PLoS ONE: Identifikation af Novel GRM1 mutationer og Single nukleotidpolymorfismer i Prostata Cancer cellelinjer og Tissues

Abstrakt

Metabotropic glutamat receptor 1 (GRM1) signalering har været impliceret i benigne og maligne lidelser, herunder prostatakræft (PCA ). For yderligere at undersøge rollen af ​​genetiske ændringer af

GRM1

i PCa, vi screenede hele menneske

GRM1

gen, herunder kodende sekvens, exon-intron-kryds, og flankerende uoversatte regioner (UTR’er) til tilstedeværelse af mutationer og enlige nukleotid polymorfier (SNP) i flere PCA cellelinjer og matchede tumor-normal væv fra kaukasiske amerikanere (CAS) og afroamerikanere (AAS). Vi brugte tovejs sekventering, allel-specifik PCR, og bioinformatik til at identificere de genetiske ændringer i

GRM1

at forudsige deres funktionelle rolle. En roman missense mutation identificeres på C1744T (582 Pro Ser) position

GRM1

gen i en primær AA-PCa cellelinie (E006AA) blev forudsagt at påvirke protein stabilitet og funktioner. En anden ny mutation er identificeret ved exon-intron krydset af exon-8 i C4-2B cellelinje resulterede i ændring af

GRM1

splejsning donor site. Desuden fandt vi missense SNP på T2977C (993 Ser Pro) position og flere ikke-kodende mutationer og SNP’er i 3′-UTR af

GRM1

gen i PCA-cellelinjer og væv. Disse nye mutationer kan bidrage til sygdommen ved ændringer i

GRM1

gensplejsning, receptor-aktivering, og post-receptor nedstrøms signalering

Henvisning:. Ali S, Shourideh M, Koochekpour S (2014) Identifikation af Novel

GRM1

mutationer og Single-polymorfismer i prostatakræft cellelinier og væv. PLoS ONE 9 (7): e103204. doi: 10,1371 /journal.pone.0103204

Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA

Modtaget: 16. april, 2014 Accepteret: 25 juni 2014; Udgivet: 25 Jul 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af R01MD005824, R21CA183892, og R21CA181152 tilskud til Dr. Shahriar Koochekpour. Yderligere støtte blev leveret af Roswell Park Cancer Institute og National Cancer Institute tilskud # P30 CA016056. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Glutamat signalering fører til aktivering af flere nedstrøms signalering kaskader. Disse nedstrøms signalering kaskader omfatter (i) aktivering af ligand-gatede ionkanaler (kendt som ionotrope glutamatreceptorer (iGluRs)) og tilstrømning af Ca

2+ og /eller K

+ ioner i centrale og perifere nervesystem [ ,,,0],1], (ii) aktivering af metabotrope glutamatreceptorer (mGluR’er) er kendt som G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) og second messenger veje såsom phospholipase C (PLC), phosphoinositid 3-kinase /retrovirus AK thymom /mTOR (PI3K /AKT /mTOR) [2], og (iii) aktivering af G-protein-uafhængige signaltransduktionsveje, mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og proteinkinase C (PKC) /ERK1 /2-pathways [3], [4]. Sidste to signalering kaskader, PI3K /AKT /mTOR og MAPK /ERK har udførligt været impliceret i flere humane kræftformer og understrege betydningen af ​​glutamat signalering i tumorigenese [4]

mGluRs omfatter en grundlæggende karakteristiske arkitektur:. En stor bi-fligede ekstracellulære amino-terminale domæne (ATD) også kendt som “fluefanger” med en sekvens af 24 aminosyrer for glutamat bindingssted, et 70 aminosyre cystein-rige domæne (CRD), der kræves for dimerisering efter aktivering, efterfulgt ved klassiske syv alpha-helix transmembrandomæne og et intracellulært domæne cytoplasmatiske hale (CTD) [5]. Forskellige isoformer af gruppe I-mGluR’er (mGluR1) blevet identificeret, afhængigt af længden af ​​C-terminale domæne [5]. Dette C-terminale domæne omfatter en prolin-rig Homer1 bindende motiv (isoform a), som omfatter i indviklede protein-protein interaktioner og kompleksdannelse med downstream molekyler [6]. Trunkering af CTD fører til tab af Homer1 bindende motiv i isoformer b-d og dermed påvirker interaktionen med andre downstream signalmolekyler og veje [5]. Tilstedeværelse af forskellige længde isoformer af

