PLoS ONE: Mikrobiel Dysbiosis i kolorektal cancer (CRC) Patienter

abstrakt

Sammensætningen af ​​den humane intestinale mikroflora er forbundet med sundhedsstatus. Formålet var at analysere mikrobiota af normale og tyktarmskræft patienter med henblik på at etablere kræft-relaterede dysbiosis

Patienter og metoder

Skammel bakteriel DNA blev ekstraheret før koloskopi fra 179 patienter:. 60 med kolorektal cancer, og 119 med normal koloskopi. Bakterielle gener opnået ved pyrosekventering af 12 afføringsprøver (6 Normal og 6 kræft) blev underkastet en valideret Principal Component Analysis (PCA) -test. Den dominerende og subdominant bakteriel population (

C. Leptum

,

C. Coccoides

,

Bacteroides /Prevotella

,

Lactobacillus /Leuconostoc /Pediococcus grupper

,

Bifidobacterium slægten

, og

E. coli,

Faecalibacterium prausnitzii

arter) blev kvantificeret i alle personer, der bruger qPCR og specifikke IL17 producentpriserne celler i tarmslimhinden blev karakteriseret ved hjælp af immunhistokemi.

Resultater

Pyrosequencing (Minimal sekvens 200 nukleotid læser) afslørede 80% af alle sekvenser kunne tildeles i alt 819 taxa baseret på standard parameter Classifier software. Den fylogenetiske kerne i Cancer individer var anderledes end i normale individer efter PCA analyse, med tendenser i retning af forskelle i de dominerende og subdominante familier af bakterier. Derfor All-bakterier [log

10 (bakterier /g fæces)] i Normal, og Cancer individer var ens [11.88 ± 0,35, og 11,80 ± 0,56, henholdsvis (P = 0,16)], i henhold til qPCR værdier mens blandt alle dominerende og subdominante arter kun dem af

Bacteroides /Prevotella

var højere (alle bakterier-specifik bakterie; P = 0,009) i Cancer (-1,04 ± 0,55) end i Normal (-1.40 ± 0,83) individer . IL17 immunoreaktive celler blev udtrykt betydeligt mere i den normale slimhinde af kræftpatienter end hos dem med normal koloskopi.

Konklusion

Dette er den første store serier til at demonstrere en ændring sammensætning i mikrobiota af tyktarmen kræftpatienter med mulige indvirkning på slimhinden immunrespons. Disse data åbner ny indgivet masse screening og Patofysiologi undersøgelser

Henvisning:. Sobhani I, Tap J, Roudot-Thoraval F, Roperch JP, Letulle S, Langella P, et al. (2011) Mikrobiel Dysbiosis i kolorektal cancer (CRC) Patienter. PLoS ONE 6 (1): e16393. doi: 10,1371 /journal.pone.0016393

Redaktør: Sylviane Pied, Lille 2 University, Frankrig

Modtaget: 12. september 2010; Accepteret: December 14, 2010; Udgivet: 27 Januar 2011

Copyright: © 2011 Sobhani et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Cancéropole Ile de France, comica 2007-2010 projekt, (Charles Debray association-ACD); LNCC (fransk National League mod kræft), CCR INSERM Promotion (2004-2006). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den menneskelige kolon indeholder op til 10

14 bakterier [1]. De spiller en vigtig rolle i gæring af tilbageværende fødevarer, modulering af tarmen immunfunktion, og beskyttelse mod patogener og sygdomme [2] – [5]. Selv tarmens mikrobiota er stort set gavnlig, kan ændringer i bakterielle populationer eller i produkterne af bakteriel metabolisme bidrager til sygdom.

