PLoS ONE: ErbB2 Receptor immunreaktivitet i prostatakræft: Forholdet til androgen receptor, sygdommens sværhedsgrad på diagnose og sygdom Outcome

Abstrakt

Baggrund

ErbB2 er medlem af epidermal vækstfaktor familie af tyrosinkinaser, der er centralt involveret i patogenesen af ​​prostatacancer og flere undersøgelser har rapporteret, at en høj ekspression af dette protein har prognostisk værdi. I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt, om tumor ErbB2 immunoreaktivitet (ErbB2-IR) har klinisk anvendelig prognostisk værdi, dvs. at det giver yderligere prognostisk information, der ydes af rutinemæssige kliniske tests (Gleason score, tumor etape).

Metode /Principal Fund

ErbB2-IR blev målt i en godt karakteriseret væv microarray af tumor og ikke-maligne prøver opnået ved diagnose. Derudover blev mRNA-niveauer af ErbB2-IR i prostata bestemt i rotten efter manipulering af cirkulerende androgen niveau. Tumor ErbB2-IR var signifikant associeret med den nedstrøms signalmolekyle phosphoryleret-Akt og med celleproliferation markør Ki-67. Den betydelige sammenslutning af tumor ErbB2-IR med Gleason score ved diagnose var tabt, da kontrolleret for foreningen af ​​begge parametre med Ki-67. Hos rotter prostata, blev mRNA for ErbB2 omvendt forbundet med cirkulerende androgen niveau. Der var ingen sammenhæng mellem ErbB2-IR og androgen receptor (AR) -IR i tumorerne, men en interaktion mellem de to parametre blev set med hensyn til deres association med tumoren fase. Tumor ErbB2-IR blev bekræftet at være en prognostisk markør for sygdomsspecifikke overlevelse, men det gav ikke signifikant additiv oplysninger til Gleason score eller Ki-67.

Konklusioner /Betydning

Det konkluderes, at tumor ErbB2-IR er af begrænset klinisk værdi som prognostisk markør for at hjælpe behandling beslutninger, men kunne være af patofysiologisk betydning i prostatakræft

Henvisning:. Hammarsten P, Winther J, Rudolfsson SH, Häggström J, Karalija A, Egevad L, et al. (2014) ErbB2 receptor immunreaktivitet i prostatakræft: Forholdet til androgen receptor, sygdommens sværhedsgrad på diagnose og sygdom Outcome. PLoS ONE 9 (9): e105063. doi: 10,1371 /journal.pone.0105063

Redaktør: Ramin Massoumi, Lunds Universitet, Sverige

Modtaget: Februar 16, 2014 Accepteret: 19 Juli 2014; Udgivet 12. september, 2014

Copyright: © 2014 Hammarsten et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Forskningsrådet Svensk (Grant nr 12158, medicin, CJ Fowler.); den svenske Cancer Society (. Grant ingen CAN2010 /437, C. J. Fowler); Lions Cancer Research Foundation, Umeå Universitet (P. Hammarsten og C. J. Fowler); Cancer Research Foundation i Nordsverige (P. Hammarsten), og forskningsmidlerne i det medicinske fakultet, Umeå Universitet (C.J. Fowler). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ErbB2 (Her-2 /neu) er et medlem af epidermal vækstfaktor-familien af ​​tyrosinkinaser, der er involveret i en række forskellige cellulære responser, herunder apoptose, migration, vækst, adhæsion og differentiering [1]. ErbB2 danner heterodimerer med andre medlemmer af ErbB familien og initierer en kaskade af signalveje, herunder aktivering af overlevelsesfaktor Akt [1], [2]. ErbB2 findes også i tumorceller, og trastuzumab, et ErbB2 monoklonale antistof, der anvendes til adjuverende behandling af ErbB2-positiv brystkræft. Andre ErbB2 monoklonale antistoffer er også under klinisk udvikling [3].

