PLoS ONE: LGR5 er en negativ regulator af tumorigenicitet, antagoniserer Wnt Signalering og Regulerer Cell Adhæsion i Kolorektal Cancer Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

LGR5 (Leucin-rige repeat-holdige G- protein-koblet receptor 5) er den mest etablerede markør for intestinale stamceller. Mus modeller viser, at LGR5 + celler er de celler, oprindelseslande tarmkræft, og LGR5 udtryk er forhøjet i humane kolorektal kræft, men meget lidt er kendt om LGR5 funktion eller dens bidrag til stamcelle-fænotype og til kolorektal cancer.

vigtigste resultater

Vi har moduleret ekspression af LGR5 af RNAi (hæmmende RNA’er) eller overekspression i kolorektale cancer cellelinjer. Paradoksalt ablation af LGR5 inducerer øget invasion og forankringsuafhængig vækst, og forbedrer tumorigenicitet i xenotransplantater eksperimenter. Omvendt overekspression af LGR5 øger celleadhæsion, reducerer clonogenicity og dæmper tumorigenicitet. Expression profilering afslørede forøget Wnt signalering og opregulering af EMT-gener ved knockdown af LGR5, med modsatrettede ændringer i LGR5 overudtrykker celler. Disse resultater tyder på, at LGR5 er vigtigt at begrænse stamceller til deres niche, og at tab af LGR5 samtidig med aktiveret wnt signalering kan bidrage til den invasive fænotype af kolorektale karcinomer

Henvisning:. Walker F, Zhang HH, Odorizzi a, Burgess AW (2011) LGR5 er en negativ regulator af tumorigenicitet, antagoniserer Wnt Signalering og Regulerer Cell Adhæsion i kolorektal kræftceller. PLoS ONE 6 (7): e22733. doi: 10,1371 /journal.pone.0022733

Redaktør: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Frankrig

Modtaget: Februar 3, 2011; Accepteret: 4 Juli 2011; Udgivet: 28 juli 2011

Copyright: © 2011 Walker et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev delvist finansieret af NHMRC Program Grant nummer 487922. Finansiering støtte til AO blev også leveret af Pezcoller Foundation, Trento, Italien. Dette arbejde blev også støttet af det operationelle Support Infrastructure Program fra den victorianske regering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

begrebet kræft stamceller (CSCS: gennemgået af [1]) skyldes heterogenitet fleste solide tumorer og deres modstand mod kemoterapeutiske regimer: ifølge dette koncept, efter behandling en resterende population af multiresistent kræft stamceller vil overleve og hurtigt formere genetablere tumorerne ([2]). Den relative resistens over for kemoterapeutisk lægemiddel er blevet tilskrevet hviletilstand eller langsom proliferation af CSCS, en egenskab deles med normale stamceller (se for eksempel [3]). Støtte for eksistensen af ​​human CSCS er tilstedeværelsen inden tumorerne, af cellulære delmængder udtrykker proteiner normalt kun findes på stamceller og tabt efter differentiering; disse proteiner er blevet anvendt til at berige for de formodede CSCS i forskellige tumortyper, og at bevise, at tumorceller beriget for disse markører giver anledning til tumorer med større effektivitet end den fravalgt befolkningen [4]. I betragtning relevansen af ​​CSCS til tumorudvikling og metastase [5], [6], mere effektive tumor behandlingsformer kræver et bedre kendskab til de særlige kendetegn ved denne delmængde af kræftceller og de faktorer, ydre og indre, som bidrager til deres ‘stemness’ . Vurdering af relevans og fysiologiske rolle af “stamcelle markører” til stamcelle-fænotype vil øge vores forståelse af CSCS og bør hjælpe med at udforme selektive terapier.