I 1971 en undersøgelse beregnet identificere sammenhænge mellem menneskets mikrobiota sammensætning og kolorektal carcinogenese, men det havde opgives på grund af tekniske vanskeligheder. Senere, Moore og medarbejdere rapporterede, at 13 bakteriearter var signifikant forbundet med en høj risiko for tyktarmskræft og den vestlige kost [1]. Men deres resultater var noget overbevisende, fordi de undersøgte et mindre antal emner og ingen tarm undersøgelse dvs. radiologi eller koloskopi blev udført. Ikke desto mindre, da denne undersøgelse blev udført, har det humane colon mikrobiota blevet et vigtigt miljømæssig faktor, der synes at modulere risikoen for colon cancer, og dysbiosis i tarmen mikrobiota menes nu at være en faktor bag udviklingen af ​​sygdommen i genetisk -predisposed individer. Der er imidlertid ingen beviser, om dysbiosis faktisk forekommer i tyktarmskræft.

Kun et begrænset sæt af bakterielle populationer i naturen er blevet identificeret i det menneskelige legeme og ca. 80% af de humane bakterier identificeret ved molekylære værktøjer dvs. metagenomisk sekventering, anses dyrkbare [6]. Selv om nogle fremherskende bakteriearter i normale individer nu identificeres ved hjælp af hele genomet sekventering [7], mere end 60% af arterne er fortsat ukendt, og der er ingen data om, hvordan dysbiosis eventuelle kan forekomme hos patienter med tyktarmskræft. Således har DNA-sekventering, der er målrettet hypervariable regioner i små ribosomale-underenhed RNA-gener, især 16S rRNA-generne gjort det muligt at karakterisere biodiversiteten af ​​mikrobiota, hvilket kan føre til sygdomme (for en gennemgang, se ref [8]). 16S rRNA-genet er et ribosomalt komponent, der er konserveret i alle bakterier, og det indeholder variable sekvenser, som bibringer artsspecificitet. Ifølge denne teknik fremherskende taxa i de menneskelige tarm mikrobiota rapporteres at være

Clostridium leptum,

C

lostridium coccoides,

de

Bacteroides /Prevotella

grupper og

Bifidobacterium

slægt [9]. Den real-time kvantitativ PCR (qPCR) tilgang er blevet tilpasset for at vurdere disse bakterielle populationer i et stort antal prøver [10] – [11], og ændringer i mikrobiota komponenter kan nu studeres i relation til sundhed /sygdom status. Arter involverede vil påvirke eksperimentelle og metaboliske undersøgelser med nye Patofysiologi tilgange. For eksempel,

Bacteroides

befolkninger og mere specifikt de

Bacteroides fragilis

, er for nylig blevet vist at medføre en metalloprotease hos patienter med tyktarmskræft, men ikke i kontrol [12]. Denne bakterie arter har vist sig at inducere mucosale regulatoriske T-celle responser i tarmen involverer TH17 celletilgang i dyr [13] – [14] tyder kraftigt kan de ændre homeostase af effektor T-celle- populationer i tarmen [14] – [15].

Ved at bruge pyrosekventering teknik rapporterer vi beviser for, at tyktarmskræft sygdom er forbundet med dysbiosis primært som følge af en ændring i dominerende og subdominante arter. Ved at bruge qPCR, vi sammenlignet intestinale bakterielle samfund i normale individer og i dem med tyktarmskræft i den største serie hidtil rapporteret og viser niveau af dysbiosis på dominerende mikrobiota arter. Vi sætter disse resultater i perspektiv med slimhinde immun homøostase og afføring markør for masse screening

Resultater

Karakteristik af enkeltpersoner

De blev klassificeret som følger:. Normal (n = 119 ), der havde normal koloskopi; dem med kolon (n = 44) eller rektal (n = 16) cancer (total n = 60). Patienter med kræft var kønsmatchet (naturligvis to normal for en kræft), men var 10 år ældre end dem med normal koloskopi (tabel 1) ligesom i vores kohorte (tabel S1 i supplerende File S1) i, fordi hinanden følgende personer blev inkluderet. Normale individer sjældnere rapporteret en tidligere personlige historie af polypper eller en historie af tyktarmskræft i deres familie og ikke vise forskel vedrørende BMI. Således bortset fra dette punkt og alder, blev de matchet til de vigtigste andre karakteristika, herunder BMI og mad eller medicin optagelse med kræftpatient gruppen (tabel 1, tabel S1 og figur S1 i supplerende File S1).

