PLoS ONE: En syntetisk aptamer-Drug Addukt for Målrettet leverkræft Therapy

Abstrakt

AS1411 (tidligere kendt som AGRO100) er en 26 nukleotid guanin-rige DNA aptamer som danner en guanin quadruplex struktur. AS1411 har vist lovende nytte som en behandling for kræft i fase I og kliniske fase II-forsøg uden at forårsage store bivirkninger. AS1411 inhiberer tumorcellevækst ved binding til nucleolin der udtrykkes afvigende på cellemembranen af ​​mange tumorer. I denne undersøgelse, vi udnyttet en simpel teknik til at konjugere en udbredt kemoterapeutiske middel, doxorubicin (Dox), til AS1411 at danne en syntetisk Drug-DNA-addukt (DDA), betegnes som AS1411-Dox. Vi demonstrerer anvendeligheden af ​​AS1411-Dox i behandlingen af ​​hepatocellulært carcinom (HCC) ved at evaluere den målrettede levering af Dox til Huh7 celler

in vitro

og i en murin xenograft model af HCC.

Henvisning: Trinh TL, Zhu G, Xiao X, Puszyk W, Sefah K, Wu Q, et al. (2015) En syntetisk aptamer-Drug Addukt for målrettet leverkræft Therapy. PLoS ONE 10 (11): e0136673. doi: 10,1371 /journal.pone.0136673

Redaktør: Ratna B. Ray, SAINT LOUIS UNIVERSITET, UNITED STATES

Modtaget: Marts 12, 2015; Accepteret: August 6, 2015; Udgivet: November 2, 2015

Copyright: © 2015 Trinh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. forfatterne takker National Institute of Heath for tildeling af midler til projektet R01 CA133086 til (CL) og (WT). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

til dato den eneste helbredende behandlinger for leverkræft er levertransplantation eller tumor resektion. Ofte leverkræft opdages ved sent tidspunkt, og der er i øjeblikket få kemoterapeutiske behandlinger til rådighed. Sorafenib og doxorubicin er lægemidler, der danner grundlag for systemisk kemoterapi behandlinger anvendes til behandling af leverkræft. Men disse behandlinger er palliative og kun forsinkelse tumorudvikling og progression. Disse målrettede behandlinger af leverkræft er ikke meget vellykket, og kan forårsage iatrogen sygdom på grund af off-target bivirkninger. Derfor behandlingsmetoder, der specifikt retter sig mod tumorvæv er meget ønskeligt. Målrettet terapi opnår selektiv afgivelse af terapeutika medieret af genkendelseselementer som kan binde med høj affinitet til overudtrykte receptorer på mål-cancerceller [1]. Mulige elementer anerkendelse omfatter; antistoffer [2], vitaminer [3,4], og især aptamerer [5]. Nucleinsyre-aptamerer er enkeltstrengede (ss) oligonukleotider med unikke intramolekylære konformationer med evnen til at genkende specifikke molekylære mål. Oligonukleotid aptamerer normalt isoleres gennem systematisk Evolution af ligander ved eksponentiel Berigelse (SELEX) [6,7]. Cancer cellespecifikke aptamerer kan isoleres direkte ved anvendelse af levende cancerceller, under anvendelse Cell-SELEX [8]. Aptamerer holde mange fordele i forhold til andre elementer anerkendelse [9]. SELEX er typisk mere effektiv og omkostningseffektiv end antistofudvikling. Advantagous træk ved oligonucleotid-aptamerer omfatter; lethed af automatiseret syntese, nem ændring af funktionelle dele, høj stabilitet, lang holdbarhed, lav immunogenicitet, og den lethed af modgift udvikling ved antisense DNA-syntese [10,11]. Disse fordele gør aptamerer en attraktiv tilgang til biomedicinske eller kliniske anvendelser, herunder målrettet terapi.