Betydningen af ​​ErbB2 i patogenesen af ​​prostatacancer (PCA) er mindre klar. PCA vækst reguleres af androgenreceptorer (AR), og et centralt behandling af androgen-afhængige PCA er en reduktion af androgen niveauer enten ved kirurgisk eller medicinsk kastration. Imidlertid er virkningen af ​​behandlingen er midlertidige, og cancere bliver androgen-resistente. I 1999 Craft et al. [4] rapporterede, at indførelsen af ​​ErbB2 i LNCaP androgenafhængige PCA celler afsmeltet dem delvist resistente over for væksten-hæmning produceret af androgen deprivation. Endvidere er der i en xenotransplantat-model under anvendelse af kastrerede mus, ErbB2-udtrykkende celler produceret en hurtigere tumordannelse end de utransficerede LNCaP-celler [4]. Den prædiktive gyldighed xenograftmodeller er kontroversiel [5], men en forøget metastase er blevet rapporteret i en ortotopisk model PCA efter injektion i den ventrale prostata hos nøgne mus af NBE-1,4 rotte prostataceller overudtrykker rotte homologen i ErbB2 [ ,,,0],6]. Omvendt behandling af BALB /c nøgne mus med et ErbB2-antistoffet reducerede tumorvækst efter injektion af 22Rv1 PCA-celler [7]. Fjernelse af androgener fra cellekulturmediet forøger ErbB2-ekspression [8], og en lille stigning i ErbB2-ekspression syv dage efter kastration ses i en xenograft model for tumorvækst med CWR22-celler [9].

Mens studier i cellelinier og dyremodeller tyder på en central rolle i ErbB2 i patogenesen af ​​PCA undersøgelser i mennesker er mindre klar. Forskellige undersøgelser har rapporteret meget store variationer i niveauet af ErbB2 udtryk i prostata tumorvæv (se [10] og referencer deri). Men en meta-analyse af litteratur mellem 1996 og 2009 fandt en øget relativ risiko for død som følge af Pca eller biokemisk (prostata-specifikt antigen, PSA) tilbagefald af sygdommen hos patienter med moderat til høje niveauer af tumor ErbB2 udtryk [11 ]. Disse forfattere konkluderede, at “yderligere kliniske undersøgelser skal teste den hypotese, at HER-2 /neu er en markør for en klinisk dårligere resultat hos patienter med prostatacancer og et potentielt mål for terapi”. En sådan efterfølgende undersøgelse i en stor ( 1700) antal patienter bekræftet, at de prognostiske egenskaber ErbB2 overekspression med PSA recidiv som endepunkt, selv om det ikke giver additiv prognostisk information til, at i betragtning af Gleason score, tumor scenen og den præoperative PSA-niveau [10]. Selvom patienterne ikke blev behandlet i follow-up perioden blev prøverne opnået ved radikal prostatektomi snarere end på diagnosetidspunktet. Det er derfor vigtigt at afgøre, om ErbB2 har en bedre prognostisk værdi (dvs. giver additiv oplysninger til, at i betragtning ved hjælp af Gleason score og andre prognostiske markører) i en kohorte af patienter, hvor prøverne væv blev opnået ved diagnose og den naturlige progression af sygdommen kan studeres. Dette er blevet undersøgt i den foreliggende undersøgelse.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Den menneskelige materiale blev indsamlet efter svenske regler på et tidspunkt, hvor informeret samtykke var ikke nødvendig . Forskningen etiske komité på Umeå Universitetshospital (Regional Etisk Review Board i Umeå), godkendt af undersøgelsen (nr. 02-283) og frafaldes behovet for samtykke.

Etisk tilladelse (nr. A110-12) for forsøgene dyr blev opnået fra den lokale dyr etiske komité (Umeå etiske komité for animal Studies, Sverige).

Patientprøver

kohorte anvendte er fra en fortløbende serie af 412 mænd, der blev diagnosticeret med prostatakræft efter transuretral resektion for lavere tarmkanalen symtoms urin [12]. Sagerne blev indsamlet mellem 1975 og 1991 på Central Hospital, Västerås, Sverige, en periode, hvor PSA-test ikke var rutine. Da patienterne blev diagnosticeret post-operation, havde de ikke fået hormonbehandling eller strålebehandling før transuretral resektion. Prøverne blev derefter formalinfikseret og paraffinindlejret. Brug af kerner (diameter 0,6 mm) vævet mikroarrays blev foretaget ved hjælp af en Beecher instrument (Sun Prairie, WI, USA). For hver patient, indtil otte kerner (som regel 5) af tumorvæv og op til fire prøver af ikke-malignt væv fra hver patient blev anbragt [12].