I tilfælde af kolorektal cancer stamceller (CCSC) på nuværende de bedst karakteriserede “stamcelle” markører er overfladeantigenerne CD133 [4], [7] CD166 [8], CD44 og CD24 ([9], [10] (Anmeldt af [11]). Intracellulære markører for CCSCs omfatter Musashi-1 ([12], [13]), Bmi-1 [14] og ALDH [15] (revideret i [16]. Men de mest selektive og lovende markør for stamceller i tarmepitel og tarm cancer stamceller er LGR5 [17] (UniProt tiltrædelse # O75473; UniGene # Hs.658889, også kaldet GPR49) ved normal tarm LGR5 udtryk er begrænset til stamcelle zone i bunden af ​​krypten [18] og enkeltceller fra. tyndtarmen udtrykker LGR5 kan generere strukturer ligner tarm krypter “in vitro” [19], [20]. vigtigst er det, Barker et al. [21] har vist i musemodeller, som intestinale tumorer opstår fra LGR5 positive celler, tyder det mærker de intestinale cancer stamceller. LGR5 er overudtrykt i humane kolorektale adenomer og carcinomer i forhold til normal slimhinde [22]: dermed LGR5 overekspression detekteres fra de tidlige stadier af kolorektal tumorudvikling. LGR5 er en wnt målgen [23], og den wnt pathway aktiveres tidligt i udviklingen af ​​de fleste kolorektale cancere gennem trunkeringer af APC (adenomatøs polypose Coli) og, mindre hyppigt, mutationer af β-catenin (gennemgået af [24 ]). Det er imidlertid uklart, hvorvidt LGR5 opregulering i kolorektal cancer celler bidrager væsentligt til tumorudvikling gennem vedligeholdelse af kolorektal CSC, eller er simpelthen en afspejling af aktiveret Wnt signalering, uden direkte funktionel rolle.

Der vides kun lidt om LGR5 funktion i udvikling og carcinogenese. LGR5 er en “orphan” receptor tilhører G-protein-receptor koblet (GPCR) familie [25]; dets ligand og tilstanden af ​​intracellulær signalering i øjeblikket uklare [26]. Knockout af LGR5 i mus resulterer i neonatal dødelighed forbundet med kraniofaciale defekter (ankyloglossia) [27]. En grundig undersøgelse af Garcia et al [28] af prænatal tarm udvikling i GPR49-LacZ mutant mus (LGR5 null) viser, at tabet af LGR5 ikke påvirker proliferation eller migrering af tarmceller. Men forfatterne bemærkede en stærk induktion af Paneth celledifferentiering i LGR5 knockout embryoer, og en molekylær signatur karakteristisk for opreguleret Wnt signalering.

Som LGR5 synes at være en markør for CCRCs har vi undersøgt, hvilke parametre for cellevækst og differentiering er påvirket af modulering af LGR5 udtryk i kolorektale cancer cellelinjer. På grund af den funktionelle redundans af mange signalmolekyler og de stærke feedback-sløjfer, der opretholder homøostase, disse undersøgelser er vanskeligt at fortolke i dyremodeller, mens lave transfektionseffektiviteter og restriktioner på langsigtede kultur forebygge disse studier i humane primære tumor prøver. For at omgå disse vanskeligheder har vi brugt to kolorektale carcinoma cellelinier, LIM1215 [29] og LIM 1899 [30] som et modelsystem. Vores resultater viser, at LGR5 lyddæmpning og overekspression har modsatrettede virkninger på cellefænotype, herunder forankringsuafhængig vækst, migration og tumordannelse som xenotransplantater i mus. Paradoksalt nok, undertrykkelse af LGR5 udtryk øger tumorudvikling og er knyttet til en mere mesenchymal fænotype. En undersøgelse af de genekspressionsmønstre efter graduering af LGR5 cellulære niveauer ved siRNA knockdown eller transgen overekspression viser, at tabet af LGR5 opregulerer wnt respons gener og centrale EMT pathway gener; Omvendt overekspression af LGR5 favoriserer celle-celle adhæsion. Disse resultater understreger betydningen af ​​LGR5, ikke blot som markør for kolorektale tumorceller, men som en regulator af wnt reaktioner, celle motilitet og celle-celle adhæsion.

Resultater

LGR5 udtrykkes i kolorektale cellelinjer med β-catenin mutationer og opreguleret af wnt stimulation i celler med APC-mutationer

