for G12D assay i samme koncentration som WT for G12C assay i Multiplex 1. nøgle: sort – tomme dråber, blue- mutante DNA-FAM positive dråber, drivhuse vildtype-DNA HEX positive dråber, brun-vildtype og mutant DNA dobbelt positive dråber. Den samme skala bruges til alle paneler (HEX amplitude op til 7000 og FAM amplitude op til 22000).

Evnen til at teste for flere

KRAS

mutationer ville hjælpe til at opdage sub -clonal populationer ved anvendelse af multiplex tilgang til kliniske prøver, som udgangsmateriale er knap. For at modellere dette, vi ansat celle-line afledt gDNA for de tre mutationer og testet den med hver probe i duplex for at sikre specificitet (S1 Fig). I nærvær af G12D-mutanten probe og

KRAS

G12D, V og C mutant DNA, en anden mutant population af smådråber blev identificeret ved lavere FAM amplitude til G12D mutant DNA-population (rød udklækket kasse, venstre øverste panel ). Denne population blev ikke observeret, når hver mutant DNA arter blev testet i duplex med G12D probe (venstre andet panel). En lignende anden mutant population blev observeret med G12V mutant probe og alle tre mutante DNA-species sammenlignet med hver mutant DNA i duplex (venstre nedre paneler). Denne anden befolkning, især set med G12D mutant sonde, kan falde på det forventede FAM amplituden af ​​en anden

KRAS

mutation i multiplex assay og føre til falsk positive mutation afsløring. For yderligere at udforske dette, FFPE væv DNA fra et individ kendt for at have en

KRAS

12/13 mutation (F124), som kontrolleres af COBAS® test (COBAS®

KRAS

Mutation Test, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) blev analyseret (S1 fig, højre paneler). Den multiplex assay identificerede en mutant dråbe befolkning med FAM amplitude, der blev fortolket som en G12D eller G12V mutation. Når prøven blev testet med hver duplex assay individuelt, blev der ikke mutant befolkning enten G12V eller G12C observeret, mens en befolkning med en lavere FAM amplitude end forventet med G12D mutant assay blev observeret. Ved efterfølgende sekventering og videreudvikling af den digitale PCR-analyse af vævet DNA, blev denne prøve senere identificeret som

KRAS

G12A mutant (tabel 3).

Krydsreaktivitet af

KRAS

probe assays på kombination

på grund af de store ligheder mellem DNA-sekvenser i de forskellige

KRAS

mutationer, signifikant krydsreaktivitet blev noteret mellem sonder designet til mutationer i samme region. Dette var især tydeligt med sonder designet til udskiftninger på samme nukleotid dvs.

KRAS

G12V, D og A og

KRAS

G12S, R og C. krydsreaktiviteten af ​​sonden analysen med ‘ fejlparret ‘DNA der bærer en anden

KRAS

mutation (S2 og S3 fig) resulterer i en dråbe population af varierende FAM og VIC amplituder relativt tæt på det tomme dråbe befolkning og en anden population tæt på den sande population vildtype droplet . Positionen af ​​disse yderligere dråber befolkninger dikterer udformningen af ​​multiplex analyser til at reducere potentiel fejlfortolkning af

KRAS

genotyper. Derfor blev tre multiplex assays udformet for at hver kombinere en probe for en mutation i nukleotidposition 35, en probe til en mutation i stilling 34 og en probe til en mutation ved enten position 37, 38 eller 183.