GRM1

gen med varierende rolle i efterfølgende aktivering af nedstrøms signalveje, fremhæve betydningen af ​​splejsning mekanismer i

GRM1

genfunktion [5].

mGluR’er signaleringen blev oprindeligt impliceret i cellulær proliferation af gliomceller [7] og melanom udvikling [8] enten i

in vitro

eller

in vivo Salg studier og efterfølgende denne receptor blev vist at spille en afgørende rolle i forskellige typer af kræft [9], [10], [11], [12] Onkogen funktion af mGluR1 blev vist ved induktion af transformerede fænotype med overekspression af

GRM1

gen i melanocytter [13] . Tilsvarende i vores tidligere undersøgelse, undersøgte vi ekspressionen af ​​mGluR1 i primære og metastatiske PCA cellelinjer og væv [10]. PCa vækst celler afhængighed

GRM1

-signalling blev også demonstreret ved glutamat blokade eller brug af Riluzole, som GRM1 antagonist eller en inhibitor af glutamat release. Riluzol reducerede PSA-celler proliferation, migration, invasion, og inducerede apoptose som vist ved forøget ekspressionsniveau af spaltet caspase-9, -7, -3, PARP, og phospho-H2AX

Ser139 [10].

Somatiske mutationer er blevet identificeret i forskellige domæner af mGluR’er, herunder ligandbindende domæne, transmembrandomænet og cytosoliske domæne i forskellige typer af cancer [4]. Missense mutationer af mGluR identificeret i forskellige domæner kan have biologisk relevans i kræft. Faktisk er der rapporteret somatiske mutationer i mGluR’er at fremme brystcancer, melanoma, og renalcellecarcinom vækst og progression

in vivo

[11], [12], [14]. Esseltine og kollega [15] studerede de funktionelle konsekvenser af multiple missense mutationer identificeret i forskellige domæner af mGluR’er i flere typer af cancer, herunder lunge adenocarcinom, pladecellecarcinom, high-grade astrocytoma, og brystcancer. Disse missense mutationer i forskellige områder af mGluRs påvirker receptor-ekspression og give selektiv fordel til forskellige nedstrøms signalveje (f.eks PI3K /Akt /mTOR, ERK1 /2-aktivering) og ændringer i cellulær morfologi.

Der findes få rapporter for GRM1 mutationer og enlige nukleotid polymorfier (SNP) i PCA-cellelinjer eller væv. Disse undersøgelser er begrænset til hel-exome sekventering og transkriptom analyse. Disse høje throughput analyser ikke er i stand til at identificere intron-exon vejkryds eller ikke-kodende varianter og kræver yderligere eksperimentel validering af de identificerede mutationer. Desuden har disse undersøgelser ikke omfatter African American (AA) -PCa prøver og cellelinier til GRM1 mutation eller SNP afsløring. For at overvinde disse begrænsninger, screenede vi fuldlængde GRM1 gen der indbefatter alle exoner, exon-intron junctions, og flankerende ikke-kodende 5′- og 3′-utranslaterede regioner (UTR’er) at identificere genetiske ændringer i flere PCA cellelinier og matchede tumor -Normal væv i AA’ere og kaukasiske amerikanere (CAS). Vi identificerede nye mutationer og SNP’er i GRM1 gen. Funktionelle konsekvenser af disse mutationer blev forudsagt ved hjælp af tilgængelige online bioinformatiske værktøjer.