ErbB2 immunreaktivitet (ErbB2-IR) i Pca microarrays

De 4 um paraffinindstøbte væv micro array-sektioner blev placeret på dias, bagt ved 60 ° C, 1 time og derefter deparaffinised og rehydreret. Peroxid blok med 3% H

2O

2 i methanol i 20 min blev gennemført. Antigen genfinding blev udført med dele anbringes i en citratbuffer pH 6,0 og dampet i en mikrobølgeovn i 2 min. Opløsningen fik lov at afkøle i 5 minutter, vasket i destilleret vand og derefter TBS-buffer. Proteinet-blok (DAKO, Stockholm, Sverige) blev udført i 15 minutter, hvorefter snittene blev udsat for det primære monoklonale antistof (muse c-erbB-2 forud fortyndet Cocktail Antibody (PM070AA), Biocare, CA, USA) i 2 timer i RT. Så det sekundære antistof (heste-anti mus (BA-2000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) blev inkuberet ved 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af avidin-biotin kompleks tagging i 30 minutter ved stuetemperatur under anvendelse af Elite ABC Kit (Vector Laboratories ) og endelig DAB (DAKO) forbedring i 40 s ved stuetemperatur.

tumor (n = 1822) og ikke-maligne (n = 1170) kerner blev bedømt for ErbB2 i prostata epitelceller og tumorceller fra digitalt scannet billeder ved en evaluator (JW), der ikke gjorde på tidspunktet for evalueringen har adgang til de kliniske data. Tumorprøverne blev bedømt på basis af immunoreaktivt intensitet (fra 0 = Ingen farvning til 4 = maksimal farvning) og distribution (0, 25, 50, 75, 100%). Bemærk, at distributions- scores ikke omfatter stroma, da dette ikke udtrykte ErbB2-IR. Således kan en prøve med kun en lille andel af epitelceller, men med en stor mængde af stroma stadig score en fordeling på 100% og en intensitet på 4. Så for hver kerne en sammensat værdi blev bestemt (mellem 1-4). For eksempel en kerne med hvor 25% af den scorable prøve havde intensitet 2 og 75% havde intensitet 3 ville modtage en sammensat score på (0,25 × 2 + 0,75 x 3) = 2,75. Medianværdier blev derefter bestemt i hvert tilfælde. For at bestemme konsistens, blev 301 tumor kerner scorede og derefter rescored. Intraklassekorrelation koefficient for konsistens (mixed model) gav Cronbachs alpha på 0,90, 254 af 301 scoringer var inden for 0,5 score enheder af hinanden. De ikke-maligne kerner blev desuden scoret for basal og luminale celler hver for sig, når det er muligt. Nogle kerner (n = 482) havde klart identificerbare basal og luminale celler, og disse er blevet returneret som basal og luminale i databasen. En diffus basale lag (n = 436) blev set i nogle andre kerner og i de resterende kerner (n = 252) basale celler kunne ikke identificeres. Disse kerner blev ikke brugt her, så det bør blive husket som en advarsel, at de scorer for basal og luminale ikke-maligne ErbB2-IR repræsenterer en begrænset datasæt. Ki67 indeks, Pakt-IR, androgen receptor (AR) -IR og de kliniske karakteristika for hver patient var tilgængelige i databasen og er blevet rapporteret i helt eller delvist tidligere [12] – [15].

dyr og behandlinger

Toogfyrre voksne Sprague-Dawley-rotter (284-430 g) blev bedøvet med pentobarbitalnatrium (50 mg /kg) og kastrerede via pungen. Seks intakte dyr fungerede som kontrol. Efter 7 dage enogtyve af dyrene modtog en subkutan injektion af langtidsvirkende testosteron (5 mg /kg, Sustanon, Organon, Oss, Holland) givet som en enkelt dosis hver anden dag som tidligere beskrevet [16]. Prostatavæv blev fjernet på forskellige tidspunkter efter kastration (1, 3, 7 dage) og på forskellige tidspunkter efter kastration + testosteron behandling (1 dag, 2 dage, 3 dage) og frosset i flydende nitrogen. Der var syv grupper, herunder kontrolgruppen og hver gruppe bestod af seks dyr.