KRAS

multiplex ddPCR assay optimering

multiplex a er en kombination af FAM analyser for

KRAS

G13C, G12C og G12V. Flere forskellige kombinationer af mutante probekoncentrationer blev testet, og anvendelsen af ​​en vildtype probe til G12C og G13C ved varierende koncentrationer (S4 Fig). Der var betydelig overlapning mellem HEX amplituden af ​​vildtype dråbe befolkninger og på grund af nærheden af ​​de relevante nukleotid baser og den anslåede længde af sonden, var det opfattelsen, at 450 nm primere og 250 nM G12C, V eller D Wild- typen sonde var passende for kvantificering af både G12 og G13 vildtype befolkninger. Den optimale multiplex assay (S4 Fig, øverste venstre panel) omfattede 900 nm primere og 500nM G13C mutant probe, 450 nm primere og 250nM G12C probe og 225 nM primere og 125 nM G12V probe. Multiplex B er en kombination af FAM analyser for

KRAS

G12S, G12D og G13D. Af alle de testede koncentrationer, den optimale kombination af mutant probeassays var 675 nM primere og 375 nM G12S probe, 450 nm primere og 250nM G12D probe og 225 nM primere og 125 nM G13D probe (S5 Fig, øverste venstre panel). Multiplex C analyser

KRAS

mutationer ved G12R, G12A og Q61H. Det kræver en vildtypeprobe for både G12 /13 stilling og Q61 position til nøjagtig kvantificering af mutant allel frekvens. Assayet blev optimeret med 450 nm primere og 250nM G12C probe og 900 nm primere og 500nM Q61H probe som vildtype assays. Den bedste separation af de mutante dråben populationer blev opnået under anvendelse 675 nM primere og 375 nM G12R probe, 450 nm primere og 250nM G12A probe og 900 nm primere og 500nM Q61H mutant-probe (S6 Fig, øverste venstre panel).

Alle optimerede multiplex analyser (fig 3) blev testet for krydsreaktivitet med forskellige arter af

KRAS

mutant DNA (S7 fig). Der er ingen overlapning mellem de ønskede dråbe populationer og befolkningerne til den anden

KRAS

muterede DNA arter i alle tre multiplex. Desuden er positionen af ​​dråber populationer følge krydsreaktivitet er meget reproducerbar og kan bruges til at begynde at identificere hvilken

KRAS

genotype er til stede i en multiplex assay indeholder andre mutante prober.

multiplex A (øverst til venstre panel) er en assay kombination af 900 nm primere og 500 nM G13C sonde (rød stiplet firkant), 450 nm primere og 250 nM G12C sonde (blå stiplet firkant) og 225 nM primere og 125 nM G12V sonde (gul stiplet firkant). Multiplex B (øverste midterste panel) er en assay kombination af 675 nM primere og 375 nM G12S sonde (rød stiplet firkant), 450 nm primere og 250 nM G12D sonde (blå stiplet firkant) og 225 nM primere og 125 nM G13D sonde (gul stiplet firkant). Multiplex C (øverste højre panel) er en assay kombination af 675 nM primere og 375 nM G12R sonde (rød stiplet firkant), 450 nm primere og 250 nM G12A sonde (blå stiplet firkant) og 900 nm primere og 500 nM Q61H sonde (gul stiplet firkant). Multiplex C har 900 nm primere og 500nM Q61H vildtypeprobe foruden en G12C vildtype-assay. Alle andre vildtype droplet populationer viste, undtagen i Q61H duplex assay er 450 nm primere og 250nM G12C vildtypeprobe. Alle paneler i venstre og center søjler viser en FAM amplitude op til 18000 og en HEX amplitude op til 6000. Paneler i højre kolonne har en FAM amplitude op til 18000 og en HEX amplitude op til 11000.

KRAS

multiplex ddPCR assay karakterisering

Faldende mængder af NCI-H358 (

KRAS

G12C) og A549 (

KRAS

G12S) gDNA blev tilsat i

KRAS

vildtype gDNA (NCI-H1975) og testet i den relevante

KRAS

multiplex assay. Detektionsgrænsen for

KRAS

G12C mutant DNA i multiplex A var 0,03% og for

KRAS

G12S DNA i multiplex B var 0,045% (S8 Fig, toppaneler) Den målte mutant allel frekvens korreleret godt med faldende mængder af tilsat

KRAS

mutant gDNA i multiplexer A og B (r2 = 0,9992 og 0,0998 henholdsvis), demonstrerer linearitet mutation afsløring i multiplex analyser. Mutante allel frekvens viste kun lidt intra-brønd variabiliteten for enten multiplex assay og høj reproducerbarhed mellem to forskellige operatører på tre skiftende dage for en række allelfrekvenserne (S8 Fig, midterste og nederste paneler).