Materialer og metoder

cellelinier

Vi screenede det genomiske DNA af ti PCA cellelinier (PC-3 , E006AA, DU-145, MDA-PCa2b, 22RV1, LAPC4, VCAP, CWR-R1, LNCaP, C4-2B) og normal prostata epitelceller til påvisning af mutationer og polymorfier i kodende region, flankerende utranslaterede områder (5’og 3’UTR’er) og exon-intron junctions af fuld længde

GRM1

gen.

kastrere-resistente (PC-3, DU-145, MDA-PCa2b, VCap, og 22RV1) og androgen- stimuleret (LNCaP og LAPC4) PCA cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA) [16], [17]. Normale prostata epitelceller (NL-Pr.EC) og C4-2B cellelinier blev indkøbt fra Clonetics (Bio Whittaker, Walkersville, MD) og UROCOR (Uroscience Gruppen, Oklahoma City, OK) hhv. E006AA blev etableret fra et AA patient med orgel-indesluttede PCa [16]. CWR-R1-cellelinje blev tilvejebragt som en gave fra Dr. Elizabeth Wilson (University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) [18]. PC-3 blev DU-145, og VCap cellelinier opretholdt i DMEM suppleret med føtalt bovint serum (FBS, 10%) og antibiotika (1%). E006AA, 22RV1, CWR-R1, C4-2B, og LNCaP-cellelinjer blev dyrket i RPMI1640 med FBS (10%) og antibiotika (1%). MDA-PCa2b cellelinje blev dyrket i definerer medium som anbefalet af producenten (ATCC, Manassa, VA). LAPC4 cellelinjer var kulturen i IMDM suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika.

Tumor Prøver og Etisk Statement

For at vurdere genetiske ændringer i

GRM1

gen, vi inkluderet i alt 21 matches prostata normal-tumorprøver opnået fra atomabsorptionsspektrometri (n = 10) og CA’er (n = 11). Alle væv biospecimens blev opnået fra biospecimen core facilitet på Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC) tilknyttet Tulane Medical School og School of Medicine, Louisiana State University Health Sciences Center (LSUHSC, New Orleans, LA). Pre-informeret skriftligt samtykke formular blev opnået fra hver patient under kollektionsprøver til brug af deres prøver i videnskabelige opdagelser og undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) ved LSUHSC. Matchet normal-tumorvæv var tilgængelige for otte tilfælde (N3-T3, N4-T4, N5-T5, N13-T13, N21-T21, N35-T35, N52-T52, N71-T71) i CA’er og seks sager (N2 -T2; N6-T6, N26-T26, N27-T27, N32-T32, N38-T38) af AA patienter

Genomisk DNA isolation, Polymerase Chain Reaction, og sekventering af

GRM1

Gene

Genomiske DNA’er blev isoleret fra prostatavæv og cellelinjer under anvendelse AllPrep DNA /RNA Quigen (Qiagen, Valencia, CA). Fuld længde

GRM1

gen (isoform α) blev valgt (NM_000838.3) til at designe primerne dækker alle exoner, exon-intron vejkryds og 5′- og 3′-UTR’er. Denne udskrift omfatter i alt ni exons. Baseret på mutationer og SNP’er opdaget i exon-8 og -9 i PCA-cellelinjer, valgte vi disse regioner for yderligere sekventering i matchede tumor-normal væv. Primer design blev udført under anvendelse PrimerSelect værktøj af DNASTAR Lasergene 9 core suit (DNASTAR, Madison, WI). I alt 9492 bp blev amplificeret i seksten amplikoner herunder flankerende 50-100 bp, der dækker exon-intronsekvens. Primer detaljer (sekvens, smeltetemperatur og amplikonstørrelse) er tilvejebragt i tabel S1. Hver genomisk DNA-prøve (i alt 25 ng) blev amplificeret ved 32 cyklusser i 10 pi totalvolumen på polymerasekædereaktion (PCR) med specifikke primere (0,2 uM), dNTP’er (0,2 mM), MgCl2 (1,5 mM); GoTaq DNA-polymerase (0,75 U) i 1x PCR-buffer (Promega, Madison, WI, USA). PCR-produkter blev oprenset ved behandling med 5 U exonuclease-I (Exo-1) og 2 U af Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) sammen med 1x puffer ved 37 oC i 2-3 timer efterfulgt af varme-inaktivering af enzymer ved 85 oC i 20 minutter. Efter Exo-SAP behandling blev PCR-produkter fortyndet til 15 ng /pl koncentration. PCR-produkt specificitet, mængde og kvalitet blev analyseret ved 1,2% agarosegelelektroforese. Tovejs sekventering af PCR-produkterne blev udført på Genomisk core facilitet (RPCI, Buffalo) ved hjælp af ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA). Data blev analyseret ved hjælp af sekvens analyse software og verificeret ved visuel undersøgelse af de identificerede varianter i elektroferogram.