kolorektale tumorer og er karakteriseret ved mutationer i wnt pathway signalering komponenter [31], [32], [33], hovedsagelig APC og β-catenin, hvilket fører til disreguleret eller celle-selvstændige reaktioner på wnt. LGR5 overudtrykkes i primære colorektale tumorer [34], [35]: overekspression kunne tænkes at skyldes berigelse af ‘stamceller-lignende “celler, til opregulering af Wnt signalvejen, og /eller til Wnt pathway-afhængig vedligeholdelse af’ stemness “. Vi udnyttede et panel af tidligere karakteriserede humane kolorektal carcinom-cellelinier [33] for at sammenligne LGR5 ekspression til ekspression af en anden putativ intestinal stamcellemarkør, Musashi-1 (MSI-1) [36], [12], [37]. Celler, der udtrykker høje niveauer af LGR5 normalt ikke udtrykker høje niveauer af Msi-1 og omvendt (fig. 1A). Interessant vi registreret forhøjede niveauer af LGR5 mRNA kun i cellelinier, der bærer β-catenin-mutationer (figur 1A). Højden af ​​LGR5 i p-catenin mutantceller er slående, hvilket antyder, at mutations-aktivering af β-catenin er ansvarlig for overekspression af LGR5, mens mutation af APC ikke er tilstrækkelig til at inducere detekterbar LGR5 ekspression i disse cellelinier. For at teste wnt afhængighed af LGR5 udtryk, vi stimulerede cellerne med L-celle afledt Wnt3a, wnt5a eller kontrol konditioneret medie. LGR5 og Musashi-1-mRNA-niveauer blev testet parallelt af QRT-PCR 12 timer efter stimulering (fig. 1B). Som forventet LGR5 ekspressionsniveauer er uændret ved Wnt3a stimulation i β-catenin mutant cellelinie LIM1899 men selektivt opreguleres ved Wnt3a i APC-mutante cellelinier LIM 2537, LIM 2405 og Lim1863 (fig. 1B, venstre panel). Wnt stimulation påvirkede ikke ekspressionsniveauerne for Msi-1 i nogen af ​​cellelinierne testet (fig. 1B, højre panel). Opregulering af LGR5 af kanoniske wnt signalering i reagerende cellelinier blev bekræftet ved immunofarvning med en valideret antistof til LGR5 (fig. S1A). I disse forsøg blev maksimale niveauer af LGR5 protein observeret 48 timer efter stimulering af cellerne med Wnt3a, mens hverken wnt 5a eller L-celle-konditioneret medium-induceret LGR5 ekspression (fig. S1B og data ikke vist). Således forhøjede niveauer af LGR5 i kolorektal kræftceller vil sandsynligvis være sekundær til aktiveret kanoniske wnt signalering, og mutationer i β-catenin bypass kravet om eksogene ligander. Vi har tidligere vist, at LIM cellelinjer med heterozygote APC-mutationer svagt har aktiveret wnt signalering som følge af autokrine produktion af kanoniske wnts [33]: manglen på LGR5 overekspression i disse celler i fravær af eksogene Wnt3a foreslå en tærskel effekt for LGR5 induktion.

A) Expression niveauer for LGR5 og Msi-1 blev bestemt ved QRT-PCR som beskrevet i Methods. Resultaterne præsenteres som genekspression i forhold til den endogene kontrol HPRT inden for hver cellelinie. Celler er grupperet efter deres β-catenin eller APC mutationsstatus. B) Cellelinjer der bærer β-catenin-mutationen (LIM 1899) eller APC-mutationer (LIM2537, LIM2405, LIM1863) blev stimuleret i 12 timer med dyrkningsmedium (ingen stimulus), med konditioneret medium fra L-celler, der udtrykker wnt 3a eller wnt 5a, eller med ikke-transficeret L-celle-konditioneret medium (kontrol CM). Ekspression af LGR5 (venstre panel) og Musashi-1 (højre panel) blev bestemt ved QRT-PCR som beskrevet i Methods. For hver cellelinie, søjler repræsenterer udtryk niveau stimuleret i forhold til ikke-stimulerede celler.

Modulation af LGR5 udtryk har dybtgående virkninger på clonogenicity og tumorudvikling