Lignende

KRAS

allel frekvens blev observeret ved hjælp af multiplex eller duplex-analyser i både cellelinje-DNA (enkelt art

KRAS

mutant gDNA og kombinationer af

KRAS

mutant gDNA ved varierende allelfrekvenserne) eller oligonukleotider og FFPE væv DNA (figur 4; r2 = 0,9302 og 0,9542 henholdsvis)

Vi analyserede flere brønde i NCI-H1975

KRAS

vildtype gDNA med hver af de tre

KRAS

multiplex assays og beregnet sandsynligheden for falsk positive mutation afsløring, indstilling detektionsgrænsen på 0,05% for at afspejle vores målte resultater med spidse

KRAS

mutant gDNA arter (S8 Fig). Specificiteten af ​​hvert multipleks er 99,99995%, 99,99857% og 99,85578% for multiplex A, B og C (S1 tabel).

Sammenligning af

KRAS

multipleks assay mutant detektion med Sanger sekventering

En række prøver indeholdende faldende mængder af NCI-H358 (

KRAS

G12C) eller A549 (

KRAS

G12S) gDNA tilsat i

KRAS

Wild- skriv DNA (NCI-H1975) blev samtidigt analyseret ved hjælp af digital PCR og Sanger sekventering.

KRAS

G12C mutante DNA var påviselig ved hjælp multiplex A ned til en mutant allel frekvens på 0,2%, mens mutanten top på kromatogrammet er kun synlig ved en mutant allel frekvens på 31,5% og ikke under 10% (S9 fig, top paneler).

KRAS

G12S mutant DNA fortsat kan spores ved digital PCR hjælp multiplex B ved en mutant allel frekvens på 0,1%, men er kun synlig ved hjælp af Sanger sekventering på 17%. (S9 Fig, lavere paneler).

Påvisning af

KRAS

mutationer i FFPE væv DNA

FFPE væv DNA ekstraheret fra 11 tilfælde af fremskreden

KRAS

mutant NSCLC (S2 tabel) blev analyseret under anvendelse hver multiplex assay. Tilstedeværelsen af ​​en

KRAS

12/13 mutation blev kendt fra COBAS® test forud (COBAS®

KRAS

Mutation Test, Roche), men efterforskerne blev blindet til den specifikke

KRAS

genotype. Mindst én

KRAS

mutation blev påvist i hvert tilfælde og to tilfælde havde to påviselig

KRAS

kloner (Fig 5). Mutationer blev bekræftet med den passende duplex assay. Den lavfrekvente G12D mutation i tilfælde S011 kan repræsentere FFPE artefakt på grund af den hyppige deaminering af guaninnukleotider under vævskonservering proces [14]. Den G12F mutation i S018 blev identificeret ved efterfølgende sekventering af vævsprøven efter observation af små dråber population krydsreaktiviteten i alle multiplex assays. Desuden blev to arter af KRAS mutant gDNA tilsat til en baggrund af

KRAS

vildtype-DNA (NCI-H1975) gDNA at oprette tre prøver indeholdende en større og mindre KRAS klon; C1 er en kombination af NCI-H358 (

KRAS

G12C) og A549 (

KRAS

G12S) gDNA, C2 er en kombination af NCI-H358 (

KRAS

G12C) og A427 (

KRAS

G12D) gDNA og C3 er en kombination af A427 (

KRAS

G12D) og A549 (

KRAS

G12S) gDNA.