Fylogeni problem baseret på taxon fordeling

fra alle datasæt, 1,210,781 trimmede sekvenser blev opnået og 978.710 af disse kunne henføres til i alt 819 taxa (tabel S2 i den supplerende File S1). En fortynding af data blev udført og gav en passende repræsentation af mangfoldigheden i tarmen mikrobielle samfund (tabel S1, tabel S2 og figur S3 i den supplerende File S1). Vi identificerede 18 bakterielle slægter med en overflod af mere end 1%, og disse slægter inkluderet 75% af sekvenserne. Tretten ud af de 18 slægter (

Alistipes, Collinsella, Bacteroides, Lachnospira, Prevotella, Subdoligranulum, DOREA, Faecalibacterium, Roseburia, Coprococcus, Streptococcus, Bifidobacterium

Ruminococcus)

svarede til den menneskelige tarm mikrobiota fylogenetisk kerne [16]. PCAIV analyse viste også, at omkring 5% af variabiliteten kunne tilskrives sygdomsstatus for hver prøve (Normal versus Cancer; p 0,05), og den systematiske enheder indikerer mikrobiota af normale og cancer individer blev let kendelige (figur 1 og Figur S2 i supplerende File S1). Endvidere 55 ud af de 66 bakterielle arter, der tilhører tidligere beskrevne fylogenetisk kerne blev påvist i disse prøver. Monte Carlo test viste, at mere end 7% af variationen var påvirket af sundhedsstatus (Normal versus Cancer; p 0,05). Variationen inden personen var lav og ubetydelig i forhold til mellem person,-variation (figur 1 og tabel S4 i supplerende File S1).

Principal komponent analyse, baseret på 16S rRNA-genet sekvens overflod af 7 diskriminerer slægter, der repræsenterede mindst 1% af mikrobiota overflod, blev udført med 6 raske individer (N) og 6 kræft * patienter (Ca) med to gentagelser (noteret som mid1 og mid2). To første komponenter (PC1 og PC2) blev plottet og udgjorde 70,83% af hele inerti. Personer (repræsenteret ved deres prøve id) blev grupperet og tyngdepunkt beregnes for hver klasse. * De har alle valgt ud fra trin I-II i TNM klassifikationen (se også tabel S2 og S3 og figur S2 S3 i den supplerende File S1)

Sammenligning af bakterielle populationer i afføringen

Alle-bakterier niveauer ikke adskiller sig fra normale og Cancer grupper (tabel 2), mens der blev observeret en signifikant forskel for

Bacteroides /Prevotella

gruppe. Denne forskel var relateret til det forhøjede niveau af disse bakterier i Cancer sammenlignet med normale grupper (tabel 2). Tager alle personer tilsammen

Bacteroides /Prevotella

gruppe tæthed niveau blev ikke knyttet til alder eller BMI (r = 0,05; p = 0,46, se også Figur S1 i supplerende File S1). Tager alle personer med kræft de bakterielle niveauer blev ikke knyttet med tumorstørrelse eller tumor iscenesættelse med henvisning til den internationale TNM klassifikationen (Figur S1 i supplerende File S1) og mindre invasive karcinomer kan være forbundet med høje niveauer af bakteriel tæthed. Niveauerne af

Bacteroides /Prevotella

gruppe blev ikke påvirket af andre patientkarakteristika, såsom alder, BMI, årsagen til koloskopi, den tidligere historie af polypper eller kræft i deres familie (tabel S1 i supplerende fil S1), med størrelse eller placering (venstre- versus højresidig eller rektal versus colon) af kræft (tabel 2). For de øvrige dominerende eller subdominante bakterier dvs.

C. leptum

gruppe,

C. coccoides

gruppe,

Lactobacillus /Leuconostoc /Pediococcus

grupper,

Bifidobacterium

slægt,

E. coli,

Faecalibacterium prausnitzii

arter, vi fandt ikke nogen forskel mellem patienter versus Normal koloskopi individer.