Hvis overekspression af LGR5 i kolorektal cancer celler medieres af hyper-aktiverede wnt pathway, hvilken rolle LGR5 spille i wnt responser, og gør ekspression af LGR5 bidrage til opretholdelsen af ​​”kræft stemness”? For at løse den funktionelle relevans LGR5 udtryk i CRC-cellelinjer, vi reduceret sit udtryk i celler der bærer en β-catenin mutation (LIM1215 og LIM1899) ved hjælp af hæmmende RNA. Vi oprindeligt anvendt lentiviral transduktion af shRNA (short hairpin RNA) til LGR5. Som kontroller, vi brugte shRNAs rettet mod tilfældige sekvenser (uden for målgruppen, NT), eller til Msi-1. Musashi-1 udtrykkes i umodne intestinale celler [12], [37] og overudtrykkes i kolorektale tumorer [35], men er ikke en wnt-respons-gen (fig. 1B). Vi brugte fire separate shRNA konstruktioner for hvert mål gen: alle var effektive, og blev gennemført efterfølgende eksperimenter ved hjælp af den mest effektive shRNAs. Transducerede celler blev hovedparten valgt i puromycin i to uger for at berige for de shRNA-udtrykkende celler, derefter om antibiotika-fri medier til funktionel karakterisering. Knockdown effektivitet blev overvåget ved QRT-PCR og celleproliferation blev analyseret under anvendelse MTT-assays og kolonidannelse i blød agar. Lentiviral levering af shRNA til LGR5 eller Musashi-1 var effektivt i begge cellelinier og føre til en markant og specifik reduktion i ekspression af målgener (fig. 2 A, B, B). Ekspressionsniveauerne for de beslægtede gener LGR6 og Msi-2 var upåvirket (data ikke vist). Vi bekræftede tab af LGR5 protein efter knockdown hjælp immunofluorescens (Fig S2.), Som LGR5 antistoffer er ikke egnede til påvisning af endogene niveauer af dette protein ved Western Blot

A) og B):. LIM1215 (A ) og LIM1899 (B) celler blev transduceret med lentivirale partikler indeholdende shRNA til ikke målsekvenser (NT), til LGR5 (shLGR5) eller til Musashi-1 (shMsi-1) og bulk valgt i puromycin. Ekspression af LGR5 (venstre paneler) og Musashi-1 (højre paneler) blev vurderet ved QRT-PCR to uger efter transduktion. Data er præsenteret som genekspression i forhold til de parentale cellelinier. Disse resultater er repræsentative for 5 separate forsøg. C): Celler, der udtrykker shRNAs (shLGR5, shMsi-1 og NT) og parentale celler blev dyrket i antibiotisk medium i tre dage og derefter testet for deres evne til at danne kolonier i blød agar som beskrevet i Methods .. Data er præsenteret som koloni danner effektiviteten af ​​prøver i forhold til at styre (utransficerede) forældrenes celler og er gennemsnittet og sd af tre separate eksperimenter. D): Repræsentative billeder af kolonier i blød agar plader farvet med krystalviolet. Billeder blev erhvervet med et Nikon 90i med en DXM 1200C kamera.

Knockdown af enten LGR5 eller Msi-1-niveauer påvirker ikke væksten af ​​celler som vedhængende monolag (fig. S3A), men tab af LGR5 og Msi-1 havde markante og modsatrettede virkninger på clonogenicity af cellerne i blød agar (fig. 2C). Knockdown af Musashi-1 fører til en reduktion i kolonidannende evne både LIM1215 og LIM1899 celler, konsistent med tabet af proliferation og tumor dannende evne kolorektal cellelinie HCT116 efter nedregulering af Msi-1 som beskrevet af Sureban et al [ ,,,0],13]. I modsætning hertil tab af LGR5 forårsagede en reproducerbar og dybtgående

øge

i clonogenicity af både LIM1215 og LIM1899 (fig. 2 C, D). Disse virkninger på kolonidannelse blev observeret konsekvent i begge cellelinier og anvendelse af to separate, LGR5-specifikke shRNA konstruktioner.

Udvælgelse af cellerne i puromycin kunne have ført til ændringer i ekspressionen af ​​andre end LGR5 gener, bidrager til dette overraskende resultat. Vi gentog Knockdown eksperimenter under anvendelse af forbigående ekspression af Cy3-mærket siRNA (small hairpin RNA) til LGR5. Celler blev transficeret med konstruktionerne og ekspressionen af ​​Cy3-mærket siRNA blev overvåget ved fluorescensmikroskopi. Transfektion effektivitet, vurderet af Cy3 udtryk ved hjælp af fluorescens mikroskopi, var 80% i LIM1899, men 20% i LIM1215; . Derfor blev udført efterfølgende eksperimenter ved hjælp LIM1899 celler

Knockdown af LGR5 af siRNA var meget effektiv ( 90%) (. Figur 3A) og specifik. Vigtigere, shRNA og siRNA knockdown af LGR5 havde identiske virkninger på clonogenicity af LIM1899, der bekræfter, at dette fænotype er resultatet af LGR5 nedregulering og er ikke et artefakt i udvælgelsesprocessen (fig. 3B).