De konjugater af narkotika og elementer anerkendelse (f.eks antibody-drug konjugater) er blevet intensivt studeret af førende farmaceutiske virksomheder for at opnå målrettet terapi [2,12]. Aptamerer, på grund af deres iboende fordele, forventes at spille en vigtig rolle i målrettet levering af terapeutiske midler i fremtiden. Den lette stedspecifikke kemisk modifikation af aptamerer høj grad letter konjugering med narkotika, herunder kemoterapeutika og fotosensibiliserende, eller med nanomaterialer, såsom kulstofnanorør eller guld nanopartikler [13,14]. Desuden nucleinsyre aptamerer er meget stabile og giver gode muligheder for at designe aptamer-terapeutisk konjugater gennem en række kemiske reaktioner eller ved dannelse af fysiske komplekser. Vi har udviklet et syntetisk stof-DNA addukt (DDA) teknologi til nem og effektiv narkotika-DNA konjugation, inspireret af de naturligt dannede addukter mellem nukleinsyrer og forskellige kemikalier, såsom dem dannet mellem genomisk DNA og Dox under administration af Dox. DDAS er stabile ved relativt lave temperaturer (fx 4 ° C) til langtidsopbevaring, men er i stand til at frigive narkotika på fysiologiske temperaturer (ca. 37 ° C). Bemærkelsesværdigt, DNA rygraden i DDAS er også modstandsdygtige over for nukleasespaltning, sandsynligvis på grund af den steriske hindring forhindrer nuklease binding. De kombinerede funktioner i DDA-teknologi gør det en lovende tilgang til udvikling af nye lægemidler til målrettet leverkræft terapi.

I dette arbejde har vi fokuseret på AS1411 (AGRO100), en velkendt DNA aptamer, i øjeblikket i fase II kliniske forsøg for behandling af akut myeloid leukæmi (AML) og nyrecellecancer (RCC) [15,16]. Flere undersøgelser har vist, at AS1411 binder til plasmamembran nucleolin, som er overudtrykt ved mange cancer celletyper, og inducerer apoptose af tumorceller [17-19]. Selvom virkningerne af AS1411 er blevet vurderet i mange cancertyper, er den terapeutiske styrke af denne aptamer ofte begrænset. For at løse dette problem, her har vi udviklet en AS1411-doxorubicin addukt (AS1411-Dox) at kombinere målrettet evne AS1411 og den terapeutiske styrken af ​​Dox. Vi evaluerede nytten af ​​AS1411 og AS1411-Dox i en hepatocellulært carcinom (HCC) model. Resultaterne identificerer AS1411-Dox addukt som et nyt lægemiddel til behandling af HCC.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Prøverne blev opnået med godkendelse af universitetet i Florida Gainesville Health Science center Institutional Review Board (IRB-01). Parret tumor og ikke-tumor-levervæv blev anvendt i denne undersøgelse. Vi opnåede også særskilt godkendelse til generering af cellelinje HCO2 (udviklet fra et HCV /HBV-fri HCC væv i vores laboratorium). Ingen donororganer blev opnået fra henrettede fanger eller andre institutionaliserede personer. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag. Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Florida Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

aptamer DNA forberedelse

Alle DNA-prober blev syntetiseret på en ABI3400 DNA /RNA-synthesizer (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA). Biotin blev koblet på 5′-enden af ​​DNA-prober til flowcytometrianalyse. De færdige sekvenser blev derefter afbeskyttes i AMA (ammoniumhydroxid /40% vandig methylamin 1: 1) ved 65 ° C i 30 minutter og yderligere oprenset ved omvendt-fase-HPLC (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA) på en C-18-søjle under anvendelse af 0,1 M triethylamin (TEAA, Glen Research Corp.) og acetonitril (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som eluenten. DNA produkterne blev tørret og derefter detrityleret ved opløsning og inkubering DNA-produkter i 200 pi 80% eddikesyre i 20 minutter. De detrityleret DNA-produkter blev derefter udfældet med NaCl (3 M, 25 pi) og ethanol (600 pi). UV-vis målinger blev udført med et Cary Bio-100 UV /VIS spektrometer (Varian) for probe kvantificering.

Cellekultur

Alle cancercellelinier undtagen HCO2 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). HCO2 blev udviklet fra en HCV /HBV-fri HCC væv i vores laboratorium. Hu767, en primær hepatocyt prøve, blev opnået fra en rask donor fra Cellz Direct (Raleigh, NC). Celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (varmeinaktiveret, Gibco) og 100 IU /mL penicillin-streptomycin (Cellgro) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2 . Cellen densitet blev bestemt før hvert forsøg ved hjælp af et hæmocytometer.