IL17 immunceller og

Bacteroides

i slimhinden

Disse celler blev fundet infiltrerende størstedelen af ​​tumor prøver (score ++ til +++) og i

lamina propria

af homologt normal slimhinde (score + til ++) i kræft patienternes vævsprøver mens de sjældent eller ikke blev påvist i normal slimhinde (0 til +/-) i normale individer (figur 2). Ingen parametrisk statistisk test viste signifikant højere IL17 immunfarvet celle score i normal slimhinde for tyktarmskræft patienter end i normale koloskopi individer (median +/- versus ++; p 0,5). Efter dobbelt (CD3 og IL17) farvning af vævssnit serielle blev størstedelen af ​​IL17 immunreaktive celler fundet at være af CD3 markør i både (Normal mucosa eller homologe til kræft normal slimhinde) sager, idet alle CD3-celler ikke blev immunfarvet med IL17 antistof. Imidlertid IL17 /CD3-forhold i normal colon mucosa forekom ingen signifikant forskellig mellem Normal and Cancer koloskopi individer (figur 2C, D). Disse semi kvantitative immun fund celle var forbundet med specifikke væv vedhængende

Bacteroides

densitet (figur 3).

Bacteroides

genamplifikation produkt blev fundet 1000 gange mere udtrykt i afføringen end i kolon vævsprøver som afsløret ved qPCR (figur 3B). Endvidere

Bacteroides

amplifikationsprodukt var signifikant højere i tyktarmskræft patienternes væv (normal samt tumoral) end i normale individers væv som vurderet ved qPCR og afsløret ved gelanalyse (figur 3 og figur S4 i supplerende File S1). I kolorektal kræftpatienter,

Bacteroides

genamplifikation produkt var signifikant højere i tumorvæv end i normalt homologt væv (Figur S5 supplerende File S1).

Prøver fra de samme individer og colon steder var forelagt DNA-ekstraktion og PCR. Interleukin 17 (IL17) -immunoreactive celler i colon væv blev hovedsageligt placeret i

lamina propria

i de normale væv [A: colon normal slimhinde fra en normal person (stor forstørrelse x40 nederst), B: colon normal slimhinde fra en patient med tyktarmskræft (stor forstørrelse x40 nederst)] og infiltrerede tumorvævet i en samme individ end i B [C: IL17 imlmunoreactive celler infiltrerer tumoren med høj forstørrelse x40 nederst D: I denne dobbelte farvning IL17 og CD3, ged anti-human IL-17-antistof blev tilsat først, før farvning med naphthol /Hurtig (rød) efterfulgt af kanin-anti-humant CD3-antistof, der blev afsløret med DAB-substrat (brun); dette viste, at CD3 ikke var den eneste celle producerer IL-17.

I den normale enkeltes væv (A) gel migration Systemet viser

Bacteroides

/Albumin-forhold tæt på 1, mens de optrådte højere i homolog normal (N) eller tumor (Ca) slimhinde i colon cancer patients væv (B). Bemærk, at

Bacteroides

genamplifikation produkt i afføring er dramatisk højere end detekteret fra slimhinde DNA; amplifikation henvises til humant albumin-genet.

Discussion

Vi rapporterer forskelle i tyktarmen mikrobiota i individer med coloncancer versus dem med en normal koloskopi. Vi viste, at fordelingen af ​​bakteriel slægter i mikrobiota varierede, afhængigt af deres status sygdom, og qPCR viste betydelig forhøjelse af

Bacteroides /Prevotella

befolkning i kræftpatienter, der syntes at være forbundet med forhøjet IL17 producerende celler i slimhinden i individer med cancer.

Denne undersøgelse sammenligner individer udgør med en normal eller syge koloskopi. Selv dem med en normal koloskopi ikke var raske frivillige, kan de anses for at udgøre en meningsfuld kontrolgruppe. Dette er fordi de tilfældigt blev udvalgt blandt hinanden følgende personer, som var blevet henvist til koloskopi, der viste sig at være normal. For at reducere forspændingen valgte vi 2 normale individer i 1 cancer tilfælde. Deres egenskaber matchede dem af patienterne i cancer-gruppen, bortset fra deres alder og tilfælde af polypper eller kræft i pårørende. Aldersforskelle afspejler de epidemiologiske data i litteraturen. Bakteriel dysbiosis findes i vores undersøgelse var klart uafhængig af alder. Ingen af ​​mikrobielle forskelle observeret i denne undersøgelse var forbundet med alderen. En anden forskel mellem cases og kontroller bekymringer højere forekomst af neoplasmer i colon kræftpatienters pårørende. Dette kan afspejle den rolle, miljømæssige faktorer snarere end germinale genetiske ændringer, da ingen af ​​patienterne havde stigmata af Lynch eller polypose adenomatøs familiære PAF syndrom sygdomme.