LIM1899 celler blev transficeret med vektor, der udtrykker Cy3 (Cy3) eller Cy3-siRNA til LGR5 (Cy3 siLGR5). A) LGR5 udtryk ved QRT-PCR i utransficerede celler (forældre) og celler transficeret med Cy3 eller Cy3-siRNA til LGR5. Plots repræsenterer LGR5 ekspression af prøver i forhold til den parentale (ikke-transfekteret) cellelinie. B) LIM 1899 celler blev udpladet i blød-agar to dage efter transfektion ved 5 x 103 celler /ml og dyrket i 10 dage. Koloni numre blev vurderet efter farvning med krystalviolet anvendelse af et dissektionsmikroskop. Plots repræsenterer koloni nummer i prøveemner i forhold til forældrenes celler. Stigningen i koloni numre ved nedregulering af LGR5 er yderst signifikant (*** = p 0,0001 ved den uparrede t-test). For begge paneler data er middelværdi og SD af tredobbelte prøver, og er repræsentative for mindst 3 separate eksperimenter.

Da et fald i LGR5 niveauer specifikt øger clonogenicity af kolorektale cancer cellelinjer, vi undersøgt, om LGR5 overekspression ville reducere væksten af ​​disse celler i blød agar ved at udføre både transient og stabil overekspression af LGR5 i kolorektale cellelinjer. Vi valgte at bruge de samme cellelinier for både lyddæmpning og overekspression af LGR5 for at minimere ikke-LGR5 specifikke ændringer i cellulære parametre. Mens denne strategi risikerer at undervurdere virkningerne af LGR5 overekspression, det tillader en direkte sammenligning mellem transficerede celler og letter fortolkningen af ​​ekspression profilering.

LIM1899 og LIM1215 celler blev transficeret med pTUNE vektor indeholdende det humane LGR5 sekvens flankeret af myc og flag sekvenser. Effektiviteten af ​​transfektion til LIM1899 varierede i disse forsøg mellem 30 og 60% som vurderet ved immunofarvning af cellerne med anti-FLAG-antistoffer, mens transfektionseffektiviteten var mellem 10-20% for LIM1215 celler: derfor efterfølgende eksperimenter blev udført i LIM1899 celler . Overekspression af flag-mærket LGR5 i transfekterede celler blev bekræftet ved QRT-PCR og ved immunfluorescens hjælp af anti-flag og anti-LGR5 antistoffer (Fig. 4 A, B). Overudtrykkes LGR5 var til stede både i cytosolen og i plasmamembranen; med akkumulering i punktformet strukturer (fig. 4A). Denne fordeling svarer til fordelingen af ​​endogent LGR5 i kolorektale cancerceller efter wnt stimulation (Fig. S2). Den pTune Systemet er designet til IPTG- inducerbar ekspression af proteiner, men høje niveauer af ekspression var til stede i fravær af IPTG, med kun en moderat stigning efter induktion (fig. 4 B). Overekspression af LGR5 i LIM1899 resulterede i et betydeligt tab af koloni-dannende evne i blød agar (fig. 4C) uden at påvirke spredning under vedhængende betingelser (fig. S3). Parallel transfektion af cellerne med Cy3-siRNA til LGR5 forårsagede den forventede stigning i koloni numre i samme assay (fig. 4C). Stabile cellelinier der overudtrykker LGR5 blev dannet ved udvælgelse af de transficerede celler i neomycin: LGR5 ekspression i disse cellelinier, som vurderet ved QRT-PCR og immunfluorescens, blev øget signifikant (. Fig S4 A, B), og blev omvendt korreleret med clonogenicity i blød agar (fig. S4 C, D). Således LGR5 modulation har konsistente og specifikke virkninger på clonogenicity af kolorektale cancer cellelinjer.