Det eksperimentelle design af denne undersøgelse forløbet efter retningslinjerne for pleje og håndtering af forsøgsdyr og blev godkendt af den lokale dyr etiske komité ( Umeå etiske komité for Animal Studies, Sverige). Dyr blev huset under en kontrolleret temperatur i en kunstigt belyst rum (12-timers lys /12-timers mørke). Mad og ledningsvand var frit tilgængelige.

RNA forberedelse og kvantitativ Reverse transskription PCR

Total RNA fra væv blev isoleret i henhold til TRIzol metoden (Invitrogen, Stockholm, Sverige). RNA-koncentrationer blev kvantificeret spektrofotometrisk ved 260 nm (DU 640 spektrofotometer, Beckman Coulter, Bromma, Sverige) og RNA integritet blev verificeret ved 28 S og 18 S rRNA integritet efter agarosegelelektroforese (data ikke vist).

Five hundrede ng totalt RNA blev vendt transkriberet under anvendelse vilkårlige hexamerer (Applied Biosystems, Sundbyberg, Sverige) og Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Stockholm, Sverige) i en 10 pi reaktion ifølge producentens instruktioner. Alle cDNA reaktioner blev kørt in duplo.

Kvantificering af ErbB2-mRNA blev udført ved real-time kvantitativ PCR under anvendelse af ABI PRISM 7900HT Instrument (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Reaktioner blev kørt i en 20 pi volumen under anvendelse TaqMan genekspression assays Rn00566561_m1 (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Stockholm, Sverige) med TaqMan genekspression mastermiksens ifølge producentens protokol. Hver prøve blev analyseret for Rpl13a (Rn00821946_gl, Applied Biosystems) og β-actin (Rn00667869_ml, Applied Biosystems) udtryk at bruge som en normalisere reference- kontrol. For at bekræfte amplifikation specificitet PCR-produkterne blev underkastet en smeltekurveanalyse. Kvantificeringen blev analyseret med SDS 2.4 software (Applied Biosystems), og de relative værdier af ErbB2 mRNA i prøver beregnes ud fra en standardkurve opnået ved amplifikation af fem gange seriel fortynding af omvendt transkriberet total RNA fra en referenceprøve. Et problem i denne type undersøgelse er det passende husholdning til at bruge, da deres niveauer kan variere i kræftforskning undersøgelser [17], [18]. Vi har valgt at præsentere data normaliseret til to gener: ß-actin og rpl13a, for at give en vurdering af robustheden af ​​de data,

Statistik

intraclass korrelationskoefficient, binær. logistiske og Cox proportional-risiko regressions analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (IBM). Ordinal regressionsanalyser udnyttet software udviklet inden for R projekt for statistisk computing (version 2.15.2) [19]. Alle andre statistiske beregninger anvendes den statistiske pakke indbygget i GraphPad Prism 6 computerprogram til Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). For sager, efterfulgt af den forventede, blev Receiver Operating Karakteristiske (ROC) kurver med en 15-års follow-up grænse bruges til at definere cut-offs for ErbB2-IR. For disse kurver og for Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev en begivenhed defineret som dør som følge af prostatakræft og registreret i databasen som “event = 1”. Patienter med døden af ​​andre årsager og tilfælde, hvor patienterne var i live på tidspunktet for opfølgningen blev censureret og trådte i databasen som begivenheden = 0.