Forberedelse og karakterisering af AS1411-Dox addukt

Ved hjælp af en modificeret protokol [20], AS1411-Dox addukt blev forberedt ved at inkubere Dox (500 pM), DNA (20 uM), og formaldehyd (0,37%) i reaktionspuffer (20 mM natriumphosphat, 150 mM NaCl og 0,5 mM EDTA, pH 7,0) ved 10 ° C natten over. Det resulterende DDA blev oprenset ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC) (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA) på en C-18-søjle, under anvendelse af 0,1 M trithylamine (TEAA, Glen Research Corp.) og acetonitril (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som eluenten. Oprensede prøver blev lyofiliseret, afsaltet, og opløstes i Dulbeccos puffer (Sigma-Aldrich), og opbevaret ved -20 ° C til senere brug. Molar ekstinktionskoefficienter på 11.500 M

-1cm

-1 ved 480 nm gratis Dox, og 7677 M

-1cm

-1 ved 506 nm for kovalent bundet Dox i addukt blev brugt til narkotika kvantificering ved UV-Vis spektrometri [20]

Undersøgelse af specifik binding evne og bindende affinitet

De bindende evner aptamerer eller narkotika-aptamer addukter. (endelige DNA-koncentrationer: 200 nM) blev bestemt ved hjælp af flowcytometri. Celler (2 x 10

5) blev inkuberet i bindingsbuffer (200 pi, 4,5 g /l glucose, 5 mM MgC

2, 0,1 mg /ml gær-tRNA (Sigma Aldrich) og 1 mg /ml BSA ( Fisher Scientific) i Dulbeccos PBS (Sigma)) på is i 30 minutter, efterfulgt af vask to gange med vaskebuffer (1 ml, 4,5 g /l glucose og 5 mM MgCl

2 i Dulbeccos PBS (Sigma)). Udfældede celler blev suspenderet i bindingspuffer (200 pi) før flowcytometri analyse på et FACScan-cytometer (BD Immunocytometry Systems). Data blev analyseret med WinMDI software. Bindingsaffiniteten af ​​hver probe blev bestemt ved anvendelse af en række probekoncentrationer. Som negative kontroller lignende assays blev udført under anvendelse af tilfældige DNA-sekvenser (random bibliotek) ved den samme tilsvarende koncentrationer. Den forøgede gennemsnitlige fluorescensintensitet af celler bundet af farvestof-mærkede prober blev sammenlignet med celler bundet af farvestof mærkede tilfældige sekvenser. Disse fluorescens værdier blev anvendt til at beregne ligevægtsdissociationskonstanten (

K

d

) ved tilpasning afhængigheden af ​​fluorescensintensitet af celler bundet af prober (

F Salg ) på sonde koncentration (

L

) til ligning: Hvor B

max repræsenterer den maksimale bindingskapacitet. Hver bindingsassay forsøg blev gentaget uafhængigt tredobbelt.

Intracellulær lægemiddelfrigivelse

Drug frigivelse i celler blev vurderet ved anvendelse af konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM). Alle cellulære fluorescerende billeder blev indsamlet på en Leica TCS SP5 konfokal mikroskop (Leica Microsystems Inc., Exton, PA) med en 63x olie nedsænkning objektiv og Leica Konfokal Software. Celler blev observeret i DIC-tilstand. Celler blev behandlet med fri Dox (2 uM), AS1411-Dox adduktet, eller kontrol-DNA-Dox addukt (2 uM Dox ækvivalenter). Lægemidler blev suspenderet i Dulbeccos PBS, og celler blev inkuberet (37 ° C, 5% CO

2) i 1 time. Inkubation blev efterfulgt af Hoechst-farvning med Hoechst 33342 (10 ug /ml) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) i 30 min før vask med Dulbeccos PBS. De resulterende celler blev derefter observeret under mikroskop.

Selektiv cytotoksicitet

Cell cytotoksicitet blev vurderet ved anvendelse CellTiter 96 celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI, USA). Celler (5 x 10

4 /brønd) blev behandlet med fri Dox, AS1411, kontrol-DNA-Dox adduktet, og AS1411-Dox addukt (henholdsvis) i FBS-frit medium. Alle behandlinger blev suspenderet i PBS. Efter inkubation i 1 time (37 ° C, 5% CO

2) blev mediet fjernet, og frisk medium (10% FBS, 100 IU /mL penicillin-streptomycin, 200 pi) blev tilsat til yderligere cellevækst (48 h). Derefter blev mediet fjernet igen, og CellTiter reagens (20 pi) fortyndet i frisk medium (100 pi) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 1-2 timer. Absorbansen (490 nm) blev registreret ved anvendelse af en mikropladelæser (Tecan Safire mikropladelæser, AG, Schweiz). Cellelevedygtighed blev bestemt ifølge producentens beskrivelse.