high throughput sekventering teknikker til menneskelig mikrobiota har bidraget væsentligt til at afsløre en forskel i det bakterielle fylogenetiske kerne hos normale individer og dem, der lider af forskellige sygdomme [7]. denne fremgangsmåde imidlertid ikke omfatte kræftsygdom. For at kontrollere, om fylogenetisk kerne var anderledes hos raske individer og kræftpatienter, har 16S rRNA-generne været mål for pyrosekventering som et alternativ til den alle bakterier genomsekventering. Faktisk kan V3-V4 variable region af 16S rRNA anvendes til at tilvejebringe en bakteriel klassificering af den humane mikrobiota [17] på grundlag af pyrosekventering. Ved at bruge denne teknologi, vi klart identificeret mere end 40.000 informative sekvenser på V3-V4 16S rRNA-genet region fra hver afføringsprøve, i nærværende undersøgelse, og dette førte til opførelsen af ​​det fylogenetiske kerne af mikrobiota [16]. Denne fylogenetisk kerne blev fundet at være forskellig hos cancerpatienter versus normale individer. Forskellene pågældende særligt dominerende og sub dominerende bakterielle populationer. Det er meget usandsynligt, at de forskelle, vi fundet af pyrosekventering kunne være epiphenomenal, da alle patienter blev inkluderet gennem en standardiseret procedure (køn og alder-matchede, betingelser for afføring prøvetagning og DNA ekstraktion) og sekvens ligheder mellem dubletter (inden personen-variation ) var meget høj. Følgelig hovedgrupper slægter og arter ud af dominerende og sub dominerende bakterielle populationer er blevet kvantificeret ved qPCR som nu rutinemæssigt anvendes til at kvantificere den bakterielle sammensætning mikrobiota af sunde eller syge mennesker eller dyr [9], [18]. Tætheden af ​​”alle-bakterier” i afføringsprøver ikke afspejler de koloskopi resultater, selv om man (dvs. .;

Bacteroides

) ud af de syv undersøgte her arter viste sig at være højere i kræft gruppe individer. Alle disse metoder er valideret, og rutinemæssigt anvendes [6]. Selvom pyrosekventering teknik, der bør betragtes som en semikvantitativ værktøj angivet mange andre bakteriearter ændring blev kun vigtigste dominerende og subdominante arter kvantificeret i den foreliggende undersøgelse ved qPCR. Desuden molekylære analyser omfatter arter-relaterede forskelle i sonde permeabilitet, og forstærkning egenskaber, og på grund af det relativt lille antal sonder til rådighed til at analysere de mange karakteriserede gut arter [19], kan vi ikke udelukke muligheden for, at vi måske er gået glip andre væsentlige forskelle i mikrobiel densitet. Så bør det ikke udelukke muligheden for forskelle mellem patientgrupper i form af bakterier taxa eller arter, der nu kræver yderligere undersøgelse på grundlag af high-throughput sekventering resultater for kræft og kontrol mikrobiota. Den rRNA-genet-baserede sekventering kan registrere de fremherskende medlemmer af samfundet, men disse metoder kan ikke registrere de sjældne medlemmer af et fællesskab med divergerende målsekvenser. For at overvinde begrænsningerne ved enkelt gen-baserede amplikon sekventering ved pyrosekventering, har hel-genom haglgevær sekventering dukket op som en attraktiv strategi for vurdering kompleks mikrobiel mangfoldighed i blandede populationer [7]. Ikke desto mindre er dette den største mikrobiologisk undersøgelse er blevet rapporteret indtil videre, og det store antal af emner indskrevet med kendte koloskopi og histopatologi egenskaber gør det meget robust og kunne åbne vejen for nye patofysiologiske felter og nye screeningsmarkører.

