PLoS ONE: A Novel triterpenoid Isoleret fra Root Bark af Ailanthus excelsa Roxb (Tree of Heaven), AECHL-1 som en potentiel anticancermiddel

Abstrakt

Baggrund

Vi rapporterer her isolering og karakterisering af et nyt stof Ailanthus excelsa chloroform ekstrakt-1 (AECHL-1) (C

29H

36o

10; molekylvægt 543,8) fra roden bark af

Ailanthus excelsa

Roxb. Stoffet har anti-cancer aktivitet mod en bred vifte af kræft cellelinjer af forskellig oprindelse.

vigtigste resultater

AECHL-1 behandling i 12 til 48 timer hæmmede celledeling og induceret død i B16F10, MDA-MB-231, MCF-7, og PC3-celler med minimal vækstinhibering i normal HEK 293. antitumorvirkningen af ​​AECHL-1 var sammenlignelig med den for den konventionelle antitumorlægemidler paclitaxel og cisplatin. AECHL-1-induceret vækstinhibering var forbundet med S /G

2-M anholdelser i MDA-MB-231, MCF-7, og PC3-celler og en G

1 standsning i B16F10 celler. Vi observerede mikrotubulus forstyrrelser i MCF-7 celler behandlet med AECHL-1 in vitro. Sammenlignet med kontrol, subkutan injektion af AECHL-1 til stederne for tumor af muse-melanom B16F10 implanteret i C57BL /6-mus og human brystcancer MCF-7-celler i athymiske nøgne mus resulterede i signifikant fald i tumorvolumen. I B16F10 tumorer, AECHL-1 ved 50 ug /mus /dag dosis i 15 dage resulterede i forøget ekspression af tumorsuppressorproteiner P53 /P21, reduktion i ekspressionen af ​​onkogenet c-myc, og nedregulering af cyclin D1 og CDK4. Derudover AECHL-1-behandling resulterede i phosphorylering af p53 i serin 15 i B16F10 tumorer, som synes at udvise p53-afhængig vækstinhiberende responser.

Konklusioner Salg

De foreliggende data viser aktiviteten af et triterpenoid AECHL-1, som besidder et bredt spektrum af aktivitet mod cancerceller. Vi foreslår her, at AECHL-1 er en futuristisk anti-cancer lægemiddel, hvis terapeutiske potentiale skal bredt udforsket til kemoterapi mod kræft

Henvisning:. Lavhale MS, Kumar S, Mishra SH, Sitasawad SL (2009) A Novel triterpenoid isoleret fra Root Bark af

Ailanthus excelsa

Roxb (Tree of Heaven), AECHL-1 som en potentiel anticancermiddel. PLoS ONE 4 (4): e5365. doi: 10,1371 /journal.pone.0005365

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Cleveland Clinic, USA

Modtaget: Februar 3, 2009; Accepteret: 11. marts 2009; Udgivet: 28 April, 2009

Copyright: © 2009 Lavhale et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning var støtte fra Institut for Bioteknologi, Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Indiens regering, New Delhi. Santosh Kumar modtaget en forskningsbevilling stipendium fra det indiske råd for medicinsk forskning og Manish Lavhale fra University Grants Kommissionen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ifølge World Health Organization baseret på sygelighed, dødelighed, økonomisk byrde, og følelsesmæssige trængsler, kræft kan betragtes som den mest byrdefulde sundhedsproblem plager mennesker verden over [1]. I øjeblikket er mere end 22,4 mio mennesker i verden lider af kræft. Ca. 10,1 mio nye tilfælde er diagnosticeret med kræft om året, og mere end 6,2 mio dør af sygdommen i 2000 [2]. Det er en stigning på omkring 19% i forekomsten og 18% i dødeligheden siden 1990. Et vigtigt mål for kræft forskning er at finde terapeutiske forbindelser med høj specificitet for kræftceller /tumor og færre bivirkninger end de for tiden anvendte cytostatiske /cytotoksiske midler.