immunfarvning af væv under anvendelse AS1411-Biotin

FFPE (formalinfikserede paraffinindlejret) levertumor vævssnit opnået fra patienter blev underkastet immunfarvning under anvendelse AS1411 aptamer . Vævssnittene blev afparaffineret to gange i xylen i 15 minutter hver, vasket med serie af 100%, 95%, 80% og 70% for hver 1 min og skyllet med destilleret vand. Vævssnit blev derefter inkuberet i 10 mM natriumcitratbuffer (pH 6,2) ved 95 ° C i 30 minutter blev prøver derefter microwaved i 2 min og fik lov til at afkøle ved stuetemperatur. Efter at være blevet vasket to gange i PBS i 5 minutter hver, blev vævssnit inkuberet i 3% H

2O

2 i PBS i 30 minutter og derefter blokeret med biotin-blokerende opløsning (Vector, Laboratories). Vævssnit blev derefter probet med 200 nM AS1411-Biotin i 1 time ved stuetemperatur og vasket 3 gange i 0,5% PBST og inkuberet med HRP-konjugeret streptavidin-opløsning (Dako) i 30 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev vævssnit behandlet med DAB-peroxidase substratopløsning (Dako), indtil farven udviklet (ca. 5 min). Farvede vævssnit blev undersøgt, og billeder blev taget af et lysmikroskop.

Immuncytokemi af lever kræftceller ved hjælp AS1411-FITC

Celler blev podet på Superfrost mikroskop Slide (Fisherbrand) dagen før farvning . Cell objektglas blev vasket to gange i PBS i 5 minutter hver, blokeret i 5% BSA i PBS og inkuberet med 200 nM af AS1411-FITC i 1 time ved stuetemperatur. Objektglas blev derefter vasket 3 gange i 0,5% PBST og monteret med Vectashield monterings reagens indeholdende DAPI (Vector Laboratories). Slides blev undersøgt under et konfokal mikroskop.

Western blotting analyse

Heart, nyre- og tumorvæv blev indsamlet fra hver mus ved afslutningen af ​​undersøgelsen. Væv blev lyseret i RIPA-buffer indeholdende proteinase Inhibitor Cocktail (Sigma Aldrich) og inkuberet på is i 30 minutter. Efter centrifugering ved 13.300 x g i 15 minutter ved 4 ° C blev supernatanten overført til et frisk rør, og koncentrationen af ​​proteinet blev bestemt ved Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad) ifølge fabrikantens protokol. Protein blev analyseret på 12% SDS-PAGE geler. Proteinerne blev herefter overført til nitrocellulosemembraner og probet med spaltede caspase-3-antistof (Cell Signaling Technology, Inc.), efterfulgt af det passende sekundære antistof med HRP-konjugeret (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Immunreaktive bånd blev påvist under anvendelse SuperSignal West Pico Substrat (Thermo Scientific).

detektion Celle cyklus ved flowcytometri under anvendelse propidiumiodid.

Hver brønd i en plade med 6 brønde blev podet med 100.000 Huh7 leveren cancerceller og behandlet med 5 pM af AS1411 i 24 timer eller 48 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev cellerne trypsinbehandlet og derefter opsamlet og vasket to gange i iskold PBS. Celler blev derefter fikseret med iskold 70% ethanol ved -20 ° C i 30 minutter. Celler blev derefter vasket to gange i kold PBS og efterfølgende inkuberet med frisk gjort 20 pg /ml propidiumiodid og 100 pg /ml RNaseA i koldt PBS i 1 time ved 4 ° C i mørke. Cellecyklussen blev analyseret ved flowcytometri efterfulgt af anvendelsen af ​​FlowJo software.

