PLoS ONE: Høj SEPT9_i1 Protein Expression er forbundet med High-Grade prostatakræft

Abstrakt

Septins er en familie af GTP-bindende cytoskeleton proteiner udtrykt i mange solide tumorer. Septin 9 (

SEPT9

) især blev fundet overudtrykt i forskellige karcinomer. Heri, studerede vi udtryk for SEPT9 isoform 1 protein (SEPT9_i1) i humane prostatakræft prøver. Vi udnyttede immunhistokemisk farvning for at undersøge ekspressionen af ​​SEPT9_i1 protein. Farvning niveau blev analyseret i forbindelse med kliniske karakteristika og den patologiske Gleason kvalitet og score. Halvtreds human prostatacancer prøver (42 primære tumorer og 8 metastatiske læsioner) blev farvet af SEPT9_i1 antistof og analyseret. SEPT9_i1 protein blev udtrykt i prostatacancerceller men fraværende i normale epitelceller. Intensiteten af ​​farvning blev korreleret proportionalt til forbehandling prostata-specifikke antigen (PSA) i blodet og Gleason score (

P

0,05). SEPT9_i1 blev stærkt udtrykt i alle metastatiske læsioner. En væsentlig Assocation mellem SEPT9_i1 ekspression og høj Gleason score på multivariate lineær regressionsanalyse blev fundet. Vi konkluderer, at SEPT9_i1 udtrykkes i høj kvalitet prostata tumorer tyder det har en væsentlig rolle i prostata tumorigenese, og at det kunne tjene som en molekylær markør for prostata tumor progression

Henvisning:. Gilad R, Meir K, Stein jeg, tysk L, Pikarsky E, Mabjeesh NJ (2015) High SEPT9_i1 Protein Expression er forbundet med High-Grade prostatakræft. PLoS ONE 10 (4): e0124251. doi: 10,1371 /journal.pone.0124251

Academic Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: November 7, 2014 Accepteret: 11. marts 2015; Udgivet: 21 April, 2015

Copyright: © 2015 Gilad et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er second to lungekræft i forekomsten på verdensplan og er den anden mest almindelige kræftform, og en af ​​de førende årsager til kræftdødsfald blandt vestlige mænd [1]. De primære risikofaktorer for prostatakræft er alder og familiens historie. Prostatakræft bliver mere almindeligt med alderen påvirker mænd i alderen 50 eller mere [2]. Prostata-adenocarcinom metastaserer hovedsagelig til knoglerne og mindre almindeligt til lymfeknuder, og kan lokalt forhånd at invadere omkringliggende organer. Nuværende behandlinger indbefatter hormonterapi, immunterapi og kemoterapi, men der er ingen helbredende behandling for metastatisk prostatacancer [3, 4]. Derfor hidtil ukendte strategier til behandling af prostatacancer og identifikation og karakterisering af nye molekylære mål, såsom interleukin-6 er essentielle [5].

Septins er en familie af GTP-bindende og filamentdannende proteiner, først beskrevet i

Saccharomyces cerevisiae

i en skærm for gener, der regulerer spirende proces [6]. Siden da har septins blevet identificeret i mange andre eukaryoter, lige fra svampe til mennesker [7-9] med en iøjnefaldende mangel i planter [10]. Mange septin isoformer abnormt udtrykt i carcinomer [11] og ændrede niveauer af septin ekspression kraftigt korrelere med tumorigene fænotyper såsom øget cellevækst, motilitet, invasivitet, og modstand mod mikrotubulus-forstyrre reagenser [12, 13].

Vi havde tidligere identificeret SEPT9_i1, et produkt fra transkript SEPT9_v1 der koder isoform 1 med den største N-terminal ekstension, som en positiv regulator i hypoksiske pathway [14]. SEPT9_i1 interagerer med hypoxi-inducerbar faktor 1α (HIF-1α), ilt-regulerede underenheden af ​​HIF-1, som er en central regulator af den hypoxiske respons pathway [15]. Interaktionen er specifik for HIF-1α, men ikke til HIF-2α, og det øger HIF-1α proteinstabilitet samt HIF-1 transkriptionel aktivitet, hvilket fører til forøget proliferation, tumorvækst og angiogenese. HIF-1 er en transkriptionsfaktor som regulerer svarene og cellulære tilpasning til hypoxi kørsel transkription af mange gener, der er vigtige for tilpasning og overlevelse under hypoxi [14]. Blandt disse gener er glycolytiske enzymer, den glukosetransportører Glut-1 og GLUT-3, endotelin-1, vaskulær endotelvækstfaktor, kulsyreanhydrase IX og erythropoietin [16]. Immunohistokemiske analyser afslørede, at HIF-1α overudtrykkes i mange humane cancere [17]. Endvidere steg HIF-1-aktivitet er ofte forbundet med øget tumor aggressivitet, terapi modstand, og dødeligheden [18].