Talrige planteafledte forbindelser anvendt i cancer kemoterapi indbefatter vinblastin, vincristin, camptothecinderivater, etoposid afledt epipodophyllotoxin, og paclitaxel (Taxol @) [3]. Men de fleste af disse forbindelser udviser celle toksicitet og kan fremkalde genotoksisk, kræftfremkaldende og teratogene virkninger i ikke-tumorceller, og nogle af dem mislykkedes i tidligere kliniske undersøgelser [4], [5]. En anden mest udbredte metal-baseret lægemiddel for øjeblikket mod udvalgte cancertyper er cisplatin [6], men anvendelsen af ​​cisplatin i kurativ terapi var forbundet med alvorlige kliniske problemer, såsom alvorlig normalt væv toksicitet og resistens mod behandlingen [7] . Disse bivirkninger begrænser deres anvendelse som kemoterapeutiske midler på trods af deres høje effektivitet ved behandling af target maligne celler. Følgelig nye behandlingsformer og behandlingsstrategier for denne sygdom er nødvendige til behandling af patienter med denne sygdom. Derfor er søgningen efter alternative lægemidler, som er både effektive til behandling af cancere såvel som ikke-toksiske for normale væv er en vigtig forskning line [8].

Terpenoider anvendes i udstrakt grad til deres aromatiske egenskaber. De spiller en rolle i traditionelle naturlægemidler og er under efterforskning for antibakterielle, antineoplastisk, og andre farmaceutiske funktioner. Naturlige triterpenoids, såsom oleanolsyre og ursolsyre, er forbindelser med anti-tumorigene og anti-inflammatoriske egenskaber [9]. Syntetiske triterpenoid derivater, såsom 2-cyano-3, 13 dioxooleana-1,9 (11) -dien-28-syre (CDDO) [10] og dets derivat 1- [2-cyano-3-, 12-dioxooleana- 1,9 (11) -dien-28-oyl] imidazol (CDDO-Im) [11] har også anti-tumor aktivitet. Root bark af

Ailanthus excelsa

Roxb (Tree of Heaven), et træ, der tilhører familien

Simaroubaceae

er meget udbredt i Ayurveda som det fremgår af fytoterapi [12]. Andre arter fra denne familie er kendt for deres anti-cancer aktiviteter [13]. Kemiske bestanddele af

A. excelsa

omfatte nogle triterpener og alkaloider [14]. I den foreliggende undersøgelse har vi vurderet

in vitro

in vivo

anticanceraktivitet af et hidtil ukendt triterpenoid, AECHL-1 isoleret fra roden bark af planten og viste sig at være meget effektiv i kræftceller af forskellig afstamning.

Materialer og metoder

Isolering og karakterisering af AECHL-1

roden bark af

A. excelsa

blev botanisk verificeret af professor Shrihari Mishra (en af ​​forfatterne i den nuværende manuskript) og udvinding og fraktionering af lufttørret pulveriserede rod bark blev udført ved hjælp af kloroform. Isolering af AECHL-1 blev udført under anvendelse silicagelsøjlekromatografi og karakteriseret ved ultraviolet (Shimadzu 1700), infrarød (Perkin Elmer Spectrum RX1), kernemagnetisk resonans (Bruker Avance I NMR Spectrometer) og massespektroskopi (ved Jeol SX 102 mass spektrometer). Renheden af ​​AECHL-1 blev vurderet ved HPLC på en RP C-18 Phenomenex søjle under anvendelse af methanol-vand (90:10, volumen for volumen) som den mobile fase. Den oprensede forbindelse, blev AECHL-1 opløst i DMSO som stamopløsninger.

Cellelinjer

Normalt humane embryonale nyre cellelinje (HEK 293), mus melanom B16F10 celler (B16F10), human carcinom (MDA-MB-231), human breast adeno-carcinom (MCF-7) og human prostata (PC3-celler) blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). HEK 293, MCF-7 og B16F10 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium og PC3 i Hams F-12 medium (Gibco) ved 37 ° C under 5% CO

2. MDA-MB-231-celler blev dyrket i Leibovitz L-15 (Gibco) suppleret med 10% FCS (Gibco), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en fugtig atmosfære ved 37 ° C.

cellelevedygtighed assay

Direkte interferens mellem forskellige koncentrationer af AECHL-1 (0-200 uM) og MTT i et cellefrit system, ikke blev observeret, blev derfor MTT-assay anvendt til at teste cellelevedygtighed i det aktuelle system. HEK 293, B16F10, PC3, MCF 7 og MDA-MB-231-celler (4 x 10

3 /brønd) blev dyrket i 96-brønds plader og efter 24 timer behandlet med forskellige koncentrationer af AECHL-1 (0-200 uM), cisplatin (0-100 uM) eller paclitaxel (0-50 pM) i 12, 24 og 48 timer ved 37 ° C. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT (0,5 mg /ml) omdannelse som tidligere beskrevet [15].