Resultater

ErbB2-IR i Pca væv microarrays: sammenligning af tumor og ikke-maligne scores

i alt 357 (tumor) og 222 (ikke-maligne basal og luminale) tilfælde blev scoret for ErbB2-IR. Eksempler på forskellige ErbB2-IR intensiteter fra fire tumor kerner er vist i fig. 1A-D. Et eksempel på ikke-malignt væv, der viser en klar forskel mellem basale og luminal ErbB2-IR er vist i fig. 1E. For både tumor- og ikke-maligne prøver, viste epitelcellerne ErbB2-IR henviser stroma ikke gjorde. De kumulative scorer for tumoren epitel- og den ikke-maligne basal og luminale celler er vist i fig. 2A. For matchede prøver, scorerne signifikant forskellige fra hinanden (P 0,0001 for parvise tests, Wilcoxon matchede-par signed rank test). På de enkelte kerner, at antallet af tilfælde med basale scores ≥-1, -0,99 til -0,01, 0, 0,01 til 0,99, 1-1,99 og ≥ 2 enheder højere end de matchede luminale scoringer var 1, 1, 5, 86, 286 og 103, henholdsvis

De tildelte scoringer var:. score 1 for Panel A; Score 2 for Panel B; Score 2,25 (75% intensitet score 2, 25% intensitet score 3) til Panel C; Score 4 for Panel D. Gleason score på de tilfælde, hvorfra kernerne blev afledt var 5 for panel A og C, og 10 til paneler B og D. Panel E viser eksempel på ErbB2 immunoreaktivitet i en ikke-malign kerne, hvor basal og luminale farvning kunne let identificeres.

i panel A de kumulative frekvenser af ErbB2-IR scores er vist for tumor prøver (n = 357), og for den basale og luminale ikke-maligne prøver (n = 222 i begge tilfælde). De medianværdier (med interkvartile område i parentes) var: tumor, 3,0 (2,25-3,5); luminal nonmalignant, 2,25 (2,0 til 2,625); basal ikke-malign 3,875 (3,5-4,0). Medianværdier var signifikant forskellige fra hinanden (p 0,001, Dunns multiple sammenligningstest efter betydelig Kruskal-Wallis test). Panel B viser en scatterplot af de enkelte scorer for tumor ErbB2-IR og Pakt-IR (taget fra [14]).

Foreningen af ​​ErbB2-IR med sygdommens sværhedsgrad ved diagnose

foreningen af ​​ErbB2-IR med klinisk (alder, Gleason score,% af kerne, der blev tumor associeret) og biokemiske (Ki67-indeks, stroma AR-IR og Pakt-IR) foranstaltninger inden for samme region er vist i tabel 1. først ordens Spearman Rho værdierne i tabel 1 blev beregnet som beskrevet i [20]. I tumorprøverne, signifikante sammenhænge med Gleason score,% af kernen, der blev tumorassocieret, Ki67 indeks og Pakt-IR blev fundet. En scatterplot viser sammenhængen mellem tumor ErbB2-IR og Pakt-IR-resultater er vist i fig. 2B. I overensstemmelse med den betydelige Spearmans rho værdi, fordelingen af ​​sager med Gleason score 4-5, 6, 7 og 8-10, henholdsvis var anderledes for dem med en tumor ErbB2-IR score ≤2.75 (40 [26%], 46 [30%], 26 [17%] og 41 [27%]) end dem med en score 2,75 (21 [10%], 57 [28%], 40 [20%] og 86 [42%]) (P 0,0005, Chi squared test værdier er nummer [% for ErbB2-IR-gruppen] med Gleason score området ved diagnose de tilsvarende værdier for tumor kvaliteter 1a-1b, 2, 3 og 4, henholdsvis. var: tumor ErbB2-IR score ≤2.75, 92 [61%], 30 [20%], 25 [17%] og 3 [2%]); tumor ErbB2-IR score 2,75, 83 [41%], 61 [30%], 49 [24%] og 8 [4%] (P 0,005, χ

2 test).

i teorien kunne en signifikant association af to parametre skyldes det faktum, at begge parametre er forbundet med en tredje parameter. Således for eksempel, hvis sager med en høj celleproliferation, som set med Ki67-indekset, oftere har høje Gleason scores og højere ErbB2-IR score end sager med lave celleproliferation, derefter en korrelation mellem ErbB2- IR- og Gleason score ville blive induceret. I overensstemmelse med denne situation, første ordens korrelationer mellem ErbB2-IR og enten Gleason score eller% af kernen, der var tumorassocierede kontrollere for tumoren Ki67 indekset var ikke signifikant. Men sammenhængen mellem tumor ErbB2-IR og Pakt-IR forblev signifikant (tabel 1). Således i tumorvævet, er ErbB2-IR scores forbundet med den nedstrøms signalmolekyle Pakt og med celleproliferation Ki67, men ikke robust med de kliniske målinger af sygdommens sværhedsgrad. Ingen signifikant sammenhæng mellem ErbB2-IR og enten Gleason score, jo% af kernen, der blev tumorassocierede eller ikke-maligne Ki67 indekset blev set til enten basal eller luminale ErbB2-IR. Væsentlige associationer mellem basal ErbB2-IR og både ikke-maligne Pakt-IR og stroma AR blev set.