In vivo eksperimenter

NOD. Cg-Prkdc (SCID) IL2 mus blev købt hos Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og huse på dyret facilitet fra University of Florida, blev protokollen godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg. Tumoren xenograft musemodel blev udviklet af subkutant intravenøs 5×10

6 af in vitro-opformerede Huh7 HCC-celler (i 100 pi DPBS buffer) i mus på højre flanke. Dorsale tumor knuder fik lov til at vokse til et volumen på ~ 100 mm

3 før behandlingsstart. Tumorbærende mus blev randomiseret til fire grupper, med 5 mus i hver gruppe: (i): behandlet med AS1411; (Ii): behandles med fri Dox, (iii): behandlet med kontrol-DNA-Dox addukt; og (iv): behandles med AS1411- Dox addukt. Doxorubicin dosering blev holdt samme i grupper (ii), (iii) og (iv) ved 2 mg /kg; og AS1411 dosering i gruppen (i) blev derfor opretholdt som svarer til det i gruppe (iv). Lægemidler blev administreret gennem halevenen injektion hver anden dag, efterfulgt af tumorstørrelse måling. Kropsvægt hver mus blev også målt hver anden dag for at overvåge potentielle lægemiddel toksicitet. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev musene humant aflivet; hjerte, blev nyre- og tumorvæv indsamles, når tumor volumen oversteg 2000 mm

3 eller udviklet sårdannelse.

Resultater og Diskussion

AS1411 aptamer bindende affinitet for leverkræft cellelinjer og patient tumorvæv

Nucleolin udtrykkes afvigende på cellemembranen af ​​mange tumortyper herunder gliom, prostata- og leverkræft [21-24]. Som AS1411 virker ved først at binde til cellemembranen nucleolin [19], forsøgte vi at bestemme tilstedeværelsen af ​​celle-overflade nucleolin ekspression i HCC cellelinien Huh7 og i en kultur af humane primære hepatocytter Hu767. Ved flowcytometri analyse af immunofarvede celler observerede vi, at nucleolin blev udtrykt på cellemembranen af ​​Huh7-celler, men ikke i Hu767 celler (Fig 1A). For at bestemme om AS1411 kunne være nyttig som en markør for HCC tumorbilleddannelse, vi konjugeret AS1411 til FITC og udført farvning på to HCC-cellelinier; Huh7 celler og HCO2 celler, en hidtil ukendt HCC cellelinje udviklet i vores laboratorium (Fig 1B). Ligeledes blev AS1411-Biotin anvendes til at udvikle immunhistokemi farvning af paraffinindlejrede HCC patienter tumorprøver. 21 HCC tumor vævsprøver (formalinfikseret og paraffinindlejret) fra HCC patienter blev analyseret, og i 15 prøver blev fundet AS1411 til fortrinsvis at binde i tumor regioner sammenlignet med tilstødende ikke-tumorvæv. AS1411 viste den stærkeste farvning omkring kernen, hvor nucleolin er den mest rigelige. Men AS1411 farves også membranen og cytoplasma liver cancerceller klart skelner tumorvæv, hvilket indikerer afvigende transport af nucleolin hele HCC tumorceller (Fig 1C venstre panel). Signaldetektering på ikke-tumorvæv var begrænset til kernen (Fig 1C, højre panel). Yderligere data bekræfter, at AS1411 pletter membranen af ​​tumorceller og fortrinsvis pletter liver tumorvæv sammenlignet med nucleolinantistof antistof, som ofte kun pletter nukleare nucleolin (S1 og S2 Fig). Resultaterne indikerer, at AS1411 binder fortrinsvis til liver kræftceller og kan skelne tumor- og ikke-tumorvæv ved forskellen i farvningsintensitet. Dataene viser, at AS1411 er en egnet kandidat til videre udvikling som en Drug-DNA addukt for den specifikke målretning af leverkræft.

(a) Nucleolin opdages celleoverfladen af ​​Huh7 (til venstre), men ikke på Hu767 (primær hepatocyt, højre). 1 million celler af hver cellelinie blev inkuberet med 2 ug /ml Nucleolin antistof og 1 ug /ml sekundært antistof af muse-FITC i 1 time ved 4 ° C, hvilket blev efterfulgt af flowcytometri. (B) AS1411 kan plette membran nucleolin på Huh7 og HCO2. Levende celler blev inkuberet med 200 nM af AS1411-FITC i 30 minutter ved stuetemperatur og undersøgt under et konfokalt mikroskop. (C) AS1411 pletter membran nucleolin i tumorvæv, men kun nuklear nucleolin af ikke-tumorvæv. Paraffinindlejrede vævsprøver fra patienter blev inkuberet med 200 nM af AS1411-Biotin i 1 time ved stuetemperatur. Signal blev udviklet ved hjælp af HRP-konjugeret streptavidin og DAB peroxidase substrat (Dako).