Vores tidligere undersøgelser i forskellige prostata cellelinjer og xenotransplantater viste, at SEPT9_v1 mRNA udtrykkes stærkt i human prostata cancer prøver sammenlignet med normalt prostatavæv [15]. I den foreliggende undersøgelse, vi bestemt udtryk for SEPT9_i1 protein i primære humane prostatakræft væv ved hjælp af immunhistokemi og korreleret sit udtryk med clinicopathologic karakteristika.

Materialer og Metoder

Vævsprøver

den institutionelle gennemgang bestyrelse Hebrew University-Hadassah Medical center godkendt denne undersøgelse (IRB protokol 0500-12-HMO). Arkivmateriale før 2000 blev godkendt til brug af den institutionelle gennemgang bestyrelse Hebrew University-Hadassah Medical Center, med et afkald på informeret samtykke, i overensstemmelse med Staten Israel lov af genetisk information, 2002. Alle arkivers prøver anvendt i denne undersøgelse blev opnået fra den institutionelle biorepository på Hadassah Medical center. Alle undersøgelsens prøver var før 2000 og alle blev de-identificeret. Dette var en retrospektiv undersøgelse af en række 50 paraffinindlejrede prostata cancer prøver: 38 fra radikal prostatektomi, 6 fra radikale cystoprostatectomy og 6 fra transuretral resektion af prostata (TUR-P). Af denne samling blev otte eksemplarer udelukket fra undersøgelsen på grund af tekniske problemer i vævsbehandling forlader 42 primære tumorer på forskellige stadier til endelig evaluering (tabel 1). Otte yderligere metastatiske læsioner fra 8 forskellige patienter, knoglemarv (3), lymfeknuder (2) og knogler (3) blev analyseret separat. Én prøve fra hver patient blev analyseret, og ingen af ​​patienterne modtog neoadjuvansterapi.

Immunhistokemi

En kanin polyklonalt antistof rettet mod den N-terminale ende af SEPT9_i1 er tidligere fremstillet [15] og yderligere kendetegnet (fig 1A og 1B). Immunhistokemisk farvning blev udført under anvendelse af den samme protokol for alle væv. Kort fortalt blev 4 um formalin-fikserede paraffin-indlejrede sektioner deparaffineret, rehydreret og antigen-genvinding blev udført i 25 mM citratbuffer pH 6 ved opvarmning til 125 ° C i 3 minutter i decloaking kammer (Biocare Medical). Snit blev inkuberet med anti-SEPT9_i1 antistof ved 1:. 2000 fortynding natten over ved 4 ° C

HEK-293T embryonale humane nyreceller blev transient transficeret med Flag-SEPT9_i1 konstruere eller tom vektor (EV). (A) Hele celleekstrakter blev fremstillet og analyseret ved 4-20% SDS-PAGE og immunoblotting (IB) med antistoffer til Flag (1: 2000), SEPT9_i1 (1: 3000), præimmunt serum (1: 3000) eller SEPT9_i1 antistof (1: 3000) pre-inkuberet med 10 pM af immunogenet peptid i 4 timer. (B) De samme cellulære ekstrakter blev underkastet immunpræcipitering (IP) under anvendelse af anti-Flag-antistof og de immuneprecipitates blev underkastet 4-15% SDS-PAGE og derefter immunblottet med anti-Flag- eller anti-SEPT9_i1 antistoffer. (C) repræsentant SEPT9_i1 farvning i human prostatacancer prøver. Score 0: ingen SEPT9_i1 farvning, 1: lav SEPT9_i1 farvning 2: medium SEPT9_i1 farvning og 3: høj SEPT9_i1 farvning. Forstørrelse x200, skala bar 50 pm.

Anti-kanin HRP-konjugeret antistof (Vector Labs) blev anvendt til at detektere det primære antistof. Slides blev udviklet med diaminobenzidin (DAB) og modfarvet med hæmatoxylin.

Kvantitativ evaluering af immunfarvning og scorer

Alle objektglas blev revideret af to uafhængige investigatorer (RG og EP), der var blindet for alle kliniske og patologiske data. Intensiteten af ​​farvning blev bedømt som 0 (ingen ekspression), 1 (svag), 2 (moderat) og 3 (kraftig). Vi udførte også computerstyret billedanalyse under anvendelse af en ARIOL-SL50 automatiseret scanning mikroskop og billedanalysesystem (Applied Imaging) for at evaluere intensiteten af ​​prøven farvning, i det væsentlige som beskrevet [19]. Objektglas blev scannet og alle tumorområder blev markeret. Fra hver tumor 10 separate felter, tilfældigt udvalgte, blev analyseret og normaliseret i henhold til de fabrikanter indstillingen (Hersight modul). Resultaterne af analysen er vist som normaliseret middelværdi intensitet som beregnet af ARIOL-SL50 software.