Celleproliferationsassay

Proliferation af MCF-7-celler blev bestemt ved måling (

3H ) thymidin. Kort fortalt alikvoter af komplet medium indeholdende 4 × 10

3 celler blev fordelt i 96-brønds vævskulturplader. Efter 24 timer blev mediet erstattet med forskellige koncentrationer af AECHL-1 (0-100 uM), cisplatin (0-100 uM) eller paclitaxel (0-50 pM). Seks timer efter behandlingen 1 uCi /brønd (

3H) thymidin (Board of Radiation og Isotop Technology, Mumbai, Indien) blev tilsat, og kulturerne blev inkuberet yderligere i 42 timer ved 37 ° C. Celler blev skyllet og opsamlet i scintillations blanding, og radioaktivitet inkorporeret i DNA blev bestemt med en væskescintillationstæller (Canberra Packard).

Annexin V-FITC bindingsassay

B16F10, MDA-MB -231 og MCF-7-celler (3 x 10

5 /ml) blev behandlet med forskellige koncentrationer af AECHL-1 (0-40 uM) i 24 timer ved 37 ° C. Celler blev høstet efter 24 timer blev apoptose detekteret ved hjælp Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit (Calbiochem, USA) med flowcytometri (FACS Vantage-BD Sciences, USA). Dataene blev analyseret ved hjælp af Cell Quest software til bestemmelse af procent af apoptotiske celler.

Cell cyklus analyse

B16F10, PC3, MDA-MB-231 og MCF-7 celler (3 x 10

5 /ml) blev behandlet med forskellige koncentrationer af AECHL-1 (0-100 uM) eller paclitaxel (0-10 pM) i 24 timer. Cellecyklusanalyse blev udført som beskrevet tidligere [16], med flowcytometri (FACS Vantage-BD Sciences, USA). Dataene blev analyseret under anvendelse Cell Quest software

Immuncytokemi

MCF-7-celler blev fikseret med 3,7% paraformaldehyd, og derefter inkuberet med anti-a-tubulin antistoffer (1:10000;. Sigma, St. Louis, MO). Efter antistofferne blev vasket af, blev cellerne inkuberet med Alexa-konjugeret sekundære antistoffer (1:200; Sigma, St. Louis, MO). Billeder blev taget med en konfokal laser scanning mikroskop (Zeiss LSM510).

Animal tumormodeller

Male C57BL /6 (6-8 ugers alderen) og kvindelige athymiske nøgne mus, NIH, nu /nu Swiss (10 uger) blev opretholdt i overensstemmelse med de etiske udvalgets procedurer og retningslinjer Central Animal. B16F10 melanom celler blev høstet, suspenderet i PBS og injiceret subkutant i den højre flanke (2 × 10

6 celler /flanke) i C57BL /6-mus og MCF-7-celler (5 x 10

6 celler /flank ) i køer athymiske nøgne mus. Hver athymiske mus blev implanteret subkutant med en 0,72-mg 17-β-østradiol pellets, 2 uger før inokulering af MCF-7-celler [17], [18]. Tumor størrelse blev målt hver 3-4 dage af en caliper og tumor volumen bestemt af længden (

L

) og bredden (

W

):

V

= (

LW

2) /2 [19]. Efter to uger AECHL-1 (50 ug), AECHL-1 (100 ug), cisplatin (100 ug) og PBS som kontrol vehikel blev injiceret subkutant til stedet for tumoren i 15 dage i C57BL /6-mus (n = 6 ) og AECHL-1 (5 ug), AECHL-1 (10 ug), paclitaxel (20 ug) og PBS som kontrol vehikel blev injiceret subkutant til stedet for tumoren per dag i 10 dage i kvindelige athymiske nøgne mus (n = 6 ). Tumorvolumen blev målt med regelmæssige mellemrum under forsøget. Ved slutningen af ​​eksperimentet tumor og andre organer blev dissekeret ud til histologiske analyser og Western blotting.

Immunhistokemi

væv og organer i C57BL /6 og nøgne mus blev fikseret i alkohol formalin i 24 time og indlejret i paraffin som beskrevet tidligere [20]. Vævssnit (5 pm) blev farvet med hæmatoxylin og eosin (H Santa Cruz, CA), monoklonalt muse-anti-CDK4, anti-cyclin D1-antistoffer (1:1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) , monoklonalt muse-anti-c-myc-antistof og monoklonalt muse-anti-p53-antistof (1:1000; Abcam, USA), efterfulgt af HRP-konjugerede passende sekundære antistoffer og visualiseret ved en forøget kemiluminescens (Pierce) detection system. Membraner blev strippet og re-testet med β-actin primært antistof (1:10000, MP Biomedicals, Ohio, USA). Som et protein lastning kontrol

Statistik

De indberettede data for tumor volumen er udtrykt som middelværdi ± SEM. Statistiske forskelle blev bestemt ved ANOVA og post-test anvendt var Tukey-Kramer multipel sammenligning Test

Resultater

Kemi:. Ultraviolet, infrarød, kernemagnetisk resonans, og masse karakterisering af AECHL-1

IR (KBr): 3425, 3419 (hydroxylgruppe), 2972, 2966, 2923, 2873 (alkyl CH strækning), 1733 (δ-lacton), 1718 (Bi acetyl), 1680 (C = O konjugation med alken), 1652 (-C = C strækning), 1600 (aromatisk), 1492 1454, 1394 (methyl strækning), 1222 (δ-lacton), 1184, 1110, 1051, 1031 (acetaler), 1018 nm (alkaner).

1H-NMR (DMSO, 400 Hz) δ: 0,95 (3H,

t

, 4′-CH

3), δ: 1,15 (3H, d, H-24), δ : 1.235 (3H, d, 5′-CH

3), δ: 1,5 (2H, ddd, 5′-CH

2), δ: 1,73 (3H, ddd, H-21), δ: 1,83 (1H, s, H-9), δ: 1,87 (1H, s, H-14), δ: 1,9 (2H, s, H-18), δ: 2,16 (3H, s, H-18), δ: 2,3 (3H, d, H-19) δ: 2,71 (2H, s, H-20), δ: 3,45 (2H, dd, H-23), δ: 3,65 (2H, d, H-22) , δ: 3,95 (1H, t, H-12), δ: 4,05 (2H, s, H-22), δ: 5,30 (1H, s, H-15), δ: 5,46 (1H, s, OH -2), δ: 5,73 (1H, d, OH-2 ‘), δ: 6,89 (1H, s, H-3), δ:. 8,82 (1H, s, OH-11)

hurtigt atombombardement massespektroskopi:

m /z:

1068 grundet lysdæmper formation. Den faktiske (M

+), blev anset for at være 543,8, 463,3 (MC

4H

1O

2), 461,4 (MC

4H

2O

2), 459,4 (MC

4H

4O

2), 361,2 (MC

9H

11o

4) (figur 1B) og Mass Spectra (figur S1). AECHL-1 er et fast stof, smp. 248-250 ° C besad en molekylformel C

29 H

36o

10 som angivet af EI og ES masse spektre. IR-spektret viste tilstedeværelsen af ​​hydroxyl (s) (3425 nm, 3419 nm), δ-lacton (1733 nm), og aromatisk del (1600 nm). UV-spektret gav en karakteristisk maksimal absorption ved 235 nm, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​auxochromic grupper som hydroxyl og keton. Den

1 H-NMR-spektrum af AECHL-1 afslørede tilstedeværelsen af ​​en aromatisk proton δ 6,89 og en singlet ved δ 5,30, som er karakteristisk for esterfunktionen ved C-15. H-22 viste sig som en AB-system som en singlet ved δ 4,05 og dublet ved δ 3,65 og H-12 viste sig som en triplet ved δ 3,95. Methylgruppen H-19 på den aromatiske ring optrådte som singlet ved δ 2.3. En dublet ved δ 1,235 for seks protoner er tildelt ved H-5 ‘. H-4 ‘optrådte som en triplet ved δ 0,95. . Det methylgruppe, H-18 viste sig som en singlet ved δ 2,16 (figur 2)

enkelt top angivet, at præparatet var . 99% ren

Hæmning af cellelevedygtighed, proliferation og apoptose ved AECHL-1

Effekt af AECHL-1 på levedygtighed B16F10, PC3, MDA-MB-231 og MCF-7 celler blev vurderet. AECHL-1 inhiberede cellevækst af MCF-7-celler i en koncentrations- og tidsafhængig måde ved MTT-assay (figur 3A). AECHL-1 inhiberede cellevækst i forskellige cancercellelinier med et minimum vækstinhibering i HEK 293 ved 48 timer (figur 3B). HEK 293 behandlet med 200 pM AECHL-1 udviste høj overlevelse ( 90%) sammenlignet med cancerceller. AECHL-1 viste sig at være mere effektive på MCF-7 i sammenligning med B16F10, PC3 og MDA-MB-231 i celleproliferation inhibering observeret ved (

3H) thymidinoptagelse efter 48 timer (figur 3C). Desuden blev AECHL-1 sig at være mere potent end paclitaxel eller cisplatin i celleproliferation inhibering i MCF-7-celler efter 48 timer (figur 3D).

(A) Cell vækst ved MTT-assay i MCF-7 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af AECHL-1 (10, 20, 40 og 100 uM) i 12, 24 og 48 timer og cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assay; (B) Cellevækst ved MTT-assay i B16F10, PC3, MDA-MB-231 MCF-7 og HEK-293-celler. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af AECHL-1 (10, 20, 40 100 og 200 uM) i 48 timer, og cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assay; (C) celleproliferation med (

3H) thymidin i B16F10, PC3, MDA-MB-231, og MCF-7-celler. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af AECHL-1 (10, 20, 40 og 100 uM) i 48 timer, og celleproliferation blev bestemt ved (

3H) thymidininkorporering; (D) Sammenligning af AECHL-1 med andre kemoterapeutiske lægemidler. MCF-7 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer (5, 10, 20 og 50 uM) af paclitaxel, cisplatin og AECHL-1 i 48 timer, og celleproliferation blev bestemt ved (

3H) thymidin-inkorporering. Data er middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg.

Annexin V-konjugeret FITC og propidiumiodid (PI) farvning blev anvendt til at analysere det samlede indhold af apoptotiske celler fremkaldt af AECHL-1. Investigator at identificere tidlige apoptotiske celler (Annexin V-FITC positive, PI negativ), celler, der er i slutningen af ​​apoptose (Annexin V-FITC og PI positive), de nekrotiske celler (PI positiv kun) og celler, der er levedygtige (Annexin V FITC og PI negativ). Samlede procentdel af apoptotiske celler øges op til 36,25% og 37,18% ved 20 pM i B16F10, MDA-MB-231-celler henholdsvis og 60.66% ved 5 uM i MCF-7-celler (figur 4).

Påvisning af apoptose blev gjort ved Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit ifølge producentens instruktioner og derefter analyseret ved flowcytometri: UR angiver den procentdel af sene apoptotiske celler (Annexin V og PI positive celler), og LR angiver den procentdel af tidlige apoptotiske celler (annexin V positive celler) dataene er præsenteret i dot blots skildrer annexin /fluoresceinisothiocyanat (

x

aksen) vs. PI farvning (

y

akse). Procentdelen af ​​celler i hver kvadrant er vist. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

AECHL-1-induceret cellecyklusstop i cancerceller

For at bestemme fasen af ​​cellecyklus, hvor AECHL-1 udøver sin vækst -inhibitory virkning, eksponentielt voksende B16F10, PC3, MDA-MB-231 og MCF-7 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af AECHL-1 i 24 timer og analyseret ved flowcytometri (tabel 1). Vi observerede, at B16F10 celler behandlet med AECHL-1 viste en stigning i befolkningen i G

1 fase (52,18-72,08%) med en samtidig reduktion i andelen af ​​celler i S-G2 /M fase (47,98-26,16% ), hvilket tyder på en G

1 anholdelse. I modsætning hertil antallet af PC3, MDA-MB-231 og MCF-7-celler i S-G2 /M-fase steg fra 42.91% til 57.62%, 49.40% til 77,16% og 45,13% til 70,97% i respons på behandling med AECHL-1 og et fald i G1-fasen fra 55.65% til 39.02%, 49.54% til 22.82%, 53,67% og 27,85% henholdsvis antyder en vækststandsning i S-G2 /M-fasen i PC3, MDA-MB-231 og MCF- 7-celler. Paclitaxel behandling viste en stigning i populationen af ​​MCF-7 celler in G2 /M-fase (29,30% til 72,55%) med et fald i procentdelen af ​​celler i G1-fasen (48.30% til 4,62%), hvilket antyder en vækststandsning i G2 /M-fasen (tabel 1). Disse resultater antyder, at inhibering af cellecyklusprogression kunne være en af ​​de molekylære begivenheder, der er forbundet med selektiv anti-cancer virkning af AECHL-1 i cancerceller.

Virkning af AECHL-1 på cellulære mikrotubuli

mikrotubulus-farvning i kontrol og celler behandlet med AECHL-1 og paclitaxel, viste, at både AECHL-1 og paclitaxel resulterede i mikrotubulus forstyrrelser med en stigning i tætheden af ​​cellulære mikrotubuli og dannelse af tykke mikrotubulus bundter omgiver kernen i sammenligning til de ubehandlede kontrolceller (figur 5).

MCF-7 celler blev behandlet med køretøjet som en kontrol, AECHL-1 (5 uM) og paclitaxel (5 uM) som en positiv kontrol i 24 timer, og mikrotubuli (rød) blev visualiseret ved indirekte immunofluorescens. DAPI blev anvendt til at farve cellekernerne (blå). Repræsentant for 25-30 celler hver i 3 separate eksperimenter.

Effekt af AECHL-1 på primær tumor volumen i allograft og xenograft

Vi undersøgte også virkningerne af AECHL-1 på in vivo væksten af ​​primære tumorer. Vores foreløbige undersøgelser viste, at af de forskellige doser af AECHL-1 (0,5 til 5 mg /kg) injiceret intraperitonealt i C57BL /6-mus, den maksimalt tolererede dosis var en enkelt dosis på 0,5 mg /kg, som viste ingen tydelige tegn på toksicitet når de observeres i en måned. På dette grundlag den dosis, blev valgt var 50 og 100 ug /kg /dag (en dosis, der var 10-20% af denne maksimale tålte dosis). På dag 18 signifikant stigning i tumorvolumen i kontrolgruppen (p 0,001) og en regression af tumorvolumen var tydelig i mus behandlet med 50 ug AECHL-1 (44,303 ± 5,20% (p 0,001)) og med 100 ug AECHL- 1 (51,014 ± 1,27% (p 0,001)). Tumorer behandlet med 100 ug cisplatin viste en reduktion af tumor volumen (93,13 ± 0,539% (p 0,001)). Imidlertid blev AECHL-1 (50 ug) vs. AECHL-1 (100 ug) sig at være ikke signifikant (p 0,05). På dag 24 kontrol, viste AECHL-1 (50 ug) og AECHL-1 (100 ug) behandlede mus yderligere forøgelse af tumorvolumen (p 0,001), men mus behandlet med cisplatin viste reduktion i tumorvolumen (p 0,001). Men selv om cisplatin viste yderligere reduktion i tumor volumen, skaderne på andre organer var mere end i AECHL-1 (50 100 ug) behandlede gruppe i C57BL /6 mus (figur 6A og 6B)

.

(A) Fotografier af C57BL /6 mus viser 4 uger gamle allograft tumorvækst med B16F10 celler;

nedenfor,

udskårne tumorer med respektive mus; (B) Tumor volumen blev bestemt ved tidsintervaller, som beskrevet i “Materialer og metoder”. Tumorvolumen hos forsøgsdyr efter behandling med 50, 100 ug AECHL-1 og 100 ug cisplatin blev sammenlignet med tumorvolumen kontroldyrene; (C) Fotografier af athymiske nøgne mus viser 4 uger gamle xenograft tumorvækst med MCF-7 celler;

nedenfor,

udskårne tumorer med respektive mus; (D) Tumorvolumen af ​​forsøgsdyr efter behandling med 5, 10 ug AECHL-1 og 20 ug paclitaxel blev sammenlignet med tumorvolumen af ​​kontroldyr. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SE for seks startende dyr i hver gruppe. Væsentlige forskelle mellem

* Intra gruppe ved hvert tidspunkt er repræsenteret som:

ns p 0,05,

* p 0,05,

** P 0,01,

*** P 0.001 og

#Inter gruppe i forskellige doser er repræsenteret som

ns P 0,05,

# 0,05,

## P 0,01,

### P. 0,001

Eftersom de cytotoksiske doser af AECHL-1 for MCF-7 celler in vitro var meget lave, udvalgt til tumorxenografter hos kvindelige athymiske nøgne mus injiceret med MCF-7 celler doser var 5 og 10 ug. Disse doser viste regression i tumor volumen som: 35,72 ± 0,05% til 5 mg (p 0,001) og 28,55 ± 0,06% for 10 ug (p 0,001), mens tumorer behandlet med 20 pg paclitaxel viste en regression i tumor volumen (14,19 ± 0,32% (p 0,05).), hvilket var mindre end AECHL-1 behandlede gruppe (figur 6C og 6D)

Virkninger af AECHL-1 behandling på tumor suppressor og cellecyklus-regulerende proteiner i tumor allograft af C57BL /6-mus

Vi evaluerede effekten af ​​AECHL-1 behandling på ekspressionen af ​​tumor suppressor protein p53, cellecyklussen regulatoriske protein cyclin D og cdk4 og onkogenet c-myc. Som vist i figur 4E, AECHL-1 ved 50 ug /mus /dag indgivet til B16F10-implanterede tumorer i C57BL /6-mus resulterede i en stigning i ekspressionen af ​​vildtype p53-protein og faldt derefter ved en højere koncentration (100 ug /mus /dag). Niveauet af p53 var større i AECHL-1-behandlede gruppe end i den cisplatin-behandlede gruppe, hvilket viser, at antitumor virkning af AECHL-1 var forskellig fra cisplatin. Da fosforylering på Ser-15 rest af p53 er kritisk for p53-afhængig aktivering af cellecyklus regulerende proteiner for G1 anholdelse, vi bestemt phosphorylering status af p53 og cyklin D1 og CDK4. AECHL-1-behandling resulterede i en stigning i phosphorylering af p53 i serin 15 rest i tumorer ved 50 ug /mus /dag med en samtidig stigning i niveauet af p21 og faldt ved 100 ug /mus /dag. Western blot-analyse afslørede, at behandling med 50 og 100 ug /mus /dag AECHL-1 forårsagede en signifikant reduktion i cyklus-regulatoriske proteiner cyclin D1 og CDK4. Behandling med 50 og 100 ug /mus /dag AECHL-1 forårsagede også en signifikant reduktion i onkogenet c-myc hvilket således indikerer, at inhibering af cellecyklussen kan være ansvarlige for antitumorvirkninger af AECHL-1 (figur 7).

tumorvæv lysater blev underkastet SDS-PAGE efterfulgt af Western immunoblotting. Membraner blev probet med anti-p53, pp53, p21, c-myc, cyclin D1, cdk4, og p-actin-antistoffer efterfulgt af peroxidase-konjugeret passende sekundære antistoffer, og visualiseret ved forøget kemiluminescens påvisningssystem. Forsøgene blev gentaget tre gange med lignende resultater, og en repræsentativ blot er vist for hvert protein.

Histologisk analyse af tumorvæv og andre organer i C57BL /6-mus Salg

Histologisk undersøgelse af tumor i C57BL /6 kontrolmus viste veludviklet blodkar, øget neovaskularisering, celledensitet og tilstedeværelsen af ​​blødende områder med sandsynlige tegn på angiogenese med øget mulighed for metastaser (figur 8.1a). Behandling af tumorer med 50 ug AECHL-1 viste ikke megen indflydelse på tumorvaskularisering men viste mindre forekomst af blødende områder, fald i tumor celletæthed og forekomsten af ​​picnotic /nekrotisk celler i centrum af tumoren (figur 8.1b). Behandling med 100 ug AECHL-1 viste stigning i nekrotiske celler, forsvinden af ​​neovaskularisering, blødende områder og lav celledensitet sammenlignet med kontrol (figur 8.1c), hvilket viser, at AECHL-1 forhindrede progression af angiogenese og risikoen for metastase ved at blokere neovaskularisering . Cisplatin behandlede gruppe viste signifikant stigning i nekrotiske celler, fald i tumor celle tæthed og volumen (figur 8.1D)

(1) Repræsentant H . E-farvede sektioner fra B16F10 allotransplantat tumorer og de særlige kendetegn ved disse tumorer var analyseres (1A-1D). Morfologiske karakteristika for hjerte (1E-1H), nyre (1i-1L), lever (1M-1P) og milt (1.-1T) blev seks mus anvendt i hvert sæt eksperimenter. (2) repræsentant H & E-farvede snit fra MCF-7-xenotransplantattumorer samt egenskaber for disse tumorer blev analyseret (2A-2D). Morfologiske karakteristika for hjerte (2E-2H), nyre (2I-2L) og lever (2M-2P), milt (2Q-2T), tre mus blev anvendt i hvert sæt forsøg.

Sammenlignet med kontrol, hjertet væv af mus behandlet med 50 ug AECHL-1 viste normale struktur, mens 100 mg viste omfattende myokardiale fiber nekrose og sammentrækning bands. Opsplitningen og udtværing af muskelfibre karakteristiske for koagulerede nekrose blev set (figur 8.1E-8,1 g). Cisplatin behandlede mus viste også nekrose af myokardie fiber, let lymfatisk infiltration og også fragmentering og udtværing af muskelfibrene (figur 8.1H).

I forhold til kontrol, nyrerne af mus behandlet med 50 ug AECHL-1 viste svag rørformet vakuolisering og tubulær dilatation med blødende områder med normale glomeruli opstår i den nederste del. Behandling med 100 ug AECHL-1 viste rørformede vakuolisering, rørformet dilatation, hæmoragisk tilstand og spredte kroniske inflammatoriske celle infiltrater (Figur 8.1I-8.1K). Cisplatin behandlede mus udviste spredte lymfocytter i og rundt om karret. Mange neutrofiler blev også set i tubuli og interstitium dvs. pyelonefritis (Figur 8.1L).

I forhold til kontrol, leveren af ​​mus behandlet med 50 ug AECHL-1 påvirkede ikke den normale arkitekt. Mus behandlet med 100 ug AECHL-1 bevarede den normale arkitekt af leveren (figur 8,1 mio-8.1O). I cisplatin-behandlede mus var imidlertid omfattende nekrose af hepatocytter set. Pilen til højre viser døde hepatocytter og dette mønster kan ses med en bred vifte af hepatotoxins, hvor omdrejningspunktet hepatocytter nekrose med lymfatisk infiltration forekommer. I disse væv, læsioner ligner den for Tyzzer sygdom karakteriseret ved nekrose med varierende grader af inflammation som reaktion på nekrose. Akutte hepatiske læsioner består af nekrotisk foci omgivet af minimal, primært neutrofile, inflammation (figur 8.1P).

Repræsentative milt sektioner fra Kontrol og mus behandlet med 50 ug AECHL-1 viste normal milt arkitekt og mus behandlet med 50 pg AECHL-1. Kontrol og mus behandlet med 100 ug AECHL-1 og cisplatin hyperplasi af den hvide pulp, især i den marginale zone (Ψ). Histologi viste øget antal granulocytter i de marginale zoner (Figur 8.1Q-8.1T).

Histologisk undersøgelse af tumorvæv og andre organer i nøgne mus

Tumorer fra kontrol mus viste udtalt neovaskularisering hele afsnittet omgivet af meget tætte celler og fravær af nekrotiske celler (figur 8.2A). AECHL-1 ved 5 ug dosering viser nedsat tumorcelle densitet og mangler i hele tumoren området. Den viste også tab af neovasulization og fravær af blødende områder (figur 8.2B). AECHL-1 ved 10 ug viste mange tomme rum, forekomst af blødende områder blev set, men reduktion i vasculization blev ikke set (figur 8.2C). Behandling med Paclitaxel sænkede tumoren celledensitet med forekomst af mange tomme rum og nekrotiske områder i afsnit (figur 8.2D).

Behandling med 5 ug AECHL-1 viste ikke nogen ændring i den normale myocardium, mens 10 ug AECHL-1 og Paclitaxel viste nekrose af myokardie fiber. Paclitaxel viste omfattende myokardie fiber nekrose med fragmentering og udtværing af myokardiet (figur 8.2E-H). Ingen signifikant ændring blev observeret i nyre struktur fra AECHL-1 behandlede grupper, mens paclitaxel behandling viste tegn på rørformede vakuolisering dilatation med blødende områder (Figur 8.2I-8.1L). Både AECHL-1 og paclitaxel viste ikke nogen ændring i den normale arkitektur leveren (figur 8,2 mio-8.2P) og milt sektioner (Figur 8.2Q-8.2T).

Diskussion