årsagen til en sammenhæng mellem

Bacteroides /Prevotella

gruppe tæthed elevation som vurderet af qPCR og maligne kolon tumorer er ikke klart. Alle primere anvendt til qPCR i denne undersøgelse var designet til at kvantificere dominerende og sub dominerende arter som foreslået af pyrosekventering tilgang. Hvorvidt sådanne mikrobiologiske konstaterede forskelle i den foreliggende undersøgelse er årsag eller konsekvens af tumor fund ved koloskopi bekymringer mekanistisk tilgang, som ikke er designet til at blive analyseret her og kræver prospektive studier. Men vi kunne spekulere i, at

Bacteroides /Prevotella

gruppe tæthed er nok ikke konsekvensen af ​​tumor forekomst, fordi deres niveauer ikke var korreleret med tumorstørrelse eller sygdom iscenesættelse og kunne detekteres

Bacteroides

slægt arter fra vaskede slimhinde tyder det tilhører til mucosale vedhængende bakterier grupper. Primere Vi designede målrettet

Bacteroides

Prevotella

slægten befolkninger. Ændringer i

Prevotella

er kun rapporteret i de orale og gastriske hulrum [20], uden nogen sammenhæng med tumorvækst. I modsætning hertil

Bacteroides

genus befolkninger og mere specifikt de af

Bacteroides fragilis

, er for nylig blevet vist at medføre en metalloprotease hos patienter med tyktarmskræft, men ikke i kontrol [12] tyder denne art sub befolkning kan begunstige carcinogenese. Det er bemærkelsesværdigt, at blandt de mange mekanismer, der kan mediere associationer mellem mikrobiota og menneskers sundhed [21] – [22], pro-inflammatoriske og immun celleaktivering i colon mucosa, er af stor betydning i forhold til malignitet. Nogle medlemmer af tarmens mikrobiota kan styre værts T-cellereaktioner [13], [15] andre kan opretholde homøostase af effektor T-celle- populationer i tarmen [14].

B. fragilis

er blevet vist at inducere mucosale regulatoriske T-celle responser i tarmen involverer TH17 celletilgang i forsøgsmodeller [13] – [14]. Af interesse slimhinde-klæbende

Bacteroides

arter i vores undersøgelse vises højere hos patienter med tyktarmskræft end i normale koloskopi individer i en andel forbundet med slimhinde IL17 immunoreaktiv celletæthed. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse i human der rapporteret TH17 celler overekspression i mere end 80% af sporadisk tyktarmskræft mikro miljø [23]. IL17 immunoreaktive celler infiltrerer mere det homologe normal colon mucosa af tyktarmskræft patienter end normalt væv i normale koloskopi individer som vurderet ved immunhistokemi eller mRNA qPCR kvantificering fra slimhinden (data ikke vist). Disse kan foreslå T-celleaktivering kan forbindes med mucosal IL17 ændring som følge

Bacteroides

som rapporteret i dyremodeller [13] – [14], [21] – [22]. Kort fortalt disse data argumenterede for en forstyrret immunrespons i tyktarmskræft væv med IL-17 overproduktion forværrer [24] – [25] sygdommen sandsynligvis på grund af

Bacteroides

Yderligere interessant. aspekt af mikrobiota er dets potentielle værdi som markør for tyktarmskræft siden størstedelen af ​​patienterne kunne identificeres fra en højde af

Bacteroides /Prevotella

befolkning med mulighed for en kvantitativ test en cut-off baseret på en specificitet sats. Sammenlignet med koloskopi så langt de stigninger i

Bacteroides

i afføringen og /eller IL17 immunoreaktive celler i de normale slimhinde synes at være lovende følsomme markører.