Vurdering af AS1411 cytotoksicitet i HCC-cellelinjer

AS1411 har cytotoksiske egenskaber mod brystkræft og forbedrer effektiviteten af kemoterapi i gliom behandling [25,26]. For at vurdere de potentielle cytotoksiske virkninger af AS1411 på leverkræft celler

in vitro

inkuberede vi Huh7 celler med forskellige koncentrationer af AS1411 i området fra 1 uM til 10 uM i 48 timer. Efter inkubering cellelevedygtighed blev vurderet ved MTS-assay. Ingen virkning blev observeret i Huh7 celler behandlet med en lav dosis af AS1411. Imidlertid faldt celleproliferation blev observeret i celler behandlet med AS1411 koncentrationer på 5 pM eller mere (Fig 2A). Vi fandt ingen indlysende induktion af celleapoptose, AS1411 er tidligere blevet rapporteret at inducere tumorcelle apoptose [25]. Derfor søgte vi at undersøge omfanget af hvilken Huh7 celler hæmmes af AS1411. Cellecyklusanalyse blev udført ved flowcytometri på celler behandlet med AS1411 i 24 og 72 timer. Behandling af Huh7-celler med 5 uM AS1411 inducerede en forøgelse af celler standset ved S-fasen og G2 /M-fasen. Procentdelen af ​​celler standset i S-fase steg fra 7,92% til 14,7% efter 72 timers behandling (figur 2B og 2C). En større virkning blev observeret efter behandling med AS1411 med celler standset ved G2 /M-fasen; med procentdelen af ​​celler standset stigende fra 17,4% til 31,5% efter 24 timers behandling og op 35,5% efter 72 timers behandling (figur 2C). Arrest ved G2 /M checkpoint kan muliggøre celler at undergå apoptose og bestræbelser på at øge G2 /M arrest kan forøge følsomheden af ​​celler, for kemoterapeutiske interventioner [27-29]. Disse resultater antyder, at AS1411 i sig selv inhiberer Huh7 celleproliferation på en dosis-afhængig måde, og at selv AS1411 ikke direkte inducerer cytotoksiske virkninger i target Huh7 celler det gør inhibere tumorcelleproliferation i nogen grad ved at inducere G2 /M arrest. Selv om kun lidt over en tredjedel af cellerne blev anholdt ved G2 /M ved behandling med 5 uM AS1411, kan højere doser være mere effektiv, som er angivet med en yderligere reduktion af levedygtige celler ved behandling med 10 pM som angivet af cellernes levedygtighed assay (fig 2A). Denne virkning kan øges yderligere ved kombination med et kemoterapeutisk middel til behandling af leverkræft. Vi besluttede at kombinere doxorubicin (Dox) med AS1411 til dannelse af AS1411-Dox addukt.

(a) Huh7 blev inkuberet med AS1411 ved koncentrationer fra 1 uM til 10 uM i 2 dage ved 37 ° C derefter underkastet MTS assay. (B) standsning af cellecyklus blev testet ved flowcytometri af PI-farvede celler. FLOW data indikerer cellecyklusstop i AS1411 behandlede celler og cellecyklus procent (c) Analyse af flowcytometri data viste, at en langt større andel af behandlede celler blev arresteret i S og G2 /M-faser, sammenlignet med ubehandlede celler.

Forberedelse og nytte af AS1411-Dox addukt

Dox er en bredt ordineret kemoterapeutisk anvendes i kræftbehandling. Dox er stand til at danne addukter med DNA [30,31]. Den Dox addukt blev fremstillet ved inkubering Dox med formaldehyd, som blev anvendt som et reducerende og tværbindingsmiddel under adduktdannelse. Specifikt blev AS1411-Dox-addukt fremstillet ved inkubering aptamerer med Dox og formaldehyd i reaktionspuffer ved 10 ° C natten over (fig 3A). Resterende aptamer, lægemiddel og formaldehyd blev fjernet fra reaktionsblandingen under anvendelse af omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC). Resultaterne viser, at DDA viste stærk absorbans ved 260 nm (fra lægemiddel og DNA) samt nogle absorbans fra 490 nm (udelukkende af lægemiddel) (S3 Fig). Oprenset addukt blev lyofiliseret og afsaltet. UV-Vis spektrometri resultater yderligere verificeret den karakteristiske stof absorbans omkring 490 nm i renset DDA (fig 3C). Baseret på tidligere rapporter, molær ekstinktionskoefficient på 7677 M

-1cm

-1 ved 506 nm for Dox i DDA blev brugt til narkotika kvantificering i addukt [20]. Følgelig blev AS1411-Dox adduktet bestemt til at have 5,4 ± 0,1 (s.d., n = 3) kopier af Dox-dele pr AS1411 streng. Tilsvarende blev en ikke-bindende kontrol-DNA (S1 Table) også anvendes til at fremstille en kontrol addukt med Dox (kontrol-Dox).