LIM1899 celler blev transficeret med pTune vektor indeholdende humant LGR5 flankeret af et flag sekvens og analyseret 3 dage efter transfektion. A) konfokal mikroskopi: LIM 1899 celler transficeret med pTune /LGR5 blev co-farvet med anti-FLAG (M2) antistof efterfulgt af Alexa488 anti-muse-Ig (grøn), anti-LGR5 antistof HPA012530 efterfulgt af Alexa 546 anti-kanin Ig ( rød) og den nukleare pletten DAPI. Vist er en fusioneret billede (alle kanaler) og gråtonebilleder af de grønne og røde kanaler, hhv. Konfokal mikroskopi blev udført som beskrevet i Fremgangsmåder. B) QRT-PCR: utransficerede celler (parentale) og celler transficeret med LGR5 ekspressionsvektoren blev dyrket i tre dage med eller uden IPTG (100 uM). RNA-ekstraktion og QRT-PCR blev udført som beskrevet i Methods. Grafen viser niveauet af ekspression af LGR5 i transficerede forhold til parentale celler. Data er gennemsnittet +/- SD af tredobbelte prøver, og er repræsentative for 3 separate eksperimenter. C) klongenicitetsassayet: utransficerede celler og celler transficeret med pTune /LGR5 eller med Cy3-siRNA til LGR5 blev podet i bløde agar plader ved 5 x 103 celler /plade som beskrevet i Methods. IPTG (100 uM). blev tilsat til tredobbelte plader til kun parentale og LGR5-udtrykkende celler. Plader blev inkuberet i 10 dage og derefter farvet med krystalviolet og talte kolonier med et dissektionsmikroskop. Grafen viser midler og standardafvigelse for tre separate forsøg, hver normaliseret til kolonien numre for parentale celler. Forskellen mellem forældre og transfekterede celler er meget signficant (** = p 0,005 og *** = p 0,001 for de to dyrkningsbetingelser)

Clonogenicity i semi-faste medier af tumorceller. ofte korrelerer med deres evne til at danne tumorer i immunsvækkede mus. Vi anvendte en xenograft model til at teste, om modulation af LGR5 påvirker tumorigenicitet af LIM1899 celler. LIM1215 blev ikke testet i dette system, da det er både dårligt tumorigen som xenograft og transfects med meget lav effektivitet. LIM1899 celler blev udvidet og transficeret i løs vægt med Cy3-siRNA til LGR5 eller med pTune-LGR5. Transficerede og forældrenes celler blev udvidet til to dage, derefter høstet til parallel bestemmelse af LGR5 udtryk ved QRT-PCR, clonogenicity “in vitro” og tumor-dannende kapacitet “in vivo” (fig. 5). Andelen af ​​transficerede celler, overvåges ved fluorescensmikroskopi for Cy3siRNA ekspression og immunfarvning med anti-flag antistof til LGR5 overekspression, var 80% og 60%, hhv. De celler, der anvendes til xenotransplantaterne havde den forventede reduktion eller stigning i LGR5mRNA (Fig 5B.): Undertrykkelse af LGR5 udtryk varede i op til to uger i celler behandlet med siRNA, mens overekspression af LGR5 var vendt tilbage til baseline efter 14 dage (fig. 5C). Den clonogenicity af cellerne, der anvendes i xenotransplantater var omvendt proportional med niveauet af ekspression af LGR5 (fig. 5D). Celler, der udtrykker siRNA til LGR5 viste forbedret tumordannelse; Omvendt celler, der overudtrykker LGR5 var mindre tumorigen (fig. 5A, B). Forskellen i tumorstørrelse mellem LGR5 knockdown og de parentale celler var stærkt signifikant (p 0,0001) på alle tidspunkter, men væksten af ​​tumorer overudtrykker LGR5 afveg væsentligt fra parentale celler kun for de første 10 dage af xenotransplantater eksperiment (fig . 5A). Forskellen i stabiliteten af ​​ekspressionen af ​​siRNA til LGR5 vs. LGR5 konstruktion (fig. 5C) er i overensstemmelse med de langsigtede virkninger af LGR5 nedregulering og mere forbigående virkninger af LGR5 opregulering på xenotransplantaterne. Vi observerede meget god korrelation (R = 0,996) mellem clonogenicity i blød agar og tumorigenicitet (fig. 5D), hvilket bekræfter gyldigheden af ​​førstnævnte som en erstatning assay.