allelspecifik Genotypning af C1744T Mutation i tumorprøver

Vi udviklede en allel-specifik PCR-baserede genotypebestemmelse metode til at evaluere den ikke-synonyme mutation identificeret ved direkte sekventering af

GRM1

genet ved C1744T (582 Pro Ser) position i E006AA cellelinie. Til bidirektional amplifikation af denne specifikke mutation blev fire primere designet (tabel S1, Primer numrene 19 til 22), to ydre primere og to allel-specifikke (AS) indre primere med deres 3’ende specificitet til hver allel (C T). C-allelen er amplificeret i én retning med en AS indre primer og en ydre primerpar (# 19 og # 20; amplikonstørrelse 439 bp), hvorimod mutant t-allel forstærkes i den modsatte retning med den anden indre og ydre primerpar (# 21 og # 22; amplikonstørrelse 297 bp). De to ydre primere også amplificere en konstant fragment (# 20 og # 22; amplikonstørrelse 736 bp), der tjener som positive kontroller til PCR. Alle fire primere blev anvendt i enkelt reaktion og PCR-betingelser blev optimeret ved justering af koncentrationen af ​​hver primer og udglødningstemperaturer (tabel S1). I hvert sæt af PCR-reaktion, vi inkluderet en positiv og en negativ kontrolprøve at observere effektiviteten af ​​AS-genotypebestemmelse.

Bioinformatik Analyse af Identificerer Novel

GRM1

Mutationer

Nye mutationer identificeret i

GRM1

gen blev testet bioinformatically for forskellige mulige virkninger på proteinstruktur, funktion og splejsningssite variant. Effekten af ​​missense mutation (serin til prolin) på 582 aa holdning blev testet ved hjælp af online-værktøjer; (I) PolyPhen2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) [19], (ii) Sigt (https://sift.jcvi.org/) [20], og (iii) PhD SNP (https://gpcr2.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/PhD-SNP/PhD-SNP.cgi) [21].

for at forudsige den potentielle strukturelle konsekvens af den identificerede mutation ved exon -intron kryds af exon-8 i

GRM1

gen, vi brugte to forskellige online bioinformatiske værktøjer: (a) human splejsning finderen (https://www.umd.be/HSF/) [22] og ( b) ESEfinder (https://rulai.cshl.edu/tools/ESE/) [23]. DNA-sekvens omfattende vildtype eller mutant allel blev anvendt som en forespørgsel i Human Splice Finder værktøj til at forudsige splejsning donor eller acceptor site.

Resultater

Identifikation af Novel

GRM1

mutationer og SNP’er i prostata cancer cellelinjer

Sekventering af hele exons af

GRM1

gen i 10 PCA-cellelinjer viste 18 genetiske ændringer, der omfatter nyligt identificerede ikke-synonyme mutationer splejse-site variationer, ikke-synonyme synonym, og ikke-kodende polymorfier (figur 1 og 2; tabel 1-2). En ny ikke-synonym mutation ved C1744T (582 Pro Ser) position i exon-8 blev detekteret i E006AA, en primær AA-PCa cellelinje (figur 1). Denne mutation blev optrådt i heterozygot status (CC CT) og beliggende tæt på transmembrandomæne på ekstra cellulær side af GRM1 receptor og resulterede i prolin (hydrofil aminosyre, codon-CCT) til serin (neutral aminosyre, codon-TCT) amino syre ændring (figur 2). Anden roman mutation blev identificeret ved exon-intron junction af exon-8 i C4-2B, en kastrat-resistent PCa cellelinje (figur 1, tabel 1). Denne mutation resulterede i G til T omdannelse ved starten af ​​intron-8 og optrådte i heterozygot tilstand. Fem ikke-kodende mutationer blev også fundet i 3′-UTR-regionen i exon-9

GRM1

genet i to forskellige PCA cellelinjer (LAPC4 og MDA-PCa2b) (tabel 2). En af disse mutationer er placeret på 2149 bp nedstrøms for stopkodonen i LAPC4 og rapporteres i NCBI database (dbSNP bygge 139) som rs41285865. Mens fire andre mutationer placeret på 221 bp, 486 bp, 2664 bp og 2737 bp nedstrøms for stopkodonet i MDA-PCa2b cellelinje (tabel 2). Disse mutationer er rapporteret i NCBI database (dbSNP bygge 139) som rs362827, rs6918099, rs79394543 og rs362829 hhv. |

Ud over disse mutationer, en missense SNP (rs6923492 ) blev identificeret ved 993 aminosyreposition i celle undersøgte linier. Homozygot TT genotypen blev observeret i PC-3, 22RV1, CWR-R1-cellelinjer, og NL-Pr.EC. Heterozygot TC genotype blev opdaget i MDA-PCa2b og VCap cellelinier og homozygot CC genotype i E006AA, DU-145, LAPC4, C4-2B, LNCaP-cellelinjer. I dette locus, ændring af T til C nukleotid resulterede i serin (TCC) til prolin (CCC) konvertering. Denne missense polymorfi ligger i cytoplasmatiske domæne af GRM1 receptor mellem transmembrandomæne og coiled-coil-motivet (figur 2). Fire tidligere rapporterede synonyme polymorfier blev også identificeret i kodende sekvens af exon-9 ved 931 (rs2942), 1056 (rs6923864), 1071 (rs1047006) og 1165 aminosyrer (rs9373491) positioner (tabel 1). Seks ikke-kodende SNP’er blev fundet i 3′-UTR af

GRM1

genet og disse polymorfier er placeret på 637 bp (rs362819), 1277 bp (rs3804294), 1278 bp (rs3804293), 1369 bp (rs362820) , 2392 bp (rs362821) og 2616 bp (rs362822) nedstrøms at stoppe codon (tabel 2).

Identifikation af

GRM1

Mutationer og SNPs i prostatakræft Væv

Sekventering af udvalgte exons-8 og -9 af

GRM1

gen i prostata tumorvæv viste flere genetiske ændringer. En homozygot genotype status (CC genotype) sammenlignet med heterozygot genotype (CT genotype) i det tilstødende normale væv ved 637 bp nedstrøms (rs362819) til stopkodon blev fundet i en AA tumor (N38-T38 prøver, tabel 3). Endnu to genotyper (CC og GA) blev fundet i 3′-UTR region kun AA prøver ved position 221 bp (rs362827; N2-T2) og 486 bp (rs6918099; N6-T6, N32-T32 og N38-T38) nedstrøms at stopkodon. Men disse ændringer var af germlinie oprindelse,. Da den heterozygote genotype (GA rs6918099) ved 486 bp nedstrøms til stopkodon blev fundet i 3 ud af 11 ÅS, synes det at være en etnisk-specifik genotype. Den homozygot CC genotype (rs362827), som kun findes i et enkelt AA-patient kan være en sporadisk kønsceller mutation eller en sjælden variant.

Svarende til cellelinje sekventering data, vi identificeret en missense polymorfi ( rs6923492) ved 993 aminosyreposition førende serin til prolin aminosyreændring og blev observeret i 7 ud af 10 atomabsorptionsspektrometri (N2-T2, N26-T26, N27-T27, N32-T32, T62, T25, T11) og 5 ud af 11 CA’er (N3-T3, N5-T5, N21-T21, T20, T34) væv (tabel 3). En ikke-kodende SNP (rs362819) blev fundet hos 637 bp nedstrøms for stopkodonen. Genotypen status for disse SNP’er i tumorvæv var samme til tilstødende normale væv, hvilket indikerer kimcelletransformanter polymorfier (tabel 3). To synonyme polymorfier blev også fundet i exon-9 i både Aas og CA’er populationer. Disse blev placeret på 931 aminosyreposition (rs2942) og kode for lysinrest, mens en anden synonym polymorfisme placeret på 1056 aminosyreposition (rs6923864) kode for glycinrest.

Brug allel-specifikke (AS) PCR-primere og direkte sekventering i matchede tumor-normal væv, vi genotypebestemmes de nyligt identificerede ikke-synonym mutation på C1744T (582 Pro Ser) position (i E006AA) og mutation i exon-intron krydset af exon-8 (i C4-2B) . Disse mutationer blev ikke påvist i nogen af ​​de maligne prostata væv (figur 3).

Tilstedeværelse af C-allel viste amplifikation af et 439 bp fragment og forekomsten af ​​T-allelen viste amplifikation af et 267 bp fragment. En uspecifik fragment af 706 bp blev opformeret i alle prøver.

Forventede funktioner Identificerede

GRM1

mutationer

Forudsigelsen af ​​funktionelle rolle af ny ikke-synonym (582 Pro Ser) mutation er identificeret i

GRM1

blev udført ved hjælp af forskellige værktøjer. PolyPhen-2 forudsagte en skadelig Bayes posterior sandsynlighed pointværdi 0,60 for denne mutation. Denne forudsigelse score er baseret på tilpasning multipel sekvens med homolog sekvens af dette gen i databasen og viser, at mutationen påvirker protein stabilitet eller dets funktion.

Uafhængigt analyseret, Sortering Intolerant Fra Tolerant (finkæmme) algoritme også forudsagt en intolerance pointværdi 0,02 for aminosyresubstitution identificeret i dette locus. Baseret på protein sekvenskonservering hele evolution, forudsagde SIFT at 582 Pro Ser aminosyresubstitution kan også påvirke proteinfunktion. Endvidere har vi brugt PhD-SNP metode, der udnytter tilgængelig sygdomsrelaterede SNP database og machine learning teknik til at forudsige nsSNP relateret til human sygdom. Denne analyse viste sygdom-relevant af 582 Pro Ser mutation med en pålidelighed indeksværdi på 3.

Da punktmutationer ved exon-intron eller intron-exon junction kan føre til exon glider eller alternativ splejsning, var vi interesseret i at analysere den potentielle virkning af romanen mutation opdaget ved exon-intron krydset af exon 8 i C4-2B cellelinje. Til dette har vi ansat Human Splejsning Finder (HSF) og Exon Splejsning Enhancer (ESE) søg værktøjer til at forudsige konsekvensen på splejsningsstedet motiv med to forskellige alleler af identificerede mutation [22], [23]. Vi fandt, at tilstedeværelsen af ​​T-allelen stærkt forudsiger muligheden for splejsningsdonor motiv (caaGtgagt) med en høj konsensus værdi på 88,26. Men substitution af T- til G-allelen resulterede i tabet af denne splejsningsdonor motiv (figur 4A og 4B). Ligeledes forudsagde ESEfinder en høj score (9,49) motiv (exon-splejsning forstærker) for sekvens med G-allelen i exon 8-intron krydset af

GRM1

gen. Men denne score reduceret til -7,52 for motiv sekvens med mutant t-allel.

Twenty én basepar sekvens flankerende af mutation site med vildtype (A) og mutante allel (B) blev testet for forudsigelse af splejsning websted motiv (donor eller acceptor).

Discussion

GRM1 signalering har været impliceret i flere maligne cancere herunder colon adenocarcinom, melanom, lungecarcinom, thyroid carcinoma, brystkarcinom, astrocytom, neuroblastom og rabdomyosarcoma [4], [5], [24]. Glutamatreceptor opnået en særlig interesse i betragtning af dets transformerende potentiale og tilgængeligheden af ​​dets ligand, glutamat, i forbindelse med tumormikromiljøet og let tilgængelighed af receptor på overfladen af ​​tumorceller. Differentiel ekspression, kan aktivering status eller signal omprogrammering af glutamat-receptor i tumorcellerne bidrage til cancerudvikling og progression. Disse ændringer kan opstå fra specifikke ændringer, herunder somatiske og germlinie genetiske ændringer, kopiere nummer variation, epigenetiske og post-translationelle ændringer resulterer i ændret ekspression eller aktivering og dermed øge tumor progression og metastase [25].

Deep sekventering undersøgelser har vist, at G-protein-koblet receptor (GPCR) er muterede i ca. 20% af al kræft og glutamat-receptorfamilien repræsenterer en næsthyppigst muterede GPCR’er familiemedlem [26]. Somatiske mutationer i

GRM1

er blevet rapporteret i bred sorter af tumorer, såsom melanomer, bryst- carcinom, coloncarcinom, lunge adenocarcinom, hjernetumorer, heamatopoitic, og lymfevæv [15].

GRM1

genet omfatter forskellige domæner med specifikke funktioner, herunder ligandbindende domæne, cystein-rige domæne for dimerisering, transmembrane, og C-terminale domæne for interaktion med nedstrøms signaleringsmolekyler. Mutationer i disse konserverede rester kan spille en mulig rolle i binding af GRM1 receptoren med ligand, signalering indledning, transmission af signalet, eller opsigelse eller gevinst på funktion fænotyper. Disse mutationer kan ikke blot involvere i tumorudvikling og fremadskriden men også påvirke metastase herunder cellemotilitet og fremme af angiogenese.

Tidligere undersøgelser har vist, at mutationer i forskellige G-protein-koblet receptor, CCK2R og GRM1 er associeret med ændret receptor-funktion, nedstrøms signalveje, ændrede cellulære morfologi, migration og fremme angiogenese, hvilket fører til øget tumerogenesis [15], [27]. Esseltine

et al

studerede funktionelle rolle af

GRM1

mutationer placeret ved glutamat-bonding websted (A168V), glutamat-bindende domæne (R375G), cystein-rige region (G396V), G- proteinbinding region (R696W), og homer bindingsregion (P1148L) i den carboxyterminale hale GRM1 receptor [15]. Transient ekspression af det muterede

GRM1

var forbundet med enten reduceret celleoverfladeekspression eller basal /quisqualat-stimuleret aktivering af inositolphosphat (IP) og /eller ERK1 /2-aktivering [15]. Mutation i homer-bindende region (P1148L) blev vist sig at ændre cellulær morfologi og kan påvirke cellulære migration.

Selvom flere mutationer er blevet rapporteret i

GRM1

gen i forskellige menneskelige kræftformer [4], kun et begrænset antal af high-throughput undersøgelser, herunder hele exome sekventering eller transkriptom analyse blev udført og identificerede nogle

GRM1

mutationer i PCA prøver [28], [29]. To nye mutationer (R868H og G144S) i

GRM1

(tabel S2) blev identificeret ved sekventering af exomes af 50 dødelige catrate-resistente PCa, 11 high-grade primære orgel-confind PCA prøver (behandling naive) og 11 PCA cellelinjer [29]. Exome sekventering af 112 prostata tumor /normal par identificeret to missense mutationer (A573E og R681H) i

GRM1

gen [28]. En nonsense mutation blev også rapporteret i exon-2 i

GRM1

gen. (TCGA: https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)

Exome eller transkriptom sekvens analyse har deres iboende begrænsninger, herunder den manglende evne til at påvise mutationer i exon-intron junctions eller ikke-kodende region og behovet for yderligere eksperimentel validering af de identificerede mutationer [28]. Endvidere har disse undersøgelser ikke de AA-tumor prøver eller deres cellelinjer. På grund af disse begrænsninger, screenede vi for første gang, at hele exon region

GRM1

gen der indbefatter flankerende 5′- og 3′-UTR’er og exon-intron junctions i ti almindeligt anvendte PCA cellelinjer, herunder den to etablerede AA-PCA cellelinjer (E006AA og MDA-PCa2B), og 21 matchede prostata tumor-normal væv fra 11 CA’er og 10 AA’ere patienter.

i denne undersøgelse identificerede vi to nye mutationer i E006AA og C4 2b cellelinier. Disse mutationer blev ikke identificeret i tidligere studier baseret på deres undersøgelse design eller cellelinierne inkluderet for sekventering [29]. Ikke-synonym mutation (C til T) ved 582 aminosyreposition resulterede i prolin til serin forandring. Denne mutation er beliggende nær transmembrandomæne på ekstracellulære side. Bioinformatik forudsigelse af funktionelle rolle af denne mutation, ved hjælp af flere analytiske værktøjer, viste omdannelsen af ​​hydrofile (serin) til neutral (prolin) aminosyre er enten intolerant eller fører til skadelig virkning på proteinstabilitet og funktion. En konvertering fra serin til prolin aminosyre kan også påvirke styrken af ​​signaltransmission efter ligandbinding og GRM1 receptor aktivering. En anden mutation er identificeret i exon-intron grænse

GRM1

exon-8 i C4-2B cellelinje.

Bioinformatik analyse ved hjælp af to forskellige online værktøjer forudsagt, at G til T nukleotid konvertering på denne position resulterede i afbrydelse af splejsningsdonorstedet. Afbrydelse af splejsning-site motiv ved exon-intron krydset ved exon-8 position kan danne grundlag for at skabe forskellige splejsningsvarianter i

GRM1

gen. Forskellige isoformer af

GRM1

gen med forskellige protein længde er forbundet med differentiale aktivering af downstream signaler enten via ændringer i signalstyrken eller interaktion med andre cytosoliske proteiner [30]. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at validere den funktionelle rolle af nye mutationer af

GRM1

gen identificeret i denne undersøgelse, og dem, som andre forskere [28], [29]. Fire yderligere mutationer blev identificeret i MDA-PCa2b og én mutation i LAPC4 cellelinie placeret i 3′-UTR af

GRM1

genet og disse mutationer er blevet rapporteret i NCBI database (dbSNP Build 39) i forskellige populationer. Disse mutationer forekom som germline ændringer i tumorprøver undersøgt, og vi observeret, at hyppigheden af ​​disse mutationer er høj i AA tumorprøver sammenlignet til CAS. Høj frekvens af disse mutationer observeres i AA prøver kan associere med differential

GRM1

ekspression og funktion, hvilket kan resultere i progressionen eller flere af sygdommens sværhedsgrad. AA befolkning har vist en høj forekomst og dødelighed og præsenterer en klinisk mere aggressiv sygdom end CA’er. Den funktionelle rolle af disse mutationer er ikke blevet rapporteret i litteraturen [31]

En missense polymorfi (rs6923492 T C). Identificeret i exon-9 af

GRM1

gen i PCA-cellelinjer og tumorer medført serin til forandring prolin i 993 aminosyreposition ved cytoplasmisk ende af receptoren. Forrige undersøgelse med 1000 brystkræftpatienter viste sammenslutning af denne SNP i ER + /PR + duktalt carcinoma in TT-genotype luftfartsselskab med senere alder ved diagnose (4,9 år) sammenlignet med enten TC og CC-genotypen luftfartsselskaber [32]. Imidlertid blev ingen sammenhæng fundet med melanom modtagelighed [33]. En større tumorprøver undersøgelse er nødvendig for at bekræfte foreningen af ​​denne SNP med modtagelighed for prostata carcinogenese, aggressivitet og progression.

Konklusioner

I denne undersøgelse identificerede vi nye mutationer i

GRM1

gen udover tidligere rapporterede mutationer og SNP’er i PCA-cellelinjer og også i en delmængde af maligne prostata væv. Disse hidtil ukendte mutationer blev forudsagt at spille en vigtig rolle i genfunktion herunder proteinstabilitet og splejsning af forskellige isoformer. Funktionel validering af disse mutationer vil yderligere styrke den rolle, genetiske ændringer af

GRM1

gen i prostata carcinogenese og progression.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Detaljer af primere, der anvendes til sekventering af

GRM1

gen. Genomiske sekvenser af primere, der anvendes til PCR og sekventering i overensstemmelse med Human Genome Assembly (

GRM1

gen tiltrædelse # NM_000838.3)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103204.s001

(DOC )

tabel S2.

Detaljer af somatiske mutationer i

GRM1

gen identificeret i hele exome eller transkriptom sekventering studier af prostatakræft-cellelinier og tumorer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103204.s002

( DOC)