Metoder

fra september 2004 til september 2006 648 personer med en gennemsnitlig eller højere end gennemsnittet risiko for CRC (fx med historie kræft i pårørende eller en personlig tidligere historie af polypper, eller abdominal eller tarm relaterede symptomer eller anæmi, som krævede koloskopi), var indgår i en prøve bankindsamling undersøgelse. For at være berettiget til optagelse, patienterne skulle have ingen tidligere colon eller rektal kirurgi, af sygdomme som kræft, eller af inflammatoriske eller infektiøse læsioner i tarmen, og ikke at have behov for en nødsituation koloskopi. To uger før koloskopi blev patienterne indgår efter at have givet informeret samtykke og blev bedt om at give en frisk afføringsprøve inden for 2 uger op til tre dage forud for koloskopi. Undersøgelsen blev godkendt af etisk komité af Val de Marne Paris-EST område, der er godkendt indskrive patienter i alle tilknyttede centre. Alle patienter fik information om studiet, dets mål, og prøver de skulle give. Alle oplysninger blev givet af et maskinskrevet brev skrevet på fransk og formel godkendelse er opnået i tredobbelt kopi form en af ​​disse var bevaret af patienten, holder vi en kopi på afdelingen for klinisk forskning (CIC) og den sidste kopi er bevaret af promotoren (Statens Institut for videnskabelig forskning i medicin-INSERM). Så en formel samtykke er til rådighed for hver patient. I alle tilfælde blev der afføringsprøver indsamlet før tarm udrensning for koloskopi. Eventuelle særlige diæter (diabetikere, vegetarer) og medicin (anti-diabetiske lægemidler, hypocholesterolemics og afføringsmidler) i denne periode blev registreret. En narkoselæge besøgte deltagerne mindst tre dage før den planlagte koloskopi. Undersøgelsen periode fortsatte indtil koloskopi og patologi data var blevet kontrolleret, og den endelige status kunne tildeles som “normal koloskopi”, “Tumor ved koloskopi” eller “andre abnormiteter ved koloskopi”. De blev holdt i en samling bio-bank for Patofysiologi eller test screening undersøgelser, herunder den ene rapporteret her. Efter køn matchning mellem personer med tumoral og normale colonoscopies, prøver fra 180 patienter (én kræftpatient for to person med normal koloskopi), som blev kontrolleret ikke tage antibiotika med enten “normale” eller “kræft” fund blev udsat for bakterier DNA-analyse i aktuelle serie.

Fækale prøver og bakteriel DNA-ekstraktion

hele friske afføring blev indsamlet i sterile bokse, og inden for 4 timer 10 gr blev frosset ved -20 ° C, til analyse. Bakterielt DNA blev ekstraheret fra aliquoter af afføring, og efter den endelige præcipitation blev DNA resuspenderet i 150 pi TE-buffer og opbevaret ved -20 ° C til yderligere analyse, som beskrevet tidligere [26].

Pyrosekventering analyse fra afføring

Bakteriel DNA-prøver fra 6 personer (3 hanner og 3 hunner bliver tilfældigt udvalgt) med en normal koloskopi, og 6 alders- og køns- matchede patienter med invasiv CCR under trin i eller II i TNM klassifikation , blev anvendt til konstruktion 12 DNA-biblioteker. Følgende universelle 16SrRNA primere blev anvendt for PCR-reaktionen: V3F (TACGGRAGGCAGCAG) [27] og V4R (GGACTACCAGGGTATCTAAT) [28] til at målrette V3-V4-regionen, hvilket giver de laveste fejlrater [29]

Barcode sekvenser (GsFLX nøgle) TCAG og MIDGsFLX (12 nukleotider) blev fastgjort mellem 454 GsFLX adapterens sekvens og forward primeren V3F. Den GsFLX tasten og 454 GsFLX adapterens var knyttet til den omvendte primer. Koncentrationen og kvaliteten af ​​PCR-produkterne blev vurderet med Picogreen for at opnå lige store mængder af hver af prøverne (10