Forholdet mellem tumor ErbB2 og androgen signalering

Ricciardelli et al. [21] rapporterede, at høje niveauer af både tumor ErbB2-IR og AR-IR var mere almindelige i PCA patienter med stadie 3 tumorer (n = 31) end i fase 2 tumorer (n = 22, prøver opnået ved radikal prostatektomi). Her undersøgte vi forholdet mellem disse to variabler i vores væv microarray. Konsistent med studier af [21], var der ingen korrelation mellem de to variabler

per se

i tumorvævet (tabel 1). Men i vores materiale, sager med niveauer af både tumor ErbB2-IR og AR-IR over medianen var mindre almindelige hos patienter med stadie 3 tumorer (n = 58) end for fase 2 tumorer (n = 82) (tabel 2) . Som kan forventes fra korrelationen analyser vist i tabel 1, en confounding problem er, at Ki-67-indekset varierer mellem grupperne (tabel 2).

For at tage højde for dette, vi foretog ordinal regressionsanalyser med tumor ErbB2-IR, AR-IR og Ki67-indeks som uafhængige variable og tumor scenen som den afhængige ordinal variabel. Som en advarsel, skal det påpeges, at Ki67-indekset korrelerer både med ErbB2-IR (tabel 1) og AR-IR (Spearman Rho -0,17, n = 340, P 0,005) og så de tre variable er ikke virkelig uafhængig . Men korrelationerne, selvom betydelige, er relativt lav, så risikoen for multikollinearitet er lille. Endvidere ordet “ordenstal” i ordinal regressionsanalyse refererer til den afhængige variabel, og værdierne for de uafhængige variable er defineret som kontinuerlig, frem for ordinal, som faktisk tilfældet for scorerne (derfor, for eksempel den anvendelse af Spearmans rho stedet Pearsons r i tabel 1). Dette er imidlertid helt rimeligt i ordenstal regressionsmodeller hvis variablen pågældende har et stort antal af kategorier (der er 22 forskellige tumor ErbB2 scorer i området fra 1 til 4, i databasen). I hovedsagen effekter model, værdierne vendte tilbage fra ordenstal regressionsanalyse for en variabel repræsentere sit samlede virkning, når de andre variable er inkluderet. I dette tilfælde både Ki67 indeks (positiv) og AR-IR (negativ) var signifikant, hvorimod ErbB2 ikke var (tabel 3). I interaktionen model, værdien for den enkelte variabel er en konstant værdi på de andre variable. I dette tilfælde resultaterne for de tre variable var de samme i form af betydning, men en signifikant interaktion ErbB2-IR x AR-IR (positiv) blev returneret. Med andre ord, når variable holdes konstant, er der en påvirkning af kombinationen af ​​ErbB2-IR x AR-IR, således at jo højere scorer, jo højere tumor fase nummer. De logit og odds forholdet værdier for de fire niveauer af reaktion (niveau 1 bliver referenceniveauet) ved forskellige ErbB2-IR og AR-IR scores er vist i tabel S1 til at illustrere dette punkt for de læsere godt bekendt med denne statistisk metode.

dataene i Ricciardelli et al. [21], og den foreliggende undersøgelse er i overensstemmelse med, men ikke bevis for, en vekselvirkning mellem androgen signalering og ErbB2 udtryk. Beviset kræver brug af eksperimentelle modeller. Androgen fjernelse påvirker ErbB2-ekspression i tumorcellelinjer [8] og i xenograftmodeller [9]. Det vides ikke, imidlertid, om denne regel er begrænset til tumorceller eller ses også i intakt prostata væv efter store variationer i cirkulerende testosteron niveauer. For at afgøre, om lignende regulerende virkninger blev set i den normale prostata blev ErbB2 udtryk på mRNA niveau i dette væv målt ved qPCR følgende kastration hos rotter og derefter genindsættelse af cirkulerende androgen niveauer ved testosteron indsprøjtning. De observerede resultater (. Fig 3) er i overensstemmelse med de tumor undersøgelser ovennævnte