Transient transfektion, proteinekstraktion, immunopræcipitationsanalyser, og immunoblotanalyse

Humane embryoniske nyre (HEK 293T ) celler blev podet ved 70% konfluens i 6 cm plader og blev transficeret med 3 ug af et plasmid, der udtrykker Flag-SEPT9_i1 protein eller tom vektor (EV), under anvendelse GenePorter transfektionsreagens (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA) som tidligere beskrevet [15]. Hele celleekstrakter blev fremstillet og proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af et bicinchoninsyre protein assay kit (Pierce, Rockford, IL) som tidligere beskrevet [15]. Immunfældning blev udført under anvendelse Ezview Red anti-FLAG Affinity gel (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), og ved at følge producentens instruktioner. Proteiner blev derefter analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer som vist i fig. dybest set som tidligere beskrevet [15]. Primære antistoffer var kanin-polyklonalt antistof mod SEPT9_i1, som tidligere blev fremstillet [15] og dens tilsvarende præ-immunt serum eller i Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Sekundært antistof blev peberrodsperoxidase konjugeret ged anti-mus eller kanin (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).

Statistiske analyser

Beskrivende statistik af undersøgelsen prøve blev anvendt til at opsummere deltagende egenskaber. Bivariate Spearmans korrelation blev anvendt til at vurdere forholdet mellem “patienternes karakteristika” og betyder analyser. I en multivariat lineær regressionsanalyse, resultatet var gennemsnitlige SEPT9_i1 farvning intensitet. De uafhængige variable inkluderet alder og Gleason score. Justeret β og SE blev beregnet. Den bedste model blev bestemt overvejer justerede R

2. Alle tests var to-sidede og statistisk signifikans blev defineret som

P

værdi 0,05. Analyserne blev udført ved hjælp af PASW Statistics 17.0 til Windows.

Resultater

De vigtigste egenskaber ved deltagere, hvis prøver blev anvendt i undersøgelsen er beskrevet i tabel 1. Median alder var 65 år med median PSA på 5,9 ng /ml og størstedelen havde Gleason score ≥ 7. farvede vi alle patienters prøver ved anvendelse af en SEPT9_i1-specifikt antistof [15]. Vi først karakteriseret specificitet SEPT9_i1 antistof. Flag-tagget SEPT9_i1 konstruktion blev forbigående udtrykt i HEK-293T-celler og underkastet immunoblotting med antistoffer mod flaget, SEPT9_i1 og SEPT9_i1 i nærvær af immunogenet peptidet [15] samt med den præimmune serum (Fig 1A). Flag og SEPT9_i1 antistoffer reagerede med et 70 kDa bånd svarende til Flag-SEPT9_i1 protein mens præimmunserum ikke viste nogen reaktivitet (Fig 1A). Endvidere blev immunoreaktiviteten af ​​SEPT9_i1antibody næsten helt ophævet, når immunogenet peptidet blev tilsat (Fig 1A). Desuden blev de immunopræcipiterede arter af Flag antistof også anerkendt af anti-SEPT9_i1antibodies (Fig 1B). Disse resultater yderligere overensstemmelse specificiteten af ​​den producerede anti-SEPT9_i1antibodies.

I den ikke-neoplastiske prostata vi observeret fremtrædende SEPT9_i1 cytoplasmatisk farvning i de fleste basale celler, mens luminale celler var negative (Fig 1C). Stromaceller farvning i både neoplastiske og ikke-neoplastiske regioner var variabel. Tumor celler viste variabel farvningsintensitet, som havde en tendens til at være cytoplasmatisk dog i nogle tilfælde var nukleare. Farvningsintensiteten af ​​tumorceller var i nogle tilfælde variabel. I disse tilfælde point er tildelt på grundlag af den mest udbredte farvning intensitet. Hver prøve blev derefter scoret fra 0 til 3 for ekspressionsniveauet af SEPT9_i1 (Fig 1C). Vi korreleret derefter SEPT9_i1 farvningsintensitet med kliniske karakteristika og fundet stærk og signifikant sammenhæng mellem SEPT9_i1 ekspressionsniveauerne og Gleason score (

P

= 0,01, tabel 2). På multivariat lineær regressionsanalyse for foreningen mellem patienternes karakteristika og betyder SEPT9_i1 farvning intensitet, Gleason score var den eneste uafhængige prædiktiv faktor (RR 2,0, 95% CI 0,15-3,85,