8 molekyler /pl), og derefter 16S rRNA-genet amplikoner blev sekventeret på en Roche GS FLX 454 sequencer ( Genoscreen, Lille, Frankrig) og forarbejdet med standard-protokol fra producenten (https://genoscreen.fr/). For at validere tilstedeværelsen af ​​specifikke bakterielle taxa i de 2 grupper af patienter trods variabiliteten på grund af den tekniske proces blev hver DNA-prøve sekventeret i to eksemplarer. Således 12 afføring bakterielle DNA ekstrakter blev forelagt pyrosekventering analyse, med to gentagelser af hver. Disse 24 sæt af sekvenser blev indsendt til intra individuelle og inter individ analyser og klassiske mangfoldighed indekser blev beregnet. Fælles sekvenser i to kopier blev anset for hvert individ; derefter inter individuelle og inter gruppe analyser blev udført i henhold til “Normal” versus “Kræft” status.

Kvantitativ PCR-analyse

Vi brugte en real-time qPCR teknik til at undersøge forskellen i bakterielle tætheder inden mikrobiota mellem normale og kræftpatienters afføring (N = 179) og mucosal DNA (N = 44). Primerne og proberne anvendt i denne undersøgelse, er beskrevet andetsteds [26], og er angivet i tabel S1 supplerende File S1. Real-time qPCR blev udført under anvendelse af en ABI 7000 Sequence Detection System med softwareversion 1.2.3 (Applied Biosystems-, Foster City, CA, USA), og det samlede antal bakterier blev udledt gennemsnit standardkurver og udtrykt som log10 værdi, som tidligere beskrevet [26]. blev opnået Værdier af qPCR per patient og for hver komponent af tarmen mikrobiota (total n = 180 patienter, 60 med kræft og 119 med normal koloskopi, en manglende prøve). For at overvinde det faktum, at fæcesprøver kan indeholde mere eller mindre vand, dataene for hver fækal prøve blev normaliseret som tidligere beskrevet [26]. Indholdet var for hver særlig dominerende og sub-dominant bakteriepopulation blev trukket fra alle-bakterieindhold, og resultaterne er udtrykt som logaritmen af ​​antallet af bakterier per gram fæces. Disse assays blev anvendt til at sammenligne sammensætningen af ​​den intestinale mikroflora af de 179 individer, og resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SD i normale og cancer patientgrupper. Desuden repræsentativ kolon (N = 32) eller rektal (N = 12) normale vævsprøver fra 22 individer med normal colon og 22 patienter med colon (N = 16) eller rektal (N = 6) kræft blev underkastet DNA-ekstraktion og qPCR kvantificering efter samme fremgangsmåde til at analysere slimhinde vedhængende bakterier komponent. Colon eller rektale væv blev opnået efter kirurgi; stykker blev vasket og repræsentative prøver blev bevaret enten i formalin til histokemi eller nedfryses indtil DNA-ekstraktion til human albumin og

Bacteroides

PCR-processen.

Immunhistokemi

Vævsprøver blev udvalgt til hvert tilfælde (normale og cancer individer), og paraffinindlejrede 4-um snit blev anvendt og immunfarvning blev udført ifølge fremgangsmåder beskrevet andetsteds [23], [30]. Kort fortalt blev gede-anti-humant IL-17-antistof (fortyndet 1:40) blev tilsat i 2 timer, og derefter Farvning blev foretaget under anvendelse af (Vectastain AP kit fra Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), og afsløret af Naphtol /Hurtigt rød (Sigma-Aldrich). For at kvantificere de immunfarvet celler blev fem godt orienteret slide prøver /person fra normalt væv i enten kontrol- eller kolon kræftpatienter undersøges ved en forstørrelse på 400 × (for en 3-mm-lange epitel prøve i hvert tilfælde). Mærkede celler per millimeter blev bestemt ved anvendelse af en okulær gitter. Immunofarvede celler blev talt på 10 på hinanden følgende felter og semi-kvantitativt scoret (som +/-, +, ++ eller +++) og klassificeret. For IL17 /CD3 dobbelt farvning, ged anti-human IL-17-antistof (fortyndet 1:40) blev tilsat i 2 timer, og derefter Farvning blev foretaget ved anvendelse af Vectastain AP kit fra Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA), og afslørede ved Naphtol /Fast Red (Sigma-Aldrich).