Data er normaliseret A. ß-actin.; B, Rpl13a. Forkortelser: d pc, antal dage efter kastration T, testosteron. Vist er de individuelle værdier (n = 6 pr gruppe); de udfyldte søjler angiver medianer. I begge tilfælde, Kruskal-Wallis test viste en signifikant variation mellem grupperne (P 0,0001).

prognostiske værdi af tumor ErbB2-IR

I alt 255 sager scorede for tumor ErbB2-IR blev efterfulgt af den forventede efter diagnosen, idet dette er den normale behandling på det tidspunkt. I disse tilfælde kan den naturlige progression af sygdom, følges, og indflydelsen fra en biomarkør ved udfald kan undersøges. Generelt er en cut-off værdi af biomarkør valgt, og resultatet sammenlignes mellem tilfælde under og over cut-off bestemmes i overlevelse analyser, såsom Cox proportionel risiko regressions analyse og Kaplan-Meier plot. Afskæringsværdierne kan være vilkårlig, såsom en simpel median splittelse af data, eller defineret på grundlag af en statistisk analyse. En sådan fremgangsmåde er anvendelsen af ​​Receiver Operating Karakteristisk (ROC) analyser, hvilket plot for alle mulige afskæringsværdier den sande positive rate (følsomhed) vs. falsk positiv-raten (1-specificitet). For en ROC-kurve med et areal under kurven [AUC] signifikant større end 0,5 (ingen prognostisk værdi), den optimale afskæringsværdi (den Youden indeks, der repræsenterer den afskårne der giver den højeste værdi for følsomhed + specificitet – 1 ) kan beregnes (se [22] for beskrivelse). En ROC-kurve med en grænse på 15 år indikerede en betydelig prognostisk værdi af tumor ErbB2-IR (Areal under kurven [AUC] 0,60, P 0,05), og var på division ≤2.75 og 2,75. Til sammenligning ROC arealet under kurven for tumoren Ki67 indekset var 0,75 (P 0,0001) og så en værdi på 0,60, omend betydelig, er ikke så imponerende. Den ikke-maligne basal og luminale ErbB2-IR scores manglede prognostisk værdi (AUC≤0.55, P≥0.4).

I teorien er det muligt, selv om AUC for tumor ErbB2-IR er beskeden, det kunne bidrage til en kombination af markører med nyttige prognostisk værdi. For at undersøge denne mulighed, er der truffet to fremgangsmåder, ved hjælp af tumor ErbB2-IR sammen med tre andre tumormarkører (Ki67 indeks, epithelial AR-IR og Pakt). Dataene er blevet normaliseret, således at den maksimale score i hvert tilfælde er 100%, og i tilfælde af AR er resultaterne blevet udtrykt som 100-normaliseret score, eftersom en lav, snarere end en høj, er AR-IR forbundet med en dårlig prognose [15]. Forskellige kombinationer blev testet, men ingen gav en forbedring, der ses med Ki67 alene (tabel S2). ROC kurver gav lige vægtning af de forskellige biomarkører, og så i teorien en optimal vægtning kunne have været savnet. Følgelig blev en binær logistisk regressionsanalyse af det kliniske resultat som afhængig variabel undersøgt under anvendelse af de samme parametre. Den bedste kombination af parametre i form af korrekt forudsige død som følge af Pca var ~~23% og medtagelse af ErbB2 ikke forbedre dette tal (tabel S3). Til sammenligning Gleason score havde en forudsigelse på 55,6% (Nagelkerke R

2 værdi 0,419) på eget og 45,6% (Nagelkerke R

2 værdi 0,401) i kombination med AR-IR + Ki67-IR ( data ikke vist).