(a) Skematisk beskrivelse af fremstillingen af ​​AS1411-Dox addukt ved at inkubere Dox (500 pM), AS1411 (20 uM), og formaldehyd (0,37%) ved 10 ° C natten over, efterfulgt af oprensning ved omvendt fase HPLC. (B) AS1411-Dox addukt forblev dets bindende affinitet til Huh7 oprettet ved ligevægtsdissociationskonstanten (

Kd

). (C) UV-Vis-spektret viser absorbansen af ​​oprenset AS1411-Dox addukt, med den karakteristiske absorbanstop af Dox ved 490 nm. (D) Flowcytometri resultater indikerer særlig anerkendelse evne AS1411 og AS1411-Dox addukt til Huh7 HCC celler, bemærk den ikke-specifikke DNA-bibliotek registrerer ikke Huh7 celler (e) Tilfældig bibliotek og kontrollere DNA aptamerer og kontrol DNA-Dox addukt i modsætning var ikke i stand til specifikt at binde til Huh7 celler.

Som vi har demonstreret, AS1411 var i stand til at binde til at målrette Huh7 liver kræftceller. Vi evaluerede derefter, om den resulterende AS1411-Dox addukt fastholdt særlig anerkendelse evne til at målrette kræftceller. AS1411 og kontrolsekvensen blev biotinyleret ved 5′-enden og anvendes til fremstilling af addukter med Dox. Streptavidin-PE (phycoerythrin) konjugat farvestof blev anvendt i flowcytometri til at overvåge fluorescens af celler inkuberet med enten AS1411-Dox eller kontrol-Dox. Ukonjugeret AS1411 blev anvendt som en positiv kontrol, og et bibliotek af tilfældige DNA-sekvenser blev anvendt som en negativ kontrol. Intens cellefarvning af Huh7-celler blev observeret på inkubering med AS1411-Dox adduktet, hvilket indikerer, at lægemiddel-aptamer konjugat opretholdt den specifikke bindingsevne af den oprindelige aptamer. Fluorescensintensiteten var sammenlignelig med celler inkuberet med AS1411, hvilket antyder en minimal indvirkning på den bindende evne af adduktet, når man sammenligner med ukonjugerede aptamerer. I modsætning hertil hverken den negative kontrol-DNA, eller kontrol-Dox addukt bundet til Huh7 celler (Fig 3D). De bindingsaffiniteter AS1411 og AS1411-Dox addukt for Huh7 celler blev yderligere undersøgt ved at bestemme dissociationskonstanten (

K

d

). Den AS1411-Dox addukt havde en

K

d

af 57,3 ± 8,1 nM (sd n = 3), med AS1411-Dox addukt også bindende at målrette Huh7 celler med stærk affinitet .

K

d Drømmeholdet værdi af AS1411-Dox er sammenlignelig med ofAS1411 (

K

d

= 54,8 ± 7,3 nM) (fig 3B). Den lidt reduceret bindingsaffinitet af AS1411-Dox adduktet kan skyldes små konformationelle ændringer forårsaget af Dox-DNA adduktdannelse. Dox danner methylen links til N2 af DNA-strenge (S4 Fig). Dette er et vigtigt spørgsmål, som kræver yderligere undersøgelse ved NMR-spektroskopi til at belyse den fulde struktur AS1411-Dox. Men disse effekter er minimale og AS1411-Dox bevarer evnen til specifikt at binde Huh7 celler. Disse data giver grundlag for downstream-applikationer målrettet leverkræft terapi.