LIM1899 celler blev mock transficeret (ingen vektor), transficeret med Cy3LGR5 eller med pTune /LGR5. Celler blev ekspanderet til to fordoblinger (48 timer) efter transfektion derefter indsamlet til inokulering i nøgne mus, bestemmelse af vækst i blød agar og måling af LGR5 ekspression ved QRT-PCR som beskrevet i Methods. A) Venstre panel: implanteret tumor vækstkurver, højre panel: tumor masse på day18. Væksten af ​​subkutane tumorer blev målt tre gange om ugen ved hjælp skydelærer, og volumen bestemmes ved formlen V = 1/2 (længde × bredde

2). Ved slutningen af ​​forsøget (dag 18) tumorer blev dissekeret og vejet. Dataene er gennemsnit og standardfejl for hver gruppe (16 tumorer /gruppe). Der var ingen statistisk forskel mellem forældrenes og pTune Lgr5 tumor masse, men forskellen mellem forældrenes og siLGR5 tumorer er signifikant (*** = p 0,001). B) En prøve af celler til xenotransplantat injektion blev testet ved QRT-PCR for LGR5 ekspression. Data blev analyseret i ABI 7300 (ΔΔCt undersøgelse), og præsenteres som LGR5 udtryk i forhold til forældrenes celler. Data er præsenteret som middelværdier og standardafvigelser. C) Tidsforløb for transgen ekspression i dyrkede LIM 1899. udtryk for LGR5 i celler transficeret med siLGR5 eller pTune LGR5 blev fulgt over en periode på to uger ved QRT-PCR. Niveauer af LGR5 ekspression præsenteres i forhold til vektor kontrol for hvert af de tidspunkter. D) En prøve af celler til xenotransplantatet eksperiment blev dyrket i bløde-agarplader ved 5 × 10

3 celler /plade for at bestemme kloning effektivitet. Plader blev inkuberet i 10 dage, derefter farvet med krystalviolet og koloni numre bestemt ved lysmikroskopi. *** = P 0,001. E) Sammenhæng mellem tumor masse (graf A) og kloning effektivitet (graf D).

Vi analyserede de subkutane tumorer for LGR5 udtryk ved hjælp af immunfluorescens. Repræsentative billeder af tumorerne farvet med heamatoxilin og eosin (A), eller co-farvet med LGR5 og β-catenin (immunofluorescens billeder) er vist i fig. 6. Morfologisk, alle tumorer bestod af veldefinerede kirtler, og kunne klassificeres som moderat differentierede adenokarcinomer (Fig. 6A). Tumorer afledt siLGR5 LIM1899 tendens til at have en mere uorganiseret morfologi, afspejles i den subtile, men signifikant forskel i antallet af velformede kirtler pr felt mellem forældrenes tumorer (26 +/- 3 n = 16) og siLGR5 tumorer (15 + /-2 n = 16; p = 0,0014). Antallet af kirtler pr felt blev øget i tumorer overekspression LGR5 (31 +/- 2, n = 16), men forskellen fra forældrenes tumorer var ikke statistisk signifikant. I alle tumorprøver LGR5 farvning var mest fremtrædende i de kirtler, især mod kirtel lumen, og var svagere i de mere amorfe områder af tumor (fig. 6B). Farvning for LGR5 var specifik, da intet signal blev påvist i prøver inkuberet med normalt kaninserum (fig. 6C). LGR5 immunoreaktivitet blev marginalt forhøjet i tumorer afledt LIM1899 celler transficeret med pTune LGR5, men ikke i alle områder af tumorer. LGR5 farvning blev reduceret, men ikke helt fraværende, i tumorer afledt af LIM1899 celler transficeret med siLGR5. I disse prøver, syntes LGR5 udtryk begrænset til de glandulær strukturer (fig. 6B).

A) Haematoxilin og eosin farvning af frosne snit fra repræsentative tumorer genereret fra forældrenes LIM1899, LIM1899 transficeret med siRNA til LGR5 eller LIM1899 transficeret med pTune-LGR5 konstruere. Lysfelt billeder blev erhvervet på et Nikon 90i mikroskop med en 20 × linse. B) Konfokal billeder af frosne snit farvet med antistoffer mod p-catenin (rød), LGR5 (grøn) eller DNA-farve DAPI (blå). Alle billeder er Z-stakke af konfokale sektioner. For hvert sæt, det øverste panel viser de tre kombinerede pletter, den midterste panel LGR5 (gråtoner), og bundfeltet β-catenin (gråtoner). Billeder blev opnået på et Nikon C1 konfokalt mikroskop med en 60 x olie linse. C) Specificitet kontrol for LGR5 farvning: frosne snit blev farvet med antistof mod p-catenin og normalt kaninserum, efterfulgt af Alexa 488 anti-kanin Ig (grøn) og Alexa 546 anti-muse-Ig (rød) og den nukleare pletten DAPI ( blå). Den grønne kanal (NRS) og rød kanal (β-catenin) vises særskilt gråtoner. Billeder blev opnået som i B).