en univariate Cox proportionel risiko regressionsanalyse med sygdomsspecifikke overlevelse som endepunkt viste, at den relative risiko for tilfælde med en tumor ErbB2-IR score over den optimale cut-off, som defineret af Youden indeks, var cirka det dobbelte for dem under cut-off værdi (Exp (B) værdien vist i tabel 4). Den univariate analyse tager ikke højde for eventuelle forstyrrende variabler. Fra de tidligere resultater, der præsenteres i dette papir, Ki67 er et oplagt confounder, og en Bivariate Cox proportionel risiko regressions analyser indikerede, at tumor ErbB2-IR ikke give yderligere prognostisk information, der ydes af enten tumoren Ki67 indekset (tabel 3). Med hensyn til klinisk anvendelighed, ville en markør være af interesse, hvis det gav oplysninger ud over, der tilbydes af Gleason score. Men analyser en Bivariate Cox proportionel risiko regressions styrer for Gleason score (tre grupper: 4-6, 7 og 8-10), at den prognostiske værdi af tumor ErbB2-IR ikke længere forblev signifikant (tabel 4). I overensstemmelse hermed Kaplan-Meier-kurver for alle tilfælde efterfulgt af forventet viste en signifikant prognostisk effekt af tumor ErbB2-IR (Fig 4A), og i tilfælde med Gleason scorer 4-6 (fig. 4B). Imidlertid blev en signifikant prognostisk effekt ikke ses for tilfælde med Gleason scorer 6 alene (Fig 4C), Gleason scorer 7 alene (Fig 4D, omend grænser op betydning) eller til tilfælde med Gleason score 8-10 (Fig. 4E).

antallet af sager, hvor dødsfald skyldtes prostatakræft er angivet som

† Pca i figuren. De luger på linjer viser censurerede data (dvs. andre end døden tilfælde på grund af prostatakræft). Rækken af ​​Gleason score (GS) for patienterne er vist i hvert panel.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt sammenhængen mellem ErbB2-IR med sygdommens sværhedsgrad ved diagnose og med sygdom resultat i et godt karakteriseret væv microarray [12]. Der er en stor mængde arbejde vedrørende prognostiske værdi af ErbB2 i Pca (bedømmelse, se [11]), men den nuværende undersøgelse giver nye oplysninger i to vigtige henseender: For det første er de data i tilfælde, som ikke havde modtaget nogen kræft behandling før prøveudtagningen foretages, da de blev diagnosticeret efter transuretral resektion for lavere urinvejssymptomer. Derudover, da den normale behandling på det tidspunkt var forventet, den lange opfølgning brugte tillader undersøgelse af det naturlige forløb af sygdommen. Dette er særdeles værdifuld for evaluering biomarkører. For det andet har tilgængeligheden af ​​data upon AR i de samme prøver tilladt en undersøgelse af de indbyrdes forbindelser mellem ErbB2 og AR udtryk i tumorer. Generelt vores resultater er i god overensstemmelse med litteraturen. Med hensyn til forskelle i vævet ekspression af ErbB2, Lyne et al. [23] rapporterede, at procentdelen af ​​enheder med moderat til stærk ErbB2 immunoreaktivitet var 100 for benign prostata basale celler, 11 for benign prostata luminale celler, 0 for benign prostata stroma, 87 for prostata intraepitelialneoplasi og 82 for prostatakræft. I den foreliggende undersøgelse, vi ikke observere ErbB2-IR i stroma, og antallet (med% i parentes) i tilfælde med ErbB2-IR scores ≥3 var 196/222 (88%), 39/222 (18%) og 201/357 (56%) for ikke-maligne basale, luminale og tumorprøver henholdsvis.

i tumorprøverne, ErbB2-IR var signifikant associeret med både celleproliferationen Ki67 og immunoreaktiviteten af ​​Pakt den phosphorylerede form af overlevelsesfaktor Akt. Foreningen med Ki67 er i overensstemmelse med en stor undersøgelse med prøver opnået ved radikal prostectomy, hvor den gennemsnitlige Ki67 mærkning indeks var højere for de 388 ErbB2-positive tumorprøver end for 1940 ErbB2-negative prøver (6,1 vs. 4,3 henholdsvis [21].