Intracellulær medikamentfrigivelse fra AS1411-Dox addukter

De intracellulære adfærd af gratis Dox og AS1411-Dox addukt blev undersøgt ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi. I denne undersøgelse blev Huh7-celler inkuberet med enten; fri Dox, den AS1411-Dox adduktet, eller kontrol-DNA-Dox adduktet. Inkubation blev efterfulgt af farvning med Hoechst 33342 til lokalisering nucleus før mikroskopi observation. Fri Dox hurtigt akkumuleret i celler, som vist ved intens intracellulær Dox fluorescens (figur 4A). Intens lægemiddel fluorescens blev også observeret i Huh7-celler inkuberet med AS1411-Dox adduktet, hvilket indikerer optagelsen af ​​dette addukt og lægemiddelfrigivelse fra addukt. I modsætning hertil celler behandlet med kontrol-DNA-Dox adduktet vises temmelig svag lægemiddel fluorescens. Efter at have konstateret, at AS1411-Dox addukt specifikt kan genkende målrette Huh7 liver kræftceller, og levere Dox i dette mål celle, den deraf

in vitro

cytotoksicitet blev vurderet ved en MTS assay. Celler blev behandlet med fri Dox og AS1411-Dox addukt, henholdsvis, med en række af doxorubicin-koncentrationer. Mens hverken aptamer AS1411 alene eller kontrol-Dox addukt induceret potent cytotoksicitet, både gratis Dox og AS1411-Dox addukt udviste sammenlignelig dosisafhængig cytotoksicitet i target Huh7 celler (Fig 4B). Disse data viser, at AS1411-Dox addukter bevarer specificitet for binding til Huh7 celler

in vitro

og at konjugeringen af ​​Dox til AS1411 forhindrer ikke Dox-medieret cytotoksicitet til målceller. Tilsammen viser disse data, at AS1411-Dox addukt er i stand til specifikt at målrette Huh7 celler

in vitro

, effektivt levere Dox i mål celler og reducere cellernes levedygtighed til et sammenligneligt niveau som i fri Dox. Dataene viser også, at adduktdannelse ikke hæmmer intracellulær frigivelse af Dox. Disse resultater motiveret os til at teste effektiviteten og potentielle bivirkninger af AS1411-Dox

in vivo

, ved hjælp af en xenograft model af Huh7 tumorer i mus.

(a) Konfokal laser scanning mikroskopi billeder viser optagelse af Dox i Huh7 celler behandlet med 2 uM gratis Dox, AS1411-Dox addukt eller styre DNA-Dox addukt hhv. Efter behandling celler blev farvet med Hoechst 33342 (skala bar: 50 pm). Fri Dox ledt ind eventuelle celler; dog kun Dox knyttet til AS1411 og ikke kontrol aptamer blev selektivt leveret til Huh7 celler grund bindingsaffiniteten af ​​AS1411. (B) Celler blev behandlet i 1 time med enten; 2 uM gratis Dox, AS1411, AS1411-Dox addukt eller kontrol-DNA addukt., Før MTS analysen. Resultaterne indikerer den specifikke og potente cytotoksicitet i target Huh7 celler induceret af AS1411-Dox addukt.

In vivo evaluering af AS1411-Dox addukt til målrettet leverkræft terapi

Der er flere veldokumenteret store bivirkninger af doxorubicin behandling, herunder; vægttab, cardio cytotoksicitet og nefrolidelser cytotoksicitet [32-38]. Doxorubicin er meget giftigt og administreres intra-hepatisk under normale omstændigheder [39]. At fastlægge effekten af ​​AS1411-Dox addukt blev en murin model for HCC testet. Den AS1411-Dox addukt blev fremstillet som beskrevet og fast besluttet på at have omkring 5,4 ± 0,1 kopier af Dox pr hver streng af AS1411. Igen brugte vi en kontrol-DNA-sekvens, som ikke binder til at målrette lever kræftceller, at udarbejde en kontrol-Dox addukt. Kort fortalt NOD Cg-Prkdc (SCID) IL2 mus blev hver inokuleret med 1 million Huh7 celler. Dorsale tumor knuder fik lov til at vokse til et volumen på ~ 100 mm

3 før behandlingsstart. Tumorbærende mus blev randomiseret i 4 grupper (n = 5), og blev behandlet ved haleveneinjektion med enten; (I) AS1411, (ii) gratis Dox, (iii) kontrol-Dox addukt, eller (iv) AS1411-Dox addukt hhv. Den Dox dosis uændret på 2 mg /kg, og doseringen af ​​AS1411 i grupper (i) og (iv) var ens. Tumorstørrelse og mus vægt blev målt hver anden dag, som indekser for medikamenteffektivitet og ikke-specifik cytotoksicitet. De gennemsnitlige tumorvæksthastigheder blev beregnet i overensstemmelse hermed (figur 5A).