P

= 0,035). Vi stratificeret SEPT9_i1 farvningsintensitet enten ved anvendelse af visuel scoring (Fig 2A) eller ved computerstyret billedanalyse med et automatiseret billedanalysesystem (ARIOL-SL50) (Fig 2B) ifølge Gleason score. Der var signifikant højere niveau af SEPT9_i1 farvning som Gleason score var højere (figur 2)

Mean SEPT9_i1 farvningsintensitet ± SE for hver Gleason score gruppe (score 5:. 3 patienter, score 6: 8 patienter, score 7: 19 patienter, score 8: 3 patienter, score 9: 6 patienter og score 10: 2 patienter) blev beregnet under anvendelse af enten visuel scoring (A) eller automatiseret billedanalyse med ARIOL-SL50-system (B)

Vi analyserede næste metastatisk prostatacancer prøver fra forskellige steder, herunder knogle (3 prøver), knoglemarv (3 prøver) og lymfeknuder (2 prøver). Alle metastatiske læsioner var stærkt positiv for SEPT9_i1 farvning (figur 3). Alt i alt høj ekspression af SEPT9_i1 i høj kvalitet prostatakræft og i prostatacancer metastaser antyder, at SEPT9_i1 er kandidat markør for tumorudvikling.

metastatisk prostatacancer læsioner fra knoglemarv, lymfekirtel og knogle blev immunfarvet med SEPT9_i1 . Venstre paneler er lav (x100) forstørrelse (LM) (skala bar 100 um) og højre panel er høje (x200) forstørrelse (HM) (skala bar 50 um). Bemærk højt SEPT9_i1 farvning i alle metastaser.

Diskussion

Høje niveauer af SEPT9_i1 udtryk blev observeret i flere maligniteter, herunder leukæmi [20] og brystkræft [11]. I denne undersøgelse viste vi, at SEPT9_i1 proteinekspression signifikant associeret med Gleason score (figur 1 og 2 og tabel 2). Indtil disse dage, Gleason klassificering og lave systemet stadig en af ​​de mest magtfulde prognostiske faktorer for prostatakræft [21]. Vigtigst, blev en signifikant intens SEPT9_i1 farvning ses i metastaser af prostata-adenocarcinom til forskellige steder (Fig 3). Disse resultater antyder, at SEPT9_i1 proteinekspression tæt korreleret med tumor aggressivitet og progression. Tilsvarende Stanbery et al. viste, at høj SEPT9_i1 proteinekspression i hoved og hals pladecellecarcinomer blev forbundet med dårlige kliniske resultater [22]. Endvidere fandt de, at høj ekspression af SEPT9_i1 korreleret med både avanceret T og N stadium [22]. Kollektivt, disse kliniske data understøtter tidligere undersøgelser, der viser den rolle, SEPT9_i1 i onkogenese [15, 23-25].

Aktiv overvågning er en af ​​de accepterede fremgangsmåder anvendes til at reducere behandlingen af ​​patienter med prostatacancer lav risiko . Sådanne patienter overvåges med digital rektal fysisk undersøgelse, periodiske blod PSA vurderinger og gentag prostata biopsier, og i nogle af de seneste protokoller selektiv billeddannelse ved hjælp multiparametric endorectal MRI [26]. Behandlingen derefter tilbydes til dem med tegn på progression. Desværre, flere rapporter viser, at en væsentlig del (ca. 30%) af mænd med prostatakræft lav risiko er kategoriseret og har brug for at modtage øjeblikkelig definitiv behandling [27]. Men i øjeblikket er der ingen præcis model til at forudsige, hvilke af disse patienter med lav-risiko for sygdom skal behandles umiddelbart før de fremskridt under overvågning [28]. Da SEPT9_i1 proteinekspression er stærkt korreleret med tumorprogression og metastase, foreslår vi SEPT9_i1 som en ny markør, der kan skelne mellem lav risiko versus højere risiko prostatakræft for bedre patienternes valg i aktive overvågningsprogrammer. Selvfølgelig er yderligere undersøgelser berettiget til at teste denne hypotese.

En af begrænsningerne i vores undersøgelse er manglen på en langsigtet kliniske resultat for sammenligning med patologisk farvning intensitet SEPT9_i1. En anden begrænsning er den relativt lille antal patienter i vores kohorte, selv om det var tilstrækkeligt til at nå statistisk signifikans.

Konklusioner

Alt i alt vores data viser tydeligt, at SEPT9_i1 udtryk i prostatakræft er stærkt forbundet med den mest magtfulde patologiske prædiktiv faktor, Gleason score. Endvidere påvistes høje SEPT9_i1 ekspressionsniveauer i alle prostataadenokarcinomceller metastaser tyder på, at SEPT9_i1 har en rolle i tumorindtrængen og progression. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme anvendeligheden af ​​SEPT9_i1 immunfarvning i kliniske omgivelser.

Tak

Dette arbejde blev støttet af Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF).