PLoS ONE: Inhibitor-Sensitive FGFR1 Amplification i Human Ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

Planocellulært lungecarcinomer udgør ca. 25% af alle nye lunge karcinom tilfælde og 40.000 dødsfald om året i USA. Selv om der er flere genomisk målrettede behandlinger for lunge- adenocarcinom, har ingen endnu blevet rapporteret i planocellulære lunge karcinom.

Metode /vigtigste resultater

Brug SNP array analyse, fandt vi, at en region af kromosom segment 8p11-12 indeholder tre gener-

WHSC1L1

,

LETM2

, og

FGFR1

-er forstærkes i 3% af lunge adenokarcinomer og 21% af planocellulære celler lungecarcinomer. Endvidere demonstrerede vi, at en ikke-småcellet lungekræft cellelinien huser fokal amplifikation af

FGFR1

er afhængig FGFR1 aktivitet for cellevækst, da behandling af denne cellelinje med enten

FGFR1

– specifikke shRNAs eller med FGFR småmolekyle enzymatiske inhibitorer fører til celle væksthæmning.

konklusioner /betydning

Disse undersøgelser viser, at

FGFR1

forstærkning er almindelig i planocellulært lungecancer, og at FGFR1 kan repræsentere en lovende terapeutisk mål i ikke-småcellet lungekræft

Henvisning:. Dutt a, Ramos AH, Hammerman PS, Mermel C, Cho J, Sharifnia T, et al. (2011) Inhibitor-Sensitive

FGFR1

Forstærkning i Human Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 6 (6): e20351. doi: 10,1371 /journal.pone.0020351

Redaktør: Ming Du, Medical College of Wisconsin, USA

Modtaget: December 30, 2010; Accepteret: April 30, 2011; Udgivet: 7 jun 2011

Copyright: © 2011 Dutt et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Funding:. Finansieringskilder for dette arbejde omfatte støtte fra Novartis Pharmaceuticals, American Lung Association, Uniting Against lungekræft, Sarah Thomas Monopoli Fund, den Seaman Foundation og Genentech til MM E.Kr. understøttes af en Ramalingaswami stipendium fra Institut for Bioteknologi, Ministeriet for Videnskab, Indiens regering. P.S.H. understøttes af en ung Investigator Award fra National Lung Cancer Partnership. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. M.M. er en konsulent til Novartis og modtager forskningsstøtte fra Novartis, modtager forskningsstøtte fra Genentech, og er stiftende rådgiver og konsulent, og en egenkapital holder i Foundation Medicine. N.G. laboratorium modtager sponsoreret forskning fra Novartis. Det betyder dog ikke ændre forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i de udviklede lande med dødsfald i 2009 anslås til ca. 160.000 i USA, der tegner sig for omkring 28% af alle kræftdødsfald [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) udgør 75% af alle lungekræfttilfælde og omfatter to fremherskende undertyper, adenocarcinom og pladecellecarcinom (SCC), som omfatter 40% og 25% af NSCLCs henholdsvis [2], [3] . Trods klare histologiske og biologiske forskelle, lunge adenocarcinom og pladecellekræft er i høj grad behandlet med de samme kemoterapeutika med undtagelse af antifolat pemetrexed, som er godkendt til behandling af ikke-pladecellekræft NSCLC [4].

Væsentlige fremskridt i behandlingen af ​​lunge adenocarcinom har stammede fra detaljerede genomiske analyser og indsættelsen af ​​molekylært målrettede agenter førende som har ført til forbedringer i patientresultater. Eksempler omfatter anvendelsen af ​​epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) hæmmere såsom gefitinib og erlotinib [5], [6], [7] for lunge adenokarcinomer bærer

EGFR

mutationer [8], [9], [ ,,,0],10], og ALK-hæmmere såsom crizotinib [11] for lunge adenokarcinomer bærer

EML4-ALK

translokationer [12], [13].

Men lidt er i øjeblikket kendt om målrette genetiske abnormiteter underliggende planocellulært lungekræft. Ud over

TP53

mutationer [14], skællede celle lunge karcinom har vist sig at havnen amplifikationer af

PIK3CA

[15],

SOX2

[16], og

EGFR

[16] samt

EGFR

variant III mutationer [17]

DDR2

mutationer [18] og sjældne amplifikationer af

PDGFRA /KIT

[ ,,,0],19], [20] og

BRF2

[21]. En nylig undersøgelse har vist omdrejningspunkt forstærkning af de

FGFR1

locus på kromosom 8p forbundet med cellulære afhængighed af

FGFR1

og følsomhed over for FGFR hæmmere [22]. På dette tidspunkt er der ingen FDA-godkendte målrettede behandlinger for planocellulært lungekræft.

Målretning forstærkede tyrosinkinaser med antistoffer eller med små molekyleinhibitorer har ført til dramatiske forbedringer i responsrater og samlet overlevelse af cancerpatienter, hvis tumorer harbor specifikke genomiske abnormiteter. Amplifikationer af

EGFR

ERBB2

er blevet rapporteret i en række forskellige maligniteter, herunder hoved og hals, esophageal, gastrisk, bryst og tyktarmskræft samt NSCLC [23]. Målretning af disse tyrosinkinaser, såsom brugen af ​​cetuximab at målrette

EGFR

i tyk- og hoved- og halskræft [24], [25] og brugen af ​​trastuzumab til at målrette

ERBB2

i brystkræft [26], har resulteret i en betydelig forbedring i patienternes resultater i hver af disse sygdomme, men ikke alle patienter med disse amplifikationer reagerer på målrettede agenter [27], [28], sandsynligvis på grund af yderligere genomiske forandringer i tumoren, der resulterer i den primære modstand mod bestemte agenser [29], [30].

fibroblast vækstfaktorreceptor type 1-genet (

FGFR1

) er en af ​​de mest almindeligt forstærket gener i human cancer [16 ]. Den fibroblast vækstfaktor receptor (FGFR) tyrosinkinase familie består af fire kinaser, FGFR1, 2, 3 og 4, der spiller afgørende rolle i udviklingen, og de har vist sig at være mål for deregulering, enten ved amplifikation, punkt mutation, eller translokation (revideret i [31]). Translokationer involverer

FGFR3

, samt aktivering af somatiske mutationer i

FGFR3

er blevet identificeret i myelomatose og blærekræft [32], [33], [34]. Vi og andre har identificeret aktiverende mutationer i

FGFR2

i endometriecancer [35], [36]. Forstærkning eller aktivering af

FGFR1

er blevet rapporteret i oral pladecarcinom [37], esophageal planocellulært karcinom [38], kræft i æggestokkene [39], blærekræft [40], prostatacancer [41], rhabodomyosarcoma [ ,,,0],42], og lungekræft [16], [43], [44], [45], [46]. I overensstemmelse hermed har en pan-FGFR tyrosinkinaseinhibitoren vist sig at blokere tumor proliferation i en undergruppe af NSCLC-cellelinier med aktiveret FGFR signalering, men har ingen virkning på celler, der ikke aktiverer pathway [47].

FGFR1

er blevet identificeret som føreren begivenhed i bryst carcinomer og NSCLC, især skællede celle lunge karcinom, husly lignende amplifikationer af 8p11 kromosomale segment [22], [48]

Baseret på SNP vifte kopi nummer analyse af 732 prøver, rapporterer vi, at

FGFR1

er somatisk forstærket i 21% af lunge pladecellecarcinomer sammenlignet med 3,4% af lunge adenokarcinomer. Vi validere FGFR1 som et potentielt terapeutisk mål ved at vise, at mindst en

FGFR1

-amplified NSCLC tumor cellelinie er følsom over for FGFR enzymatisk inhibering og afhængig af

FGFR1

udtrykket for cellelevedygtighed som vist ved shRNA behandling. Sammen med tidligere rapporter revideret ovenfor er disse resultater antyder, at FGFR1 kan være en attraktiv terapeutisk mål i NSCLC.

Materialer og metoder

NSCLC delprøver og cellelinier

NSCLC celle linjer, NCI-H1703 (skællede), NCI-H2444 (pulmonal), NCI-H520 (skællede), HCC95 (pladecellekræft), NCI-1581 (storcellet carcinom), Calu3 (ikke andetsteds specificeret), NCI-H1734 (ellers ikke specificeret), Colo699 (adenocarcinom), NCI-H2170 (skællede), NCI-H226 (skællede), A427 (adenocarcinom), NCI-H1563 (adenocarcinom), NCI-H1781 (adenocarcinom) og HCC15 (skællede) blev opnået fra samlingen af aF Gazdar, J. Minna og kolleger [49], [50], [51], fra ATCC (Manassas, Virginia, USA) og /eller DSMZ (Braunschweig, Tyskland). Celler blev opretholdt i RPMI 1640 komplet medium suppleret med 10% kalveserum (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) og penicillin /streptomycin (Gibco /Invitrogen). De NSCLC tumor /normal par analyseret i denne undersøgelse er blevet beskrevet tidligere [16], [20], [45], [50], [52].

SNP-array dataanalyse

SNP array-eksperimenter blev udført på 732 NSCLC tumor og celle line prøver og data analyseret som beskrevet tidligere [16], [20], [45], [50], [52]. Grænserne for den 8p11 amplikonet defineret af transportcenter analyse [53] blev identificeret som rapporteret [52] (https://www.broadinstitute.org/tumorscape/pages/portalHome.jsf). Datavisning er blevet udført under anvendelse af Integrative Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv).

Transfektion og infektion

Phoenix 293T pakning cellelinje (Orbigen, San Diego, California, USA) blev transficeret med pBabe-Puro-baserede gateway vektorer ved hjælp Fugene® 6 Transfektion Reagent (Roche, Indianapolis, USA) til at generere replikation inkompetente retrovirus. Målceller blev inficeret med disse retrovira i nærvær af 8 ug /ml polybren. To dage efter infektion blev cellerne behandlet med 2 ug /m puromycin (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) i to dage. De resulterende stabile cellelinier blev anvendt til eksperimentelle undersøgelser.

shRNA medieret

FGFR1

knockdown

shRNA vektorer blev opnået fra TRC (The RNAi Consortium). De målsekvenser af shRNA konstruktioner er:

FGFR1

# 1 (TRCN 0000121307):. 5’AGTGGCTTATTAATTCCGATA-3 ‘

FGFR1

# 2 (TRCN 0000121308): 5’GCTTGCCAATGGCGGACTCAA-3 ‘

FGFR1

# 3 (TRCN 0000121309):. 5’CTTGTATGTCATCGTGGAGTA-3′.

FGFR1

# 4 (TRCN 0000121310): 5’CAAGATGAAGAGTGGTACCAA-3 ‘

FGFR1

# 5 (TRCN 0000121311):. 5’GAATGAGTACGGCAGCATCAA-3′.

LETM2

# 1 (TRCN 0000040243): 5’CGCACCTTCTACCTGATAGAT-3 ‘

LETM2

# 2 (TRCN 0000040244):. 5′ CCCAGCACAAAGGAGATAGTT-3 ‘

LETM2

# 3 (TRCN 0000040245):. 5’CCAGTTACATCATCACCCATA-3′.

LETM2

# 4 (TRCN 0000040246): 5’CCAGGAACTAGACTAATACAA-3 ‘

LETM2

# 4 (TRCN 0000040247):. 5’GCATTGAGTGTATCAGAACTA-3′.

WHSC1L1

# 1 (TRCN 0000015613): 5’CGAGAGTATAAAGGTCATAAA-3 ‘

WHSC1L1

# 2 (TRCN 0000015614):. 5’CCATCATCAATCAGTGTGTAT-3′.

WHSC1L1

# 3 (TRCN 0000015615): 5’CGAGAATATCATGTCCAGTTT-3 ‘

WHSC1L1

# 4 (TRCN 0000015616):. 5’GCTTCCATTACGATGCACAAA-3′ .

WHSC1L1

# 5 (TRCN 0000015617):. 5’GCAGGGAATTGTTTGAGTCTT-3 ‘

sekvensen målrettet af

GFP

shRNA er 5 ‘-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT-3’. Lentivira blev fremstillet ved transfektion af 293T emballage celler med disse konstruktioner ved hjælp af en tre-plasmid-system som beskrevet tidligere [54]. Målceller blev inkuberet med lentivirus i 6 timer i nærvær af 8 ug /ml polybren og venstre i frisk medium. Celler blev dyrket i to dage. Halvtreds mikrogram totale cellelysater fremstillet ud fra de inficerede cellelinjer blev analyseret ved Western blotting.

vækst og proliferation assays

I overlevelse assays, 2 × 10

6 celler for hver tumorcelle der udtrykker shRNAs konstruktioner målretning

FGFR1

,

WHSC1L1

,

LETM2

eller

GFP

sammen med ikke-inficerede celler blev podet i tre replikater på en 6 brønds plade . Cellelevedygtighed blev bestemt ved 24 timers tidspunkter i 4 på hinanden følgende dage ved at tælle cellerne under anvendelse af Beckman Coulter Vi-celle Automatiseret cellelevedygtighed Analyzer efter trypanblåt-farvning. Procentdelen af ​​cellelevedygtigheden blev plottet for hver cellelinje af aflæsninger opnået på dag 4 i forhold til dag 1.

blød agar forankringsuafhængig vækst assay

I blød agar assays, 2 × 10

4 NSCLC celler, der udtrykker sh

FGFR1

og sh

GFP

blev suspenderet i en øverste lag af RPMI1640 indeholdende 10% kalveserum og 0,4% Select agar (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) og udpladet på et bundlag af RPMI1640 indeholdende 10% kalveserum og 0,5% Vælg agar på en 6-brønds plade. PD173074 eller FIIN-1 [55] blev tilsat som beskrevet til topagar. Efter 3-5 uger inkubation kolonier blev talt tre gange. IC50-værdier blev bestemt ved ikke-lineær regression ved hjælp af Prism 5 software (GraphPad Software).

Cytotoksicitetsassays

Afhængigt af vækstkurver for hver cellelinie, mellem 800 og 2000 NSCLC-celler blev podet i 6 replikater i brønds plade 96-. En dag efter udpladning stigende doser af FGFR hæmmere PD173074 eller FIIN-1 blev tilsat, og proliferation af celler blev vurderet 4 dage senere under anvendelse af WST-1 assay (Roche Applied Science). Hvert datapunkt repræsenterer medianen af ​​seks replikatbrønde for hver tumorcellelinje og inhibitorkoncentration. IC50-værdier blev bestemt ved ikke-lineær regression ved anvendelse af Prism Graphpad software.

Western blots Salg

Samlet protein blev ekstraheret og separeret ved gelelektroforese ved lysere celler i en buffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,4 ), 150 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, 1% Triton X-100 og 0,25% IGEPAL. Proteasehæmmere (Roche Applied Science) og phosphatase-inhibitorer (Calbiochem) blev tilsat før anvendelse. Før du lægger til gelen, prøver blev normaliseret til samlede proteinindhold. Total protein lysater blev kogt i prøvebuffer, adskilt ved SDS-PAGE på 8% polyacrylamidgeler, overført til PVDF-membran og probet natten over anvendelse af de passende primære antistoffer. Antistoffer anvendt til immunoblotting var: anti- FGFR1 antistof (# 3472, cellesignalering Technologies, Danvers, MA, Amerikas Forenede Stater), anti phospho FRS2 Y436 (# 3861, cellesignalering Technologies, Danvers, MA, Amerikas Forenede Stater), anti-phospho -FRS2 Y196 (# 3864, cellesignalering Technologies, Danvers, MA, Amerikas Forenede Stater), anti-FRS2 (# sc-17841, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Amerikas Forenede Stater). anti-WHSC1L1 monoklonalt antistof (# sc-130.009, Santa Cruz Biotechnology), anti-LETM2 monoklonalt antistof (# ab84626, Abcam), og anti-Actin monoklonalt antistof (# sc-1615 Santa Cruz Biotechnology).

Statistisk analyse

Sammenligninger mellem SNP-array kopital data for lunge- adenocarcinom (AC) og pladecellecarcinom (SCC) tumorer blev udført under anvendelse af Fishers eksakte T-test til beregning tosidede p-værdier blandt prøver indeholdende høje forstærkning, defineret som log2 forholdet 0,7 eller 3,25 normaliserede DNA-kopier. P-værdier. 0,05 blev anset for signifikant

For at bestemme IC50 for FGFR hæmmere, levedygtighed celle målinger af seks gentagelser på forskellige koncentrationer af inhibitorer var normaliseret til ubehandlede kontrol celler. Sigmoidale dosis-respons-kurver blev tilpasset til dataene ved ikke-lineær regression ved anvendelse af GraphPad Prism software. Standardafvigelser blev bestemt for gennemsnittet af hver værdi ved hjælp af et indbygget modul af softwaren.

For shRNA eksperimenter, der udføres i tre gentagelser blev celletallet tælles og middelværdien og standardafvigelsen blev bestemt ved hjælp af funktioner i Microsoft Excel.

Resultater

FGFR1

forstærkes i ikke-småcellet lungekræft

Vi undersøgte 8p11-12 genomisk region hjælp Affymetrix 250K SNP-array kopi nummer data i en tidligere rapporteret data sæt af 732 NSCLC prøver, (628 primære tumorer og 104 cellelinier) (tabel S1) [16], [20], [45], [50], [52]. Vi observerede høje forstærkning, defineret som log2 forholdet 0,7 eller 3,25 normaliserede DNA-kopier, af 8p11-12 kromosomale segment omfatter den

FGFR1

locus i 44 (6%) af NSCLC prøver (figur 1a; Table S2). Størstedelen (93%; 41/44) af disse amplifikationer var relativt fokale begivenheder ( 50% af længden af ​​kromosom 8p) indikerer præferentiel udvælgelse af de specifikke målgener i samme region som amplifikation [52]. Den udledte kopital af de amplifikationer, normaliseret til en kopi antal 2 for hver prøve, varierede fra 3,25 til 25 kopier (median = 2,8 kopier). Den anslåede omfang af regionen fokale amplifikationer varierede fra 0,47 til 112,7 Mb (median = 2.74 Mb)

(A) Kopi nummer anslår til kromosom arm 8p11-12q for 44 NSCLC prøver (kolonner;. Bestilt af forstærkning af 8p11) med amplifikation på over 3,25 kopier (log2 forholdet på 0,7) fra en samling af 732 NSCLC delprøver og cellelinier. Den vandrette linje angiver region, der indeholder

FGFR1

,

LETM2

WHSC1L1

gener. Farveskalaen går fra blå (tekst udgår) til rød (forstærkning) med anslåede antal kopi vist. Grå regioner repræsenterer fravær af SNP kopital data. (B) Bar graf, der viser procentdele af prøver huser 8p11-12 forstærkning i lunge adenokarcinomer (AC) og pladecellekræft (SCC) viser, at

FGFR1

forstærkning er observeret i SCC i langt højere frekvens end AC. (C) FGFR1 ekspression (øvre panel) vist i ti NSCLC celler; otte cellelinjer huser

FGFR1

forstærkning-HCC1734, HCC95, NCI-H2444, Calu3, NCI-H2077, NCI-H1703, NCI-H1581 og NCI-H520 (angivet med rødt horisontale bar nedenfor) -on NSCLC celle line huser sletning af regionen HCC15 (angivet med blå vandrette bjælke nedenfor) – og tre NSCLC celler uden forstærkning-A427, NCI-H226, NCI-H2170 (angivet med sort vandret bar nedenfor) – ved hjælp af actin som lastning kontrol (vist i nedre panel).

FGFR1

kopital status og 8p11-12 amplicon længde bestemmes af SNP-array er angivet nedenfor celler indeholdende amplifikation. Notatet blev NCI-H2077 og NCI-1581 fundet at være genotypisk identisk med fingeraftryk analyse.

For at identificere områder af væsentlig kopi-nummer ændring, vi anvendte transportcenter (Genomisk Identifikation af væsentlige lægemidler mod cancer ) [53], og identificeret en 170 Kb region på 8p11 (38,28-38,45 Mb) som væsentligt forstærket. Mens det overordnede mønster af 8p11 forstærkning var i overensstemmelse med litteraturen om lungekræft som rapporteret, vores stikprøve størrelse og opløsning forudsat mere magt til præcist at identificere og lokalisere både store og fokale kromosomale ændringer i forhold til tidligere rapporter [45], [52 ]. De eneste gener i regionen forstærkning identificeret i vores analyse på tværs af alle prøver var

FGFR1

LETM2

. I vores kopi nummer data,

WHSC1L1

var generelt forstærket med

FGFR1

LETM2

(41/44 prøver), men hele

WHSC1L1

gen gjorde ikke falder ind under transportcenter top (CHR8: 38,284,229-38,451,475). Konkret tre primære tumor prøver med forstærket

FGFR1

LETM2

gener havde amplicon breakpoints i

WHSC1L1

, forklarer udelukkelsen af ​​

WHSC1L1

fra transportcenter amplifikation top (fig S1, figur S2). Amplikonet breakpoints inden

WHSC1L1

er i overensstemmelse med en manglende amplifikation af den funktionelle SET-domænet (CHR8: 38,265,630-38,255,125) associeret med histon methyltransferase enzymatisk aktivitet af genproduktet [56]. Disse resultater udelukker ikke

WHSC1L1

som målet for forstærkning på 8p11 sammen med

FGFR1

men tyder på, at dets histon methyltransferaseaktivitet er ikke sandsynligt, at være specifikt målrettet til forstærkning.

ved sammenligning undertyper af NSCLC primære tumorer og cellelinier, 3,4% (20/588) af adenokarcinomer og 21% (12/57) af planocellulært karcinom nærede 8p11 amplifikationer, hvilket indikerer, at mens 8p11 forstærkes ved mærkbare frekvenser på tværs af både større NSCLC undertyper, er det fortrinsvis forstærkes i SCC (

s

0,001, Fisher eksakt test) (figur 1b). Ingen statistisk blev observeret signifikante korrelationer mellem tilstedeværelsen af ​​8p11 amplificeringer og tilgængelige kliniske parametre, herunder histologi, grad af histologisk differentiering, scenen på kirurgisk resektion af tumorer og alder, køn eller indberettet etnicitet af patienterne (Tabel S3). Derudover målrettet sekventering af kinase domæne af

FGFR1

i 52 NSCLC cellelinjer og af hele

FGFR1

kodende sekvens i tre cellelinier (NCI-H1581, NCI-H1703, NCI-H2170 ) afslørede ikke nogen tegn på kinasedomæmemutationer (data ikke vist).

SNP-array data viste en forhøjet

FGFR1

genkopiantallet i 11 NSCLC cellelinjer ud af 104 NSCLC cellelinjer analyseret (figur S3) med amplificeringer observeret i 36% (4/11) af planocellulære NSCLC cellelinjer analyseret. Vi undersøgte FGFR1 proteinekspression ved immunoblotanalyse i 8 primære NSCLC cellelinjer, som skjuler fokal eller bred 8p11 forstærkning over en log2 forhold på 1,6 eller 6,0 normaliserede DNA-kopier (NCI-H1703, NCI-H2444, NCI-H520, NCI-1581, NCH -H2077, Calu3, NCI-H1734, og HCC 95), 3, der har omtrent neutral

FGFR1

kopi nummer (NCI-2170, NCI-H226 og A427) og 3, der huser

FGFR1

sletning (NCI-H1781, NCI-H1563 og HCC15) ved immunoblotanalyse. Vi fandt 6 af 8

FGFR1

forstærkede NSCLC cellelinjer overudtrykker FGFR1 sammenlignet med cellelinier, der ikke huser forstærkning, med undtagelse af NCI-H1703 og Calu3 celler (Figur S4, figur 1c). I overensstemmelse med dette fund, NCI-H1703, som huser et 8p11 forstærkning, har vist sig ikke at være afhængig af

FGFR1

[44], men på forstærket

PDGFRA

[19], [20] . Endvidere blev et forhøjet niveau af phosphorylering af FGFR1 substrat FRS2 observeret i NCI-H1581 storcellet carcinom celler, der bærer fokal amplifikation af

FGFR1

, men ikke i celler indeholdende relativt bredere niveauer af

FGFR1

forstærkning (Figur S4).

FGFR1

er nødvendig for overlevelsen af ​​en NSCLC cellelinje huser omdrejningspunkt forstærkning

Baseret på vores kopi nummer analyse,

FGFR1

og

LETM2

faldt inden for transportcenter definerede region i statistisk signifikant forstærkning med

WHSC11

umiddelbart tilstødende. For at bestemme den cellulære krav om gener i regionen målrettet efter forstærkningen, vurderede vi kravet om

WHSC1L1

,

LETM2

og

FGFR1

udtryk for tumor vedligeholdelse ved at udtømme dem individuelt ved hjælp af shRNA. Transfektion med fem shRNA konstruktioner, målretning enten

WHSC1L1

eller

LETM2

havde ingen differentiel virkning på overlevelsen af ​​celler, der huser fokal eller bred 8p11-12 amplifikation sammenlignet med kontroldyr celler uden forstærkning (data ikke vist).

i modsætning hertil tre ud af fem shRNA konstrukter målretning

FGFR1

, som alle førte til en 3- til 5 gange fald i FGFR1 proteinniveauer forhold til shRNA kontroller (figur 2a), signifikant hæmmede celle overlevelse i en NSCLC cellelinie bærer et samlingspunkt

FGFR1

forstærkning (NCI-H1581, figur 2b). shRNA konstruerer # 3 og # 4, der ikke førte til betydelig knockdown af FGFR1 protein niveauer, påvirkede ikke overlevelse celler, der huser 8p11 forstærkning (figur 2b). Der var ingen observerede overlevelse effekter af

FGFR1

shRNA på cellelinjer huser relativt bredere

FGFR1

forstærkning (NCI-H1703, HCC95, HCC1734, Calu3, ikke vist) eller uden

FGFR1

forstærkning (NCI-H2170;. Figur 2c HCC15, NCI-H1563 og NCI-H1781, ikke vist). Samlet set har disse resultater hævder, at

FGFR1

udtryk er nødvendig for levedygtigheden af ​​mindst én NSCLC cellelinje bærer en

FGFR1

forstærkning.

(A) Virkninger af fem

FGFR1

shRNA konstruktioner på FGFR1 proteinekspression i NCI-H1581-celler som analyseret ved immunblotting. shRNAs # 1, # 2 og # 5 effektivt banke ned endogen FGFR1 udtryk i NCI-H1581 celler inficeret med shRNA udtrykker lentivirus mens shRNAs # 3 og # 4 ikke gør. Actin er vist som en loading kontrol (nederste panel).

(B

og

C)

, infektion med tre uafhængige FGFR1-undertrykke hårnåle (# 1, # 2 og # 5) hæmmer overlevelse NCI-H1581 celler i at udtrykke

FGFR1

(B), men ikke hæmme overlevelsen af ​​celler ikke huser

FGFR1

forstærkning, NCI-H2170 (C) som vurderet ved WST assay. NI, ingen infektion. shGFP, styre hårnål specifikt for grønt fluorescerende protein anvendes som en negativ kontrol. Alle resultater normaliseret til overlevelsen af ​​celler inficeret med shGFP.

For yderligere at validere specificitet levedygtighed celle ændringer i forbindelse med shRNA-induceret FGFR1-udtømning, vi undersøgte muligheden for ektopisk udtryk for

FGFR1

cDNA at redde virkningerne af FGFR1 vælte. Vildtype

FGFR1

cDNA, der mangler 3′-utranslaterede region (UTR) af det endogene FGFR1 mRNA målrettes af FGFR1 shRNA # 1, blev overudtrykt i NCI-H1581-celler transficeret med denne shRNA konstruktion. Rekonstituerede niveauer af vildtype FGFR1 protein resulterede i signifikant redning af overlevelse hæmning fænotype (figur 3a, c), men havde ingen indflydelse på

FGFR1

-uafhængige NCI-H2170 celler (figur 3b). Kollektivt, disse eksperimenter implicerer

FGFR1

som en kritisk onkogen mål på 8p11-12 forstærkning.

(A) Søjlediagram til redning assay. Letalitet på grund af nedfiskede niveauer på endogen FGFR1 niveau i NCI-H1581 er reddet af overekspression af vildtype (WT) fuld længde

FGFR1

kodende sekvens. (B) Ingen effekt på overlevelsen af ​​NCI-H2170 celler blev observeret på grund af overekspression af vildtype form af FGFR1. NCI-H2170 er ikke afhængig af FGFR1 aktivitet. NI, ingen infektion. shGFP, styre hårnål specifikt for grønt fluorescerende protein anvendes som en negativ kontrol. Alle resultater er normaliseret til overlevelsen af ​​celler inficeret med shGFP. De viste data er som gennemsnit af tre gentagelser. (C) Validering af FGFR1 redning ved immunoblotting. Udtømte niveauer af endogent FGFR1 niveau i NCI-H1581-celler inficeret med

FGFR1

shRNA-udtrykkende lentivirus rettet mod FGFR1 3’UTR (bane 1) er reddet ved overekspression af vildtype form af FGFR1 cDNA mangler 3’UTR (bane 2) med samtidig beskedne redning i niveauer tyrosinrest phosphorylering af FGFR1 substrat FRS2 (midterste panel). Actin er vist som en belastning kontrol (nederste panel).

Interessant, en NSCLC cellelinje bærer et samlingspunkt

FGFR1

forstærkning, NCI-H2444 (figur S3), var ikke følsom til knockdown af FGFR1 (data ikke vist). Denne cellelinie huser også et aktiverende

KRAS

G12V mutation [57], [58], som er associeret med resistens af colorektale cancere til EGFR-rettet terapi cetuximab [25]. NCI-H2444 viser ikke FRS2 fosforylering (Figur S4). Denne observation tyder på, at samtidig forekomst af andre aktiverende onkogener kan lindre

FGFR1

afhængighed og specifikt, at den primære modstand mod FGFR1 hæmning kan være underlagt

KRAS

mutation status.

FGFR kinase hæmmere hæmmer væksten af ​​

FGFR1

forstærkede NSCLC celler

for at vurdere muligheden for, at målrette

FGFR1

i 8p11 forstærkede SCC’er kunne repræsentere en ny terapeutisk strategi i VKF, vi studerede virkningerne af den pan-FGFR inhibitor PD173074 på NSCLC-cellelinjer.

FGFR1

-amplified NCI-H1581-celler var følsomme over for behandling med PD173074 som analyseret ved kolonidannelse i blød agar med IC

50s i området 10-20 nM (figur 4a og figur S5). I modsætning hertil NCI-H2170-celler med vildtype

FGFR1

kopital var ufølsomme for PD173074 (figur 4a). Vi udførte også PD173074 dosisresponskurver på celleoverlevelse i flydende kultur for at sammenligne følsomheden af ​​celler, der huser

FGFR1

amplifikation og dem uden, og igen fundet, at NCI-H1581-celler blev dræbt ved IC50-værdier på 14 nM, mens dem uden amplifikation kræves mere end 100 gange højere doser af PD173074 til at inhibere proliferation (figur 4b). I overensstemmelse med disse resultater, vi også observeret, at en anden FGFR irreversibel hæmmer, FIIN-1, hæmmer spredning af NCI-H1581 celler med fokal

FGFR1

forstærkning i forhold til NCI-H2170 uden

FGFR1

amplifikation, med IC50-værdier på 2,5 nM versus mere end 10 mikromolær, henholdsvis (fig S6).

(A) Behandling med de angivne koncentrationer af pan FGFR inhibitor PD173074 inhiberede blød agar-kolonidannelse af NCI-H1581 NSCLC cellelinjer huser

FGFR1

forstærkning sammenlignet med NCI-H2170 linje, som ikke huser

FGFR1

forstærkning. Kolonier blev fotograferet og kvantificeret efter 4 uger. (B) Behandling med de angivne koncentrationer af PD173074 inhiberede overlevelse NCI-H1581-celler, men ikke af NCI-H2170-celler, som bestemt ved WST-assay udført efter 4 dages behandling. IC50 er angivet.

Diskussion

Her har vi vist, at

FGFR1

ofte forstærkes i lungecarcinomer og at denne forstærkning er beriget i lunge SCC’er. Mindst en NSCLC cellelinje med fokalt amplificerede

FGFR1

kræver genet som påvist af shRNA udtømning, og er også følsomme over for hæmning med FGFR kinaseinhibitorer. Salg

andre end Genes

FGFR1

er blevet foreslået at være den funktionelle mål for forstærkning på kromosom segment 8p11-8p12, især

WHSC1L1

[44] og

BRF2

[21]. Vi mener imidlertid, at de fremlagte beviser her såvel som i en nylig rapport [22] argumenterer for

FGFR1

som funktionelle mål for forstærkning i mindst én NSCLC cellelinje. Derudover er der i vores datasæt

WHSC1L1

ikke forstærkes i alle de

FGFR1

forstærkede prøver og hævder, at det er usandsynligt, at den eneste relevante forstærket gen i 8p11-12 amplikon. Den cellelinie, viste sig at kræve

WHSC1L1

for dens overlevelse, NCI-H1703 [44], ikke over-express FGFR1 (figur 1c), viser ikke FRS2 fosforylering (figur S4) og er afhængig af andet forstærket tyrosinkinase onkogen,

PDGFRA

[19], [20]. I modsætning hertil knockdown af

WHSC1L1

havde nogen indflydelse på

FGFR1

-amplified,

FGFR1

udtrykkende NCI-H1581 celler, hvilket antyder, at opformering af enten gen kan bidrage til cellulære transformation i passende cellulære kontekst.

en nylig undersøgelse karakterisering DNA-amplifikation i NSCLC foreslog, at

BRF2

, der koder for et transskriptionsinitieringskompleks underenhed af RNA-polymerase III, er målet for amplifikation i 8p11 amplikon [21]. Vi sammenlignede

FGFR1

forstærkning til

BRF2

forstærkning i lyset af denne rapport og fandt, at 12 prøver med den højeste forstærkning af

FGFR1

i vores datasæt (log2 forholdet