Cell-celle vedhæftning og migration er reguleret af LGR5 niveauer

LGR5 niveauer har dybtgående virkninger på den forankring uafhængige spredning af kolorektal cancer celler ‘i vitro “og” in vivo “; men hvordan LGR5 modulerer forankringsuafhængig vækst er uklar. Vi observerede, LIM1899 celler, der overudtrykker LGR5 tendens til at vokse i kolonier ‘med stramme celle-til-celle kontakter, mens LIM1215 og LIM1899 celler med reduceret LGR5 er mere diffus på plastoverfladen (ikke vist). De modsatte fænotyper observeret efter knockdown eller overekspression af LGR5, og deres sammenhæng i forbigående og stabile ekspressionssystemer, viser, at dette fænomen er direkte korreleret til LGR5 niveauer. Således kan LGR5 modulere balancen mellem celle-celle- og celle-substrat-adhæsion. Til karakterisering cellematrixkonstruktion og celle-celle-interaktioner dyrkede vi celler som sfæroider i hængende dråber [38] og udført både sår assays og motilitet assays til at måle migrering potentiale af cellerne. Hængende dråber assays måler den proliferative potentiale af cellerne i fravær af celle-matrix-interaktioner; sår analyser vurdere hastigheden af ​​bevægelsen af ​​en celle monolag, og motilitet assay måler hastigheden af ​​migrering af cellerne gennem ECM i filter porer.

Forældrekontrol LIM1899 celler eller LIM1899 celler transficeret med tomme vektorer, vokse i hængende dråber som aggregater med tætte centre (fig. 7A). I parallelle kulturer, er sfæroider af celler med reducerede niveauer af LGR5 (siLGR5) omgivet af en halo af løst tilknyttede celler og er let forstyrret, mens celler, der udtrykker høje niveauer af LGR5 (M2LGR5), enten midlertidigt eller stabilt, pakke til kompakte sfæroider modstandsdygtig over for mekanisk sprængning (fig. 7A og data ikke vist). Forskellen i celle tæthed afspejles i mængden af ​​sfæroiderne forhold til deres cellularitet: mens sfæroider fra forskellige cellelinjer indeholder tilsvarende antal celler (. Figur 7A, højre graf), den forskel i volumen mellem siLGR5 sfæroider og sfæroider overekspression LGR5 (fig. 7A, venstre graf) er signifikant (p = 0,001), hvilket afspejler en strammere pakning af cellerne i M2LGR5.

Lim1899 celler blev transficeret med vektor kontroller (Cy3V og pTuneV), med Cy3- siLGR5 eller med pTune /LGR5. Parentale, forbigående transficerede celler (TR) eller stabilt transficerede cellelinjer (ST) blev dyrket under følgende betingelser: A) Celler blev udsået i 30 ul dråber på en plastoverflade, og pladen inverterede at skabe hængende dråber, som beskrevet i Methods. Billeder blev taget efter 8 dage ved igen at vende plastik støtte og billeddannelse i lyse felt med et Nikon 90i mikroskop og en 10 x objektiv. Digitale billeder blev erhvervet med en Photometrics CoolSnap digitalkamera. Sfæroid mængder (venstre graf) blev beregnet ud fra disse billeder ved hjælp af den modificerede ellipsoide formel. Sfæroid størrelser afveg betydeligt mellem siLGR5 eller M2LGR5 transficerede celler og deres modparter transficeret med tom vektor (p = 0,0312 og p = 0,321, henholdsvis den uparrede t-test). Den cellularitet af sfæroiderne (højre graf) blev vurderet som beskrevet i Methods. I begge grafer data repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen af ​​10 individuelle sfæroider pr cellelinie. B) parentale celler og celler stabilt transficeret med pTune /LGR5 (kloner 6-1) blev udpladet ved høj densitet i 24-brønds plader. Sår blev ridset i adhærente monolyers og brøndene blev afbildet hver anden dag med en Nikon90i mikroskop under anvendelse af et 10 x objektiv (øverste paneler). Den mikrofotografi på nederste højre viser en højere forstørrelse af LGR5 6-1 sår på dag 6 (20 × objektiv). Indsæt: Sats for sårlukning over 96 timer. Kerner blev farvet med DAPI (blå